Fiber-knob嵌合型溶瘤腺病毒對膠質瘤細胞的體外感染和殺傷活性分析

摘要： 針對惡性膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤， 患者的平均生存時間較短， 傳統治療方法難以實現根治， 而新興的溶瘤病毒療法存在擴散能力有限， 治療效果不理想等問題， 通過基因工程技術對人5型腺病毒（Ad5）衣殼蛋白進行修飾， 構建一種纖維蛋白頭節區（knob）嵌合替換型溶瘤腺病毒， 以提升其對膠質瘤細胞的感染和靶向能力. 利用來自B亞群Ad37的knob替換Ad5的knob， 證實其可利用唾液酸為受體， 從而增強對膠質瘤等CAR（coxsackievirus and adenovirus receptor）低表達腫瘤細胞的感染和殺傷能力， 并在體外模型中提升對血腦屏障的穿透效率， 為惡性膠質瘤的治療提供新的解決方案.

關鍵詞：" 惡性膠質瘤； 溶瘤腺病毒； 基因工程

中圖分類號：" Q789" 文獻標志碼： A" 文章編號： 1671-5489（2025）01-0201-06

Analysis of" in vitro Infection and Killing Activity of

Fiber-knob Chimeric Oncolytic Adenovirus on Glioma Cells

LIU Wenmo， WANG Lizheng， YU Bin， YU Xianghui

（School of Life Sciences， Jilin University， Changchun 130012， China）

Abstract：""" Based on the fact that glioblastoma multiforme is the most common malignant tumor in the brain，" an average survival time of" patients is relatively short，" and traditional treatment methods are difficult to achieve" cure. However， emerging oncolytic virotherapy has limited dissemination capability and" suboptimal treatment effects. By using genetic engineering technology to modify the capsid protein of human adenovirus type 5 （Ad5）， we constructed a chimeric oncolytic adenovirus with a fiber knob replacement to enhance its ability to infect and target" glioma cells. By replacing the" knob of Ad5 with the knob" of Ad37 from subgroup B Ad37， it was confirmed that it could utilize sialic acid as a receptor， thereby improving its ability to infect and kill tumor cells with low expression of" CAR （coxsackievirus and adenovirus receptor） such as glioma， and improving its penetration efficiency through the blood-brain barrier in in vitro models，" providing a new solution for the treatment of glioblastoma multiforme.

Keywords： glioblastoma multiforme; oncolytic adenovirus; genetic engineering

惡性膠質瘤（glioblastoma multiforme， GBM）是發病率最高的顱內惡性腫瘤， 目前患者的平均生存期通常不足15個月［1］. 由于其發生部位獨特， 生物學特征復雜， 傳統的治療手段如手術、 化療和放療難以對其實現根治. 近年來， 溶瘤病毒療法作為一種新興的惡性腫瘤治療策略備受關注. 2022年， 溶瘤單純皰疹病毒在日本被批準上市用于治療惡性膠質瘤［2-3］， 目前已有多個溶瘤病毒治療惡性膠質瘤的方案進入臨床研究階段， 所采用的溶瘤病毒包括腺病毒、 單純皰疹病毒、 呼腸孤病毒和脊髓灰質炎病毒等， 其中以腺病毒的應用最廣泛［4］.

目前臨床上使用溶瘤病毒治療膠質瘤一般通過手術在顱內腫瘤處直接注射溶瘤病毒， 雖然原位注射局部藥物濃度高， 但其擴散受限［5］. 對較大的腫瘤需多部位注射， 增加操作次數； 對易轉移、 容易多中心復發的惡性膠質瘤， 病毒難以有效擴散至轉移灶， 因此治療效果欠佳， 這也是目前溶瘤病毒治療膠質瘤普遍面臨的問題［6］. 若實現溶瘤腺病毒靜脈全身給藥， 需改變溶瘤腺病毒原本的感染性質， 使其具有血腦屏障及惡性膠質瘤的雙重靶向性.

溶瘤腺病毒多由人5型腺病毒（Ad5）經改造而成， 稱為條件復制型Ad5（CRAd5）［7］. Ad5感染細胞依賴于其纖維蛋白（fiber）和細胞表面柯薩奇-腺病毒受體（coxsackie and adenovirus receptor， CAR）的結合， 從而實現對細胞的感染［8］. 然而， CAR在膠質瘤細胞中的表達水平通常較低， 正常組織細胞顯著高于膠質瘤細胞的CAR表達量［9］. 這種特性導致溶瘤腺病毒在靶向感染膠質瘤細胞時效果不佳， 嚴重限制了其在惡性膠質瘤治療中的應用. 因此， 通過基因工程手段對溶瘤腺病毒衣殼進行遺傳修飾， 構建新的衣殼修飾型溶瘤腺病毒， 使其具有更適合應用于惡性膠質瘤治療的性質， 提升溶瘤腺病毒對惡性膠質瘤的治療效果.

由于不同亞群的腺病毒纖維蛋白序列和結構具有差異性， 因此來自不同亞群甚至不同型別的腺病毒感染所依賴的受體不同［10］. 其中來自B 亞群的Ad37可通過唾液酸作為受體感染細胞. 唾液酸是神經發育過程中發揮重要生物學功能的分子， 在腦內高豐度存在， 而且唾液酸的表達量和腫瘤的惡性程度正相關， 腫瘤惡性程度越高， 唾液酸表達越多［11-12］. 基于此， 本文通過使用Ad37 的knob 替換Ad5 的knob， 構建fiber-knob 替換型溶瘤腺病毒載體， 以使其具備用唾液酸作為感染受體的性質， 實現增強對膠質瘤細胞的感染性， 并在一定程度上提升溶瘤病毒靜脈給藥后對血腦屏障的靶向及穿透能力.

1 實 驗

1.1 唾液酸表達水平分析

細胞生長至對數生長階段， 用胰酶消化后， 用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞2次， 進行細胞計數， 取1×106個細胞進行后續實驗. 加入生物素標記的唾液酸抗體， 4 ℃孵育1 h后， 用預冷的PBS洗滌2次， 加入異硫氰酸熒光素（FITC）標記的鏈霉素， 4 ℃孵育30 min， 再用預冷的PBS洗滌2次， PBS重懸細胞， 流式細胞儀上機檢測.

1.2 病毒感染性檢測

用相同劑量感染細胞， 在感染16 h后， 用熒光顯微鏡觀察紅色熒光蛋白（RFP）的表達， 并在相同拍攝條件（如曝光、 曝光時間和激發光強等）下拍照. 成像后， 用不加乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化細胞， 利用流式細胞術分析RFP的熒光強度.

1.3 細胞活力檢測

采用噻唑藍（MTT）法測定細胞活力. 病毒以不同劑量感染細胞， 37 ℃培養72 h后， 加入MTT， 避光孵育4 h， 加入二甲基亞砜（DMSO）溶解藍色顆粒， 在490 nm處檢測吸收值. 細胞活力計算公式為

細胞活力=實驗組OD490-背景值對照組OD490-背景值×100%.

每種病毒每次感染劑量設置5個重復孔.

1.4 穿透血腦屏障能力分析

將hCMEC/D3細胞在0.4 mm PTFE Transwell腔中培養6～7 d， 用伏特/歐姆計測定細胞的跨膜電阻（TEER）， 分析細胞單層膜的完整性和功能. 當TEERgt;50 Ω/cm2時， 在該模型中評估溶瘤腺病毒跨hCMEC/D3細胞層的轉運能力. 將病毒加入Transwell細胞層上側培養基中， 37 ℃孵育4 h后， 檢測細胞層下側（基側）培養基中的病毒量.

1.5 體內靶向實驗

用18～20 g雌性Balb/c裸鼠建立模型. 小鼠先腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉劑（10 mg/mL生理鹽水）， 劑量為每10 g體質量給藥100 μL. 小鼠深度麻醉后， 固定在腦立體鏡上， 用手術刀使頭頂皮膚露出顱骨. 根據小鼠腦圖， 將U87細胞（5×105個細胞， 5 μL）注射到所需部位（x=+2.5 mm， y=+0.5 mm， z=-3.5 mm）. 縫合小鼠的傷口， 并注射青霉素以防止細菌感染. 腫瘤接種7 d后， 經尾靜脈注射1×1011 VPs（病毒顆粒數）溶瘤病毒. 5 d后， 通過小鼠腫瘤組織內溶瘤病毒RFP的表達進行活體成像， 分析溶瘤病毒的靶向作用.

1.6 數據分析與統計

用Graphpad進行數據制圖， 使用SPSS軟件進行統計分析. 采用T-test檢驗對兩組進行比較. 在對兩個或多個數據集的顯著性進行分析時， 采用單因素方差分析和Newman-Keuls檢驗. 當Plt;0.05時， 其組間差異有統計學意義.

2 結果與討論

2.1 唾液酸在腫瘤細胞中表達水平分析

為評價唾液酸在不同類型和種屬腫瘤細胞中的表達水平， 先分析膠質瘤、 肝癌和乳腺癌， 再分別選擇人腫瘤細胞和小鼠腫瘤細胞， 對各表面的唾液酸表達水平進行檢測， 結果如圖1所示. 由圖1可見， 人腫瘤細胞均顯著高于小鼠細胞中唾液酸的表達水平（***， Plt;0.001）， 為Ad5/K37溶瘤腺病毒的體內外評價提供了種屬提示.

2.2 Ad5/K37在不同腫瘤細胞中的感染性質分析

與Ad5相比， 為探究Ad5/K37對不同腫瘤細胞的感染性質是否發生改變， 分別評價10個不同的人腫瘤細胞系和5個小鼠腫瘤細胞系， 分別利用Ad5和Ad5/K37在相同感染滴度下感染細胞， 結果如圖2所示. 由圖2可見， 在10個不同人腫瘤細胞系中， 除A2780細胞外， Ad5/K37均能顯著提升對腫瘤細胞的感染性（*， Plt;0.05; **， Plt;0.01）， 尤其在膠質瘤細胞中， 對細胞的感染率提升了12.42倍. 在小鼠腫瘤細胞中， 與Ad5相比， Ad5/K37能顯著增加對細胞的感染能力， 最高提升4.75倍（圖2）. 表明通過knob37替換后得到的Ad5/K37在人腫瘤細胞和小鼠腫瘤細胞中均能顯著增加溶瘤腺病毒對腫瘤細胞的感染性.

2.3 體外殺傷活性評價

選擇6個不同人腫瘤細胞系， 分別利用Ad5和Ad5/K37的不同滴度感染細胞， 在感染72 h后檢測細胞活力， 結果如圖3和表1所示. 由圖3可見， 在不同腫瘤細胞中， Ad5/K37均具有顯著的殺傷活性， 如在膠質瘤U87細胞中， Ad5/K37顯著高于Ad5的殺傷效果， 通過計算EC50值（表1）可見， 達到EC50的Ad5/K37顯著低于Ad5的MOI值， Ad5組是Ad5/K37組EC50值的28.5倍， 進一步證明Ad5/K37增強了對腫瘤細胞的殺傷能力.

2.4 靶向能力評價

為確定Ad5/K37增強細胞感染性是否僅針對腫瘤細胞， 是否更有可能具有靶向感染腦部細胞的性質， 利用Ad5/K37在體外以相同的MOI感染人腎細胞（HEK293）、 人微血管內皮細胞（hCMECD/3）和膠質瘤細胞（U87）， 結果如圖4所示." 由圖4可見， Ad5/K37具有明顯的腦細胞靶向性， 可較好地感染hCMECD/3細胞和U87細胞. 此外， 用相同MOI的Ad5和Ad5/K37分別感染hCMECD/3細胞， 發現Ad5/K37對hCMECD/3的感染性顯著高于Ad5， 提高了21.13倍， 表明該修飾后的Ad5/K37能實現靶向感染腦部細胞的預期.

為進一步驗證該腦靶向效應是否可穿過血腦屏障， 利用hCMEC/D3細胞在體外建立血腦屏障模型. 當hCMEC/D3細胞生長到TEERgt;50 Ω/cm2時， 將病毒加入細胞培養基的上層孵育4 h. 收集下層培養基， 對下層穿透細胞屏障的病毒進行定量分析， 結果如圖5所示. 由圖5可見，" 病毒孵育4 h后， 血腦屏障細胞的電阻無明顯變化， 說明病毒并未破壞血腦屏障. 與Ad5相比， Ad5/K37在下層可檢測到更多病毒數， 說明Ad5/K37能增強其穿透血腦屏障的能力.

為評價Ad5/K37在體內對膠質瘤的靶向能力， 利用U87細胞系建立BALB/c裸鼠顱內荷瘤模型， 通過靜脈注射溶瘤腺病毒進行治療， 5 d后， 通過檢測病毒載量和病毒的RFP表達分析Ad5/K37穿透血腦屏障的能力和腫瘤靶向能力， 結果如圖6所示. 由圖6可見， Ad5/K37在顱內荷瘤小鼠模型中未提高穿透血腦屏障的能力， 由于Ad5/K37在小鼠各組織器官中的分布均少于Ad5， 因此， 在體內Ad5/K37可降低溶瘤腺病毒對正常組織器官的感染， 但未顯著提高血腦屏障穿透能力.

綜上所述， 通過對人5型溶瘤腺病毒knob區域進行嵌合替換， 改變溶瘤腺病毒的感染性， 顯著提升了溶瘤腺病毒對多種CAR低表達腫瘤細胞的感染能力， 顯著增強了對腫瘤細胞的殺傷活性， 并增強了對腦部細胞的感染性. 在體外血腦屏障模型中， Ad5/K37病毒可有效穿過血腦屏障. 在體內腦原位膠質瘤的靶向實驗中并未發現Ad5/K37能有效穿過血腦屏障而到達腫瘤部位， 這可能與種屬差異有關， 由于在小鼠模型中人腺病毒不能較好地實現腦組織靶向性， 因此將利用其他動物模型進一步分析評價Ad5/K37在體內的靶向性. 此外， 通過體內靶向實驗發現， Ad5/K37可減少病毒在體內其他臟器中的病毒富集量， 從而減少病毒的組織毒性， 有利于Ad5/K37在體內腫瘤治療的應用.

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（責任編輯： 單 凝）