高溫脅迫下金釵石斛花的生理及轉錄組響應分析

摘""要：金釵石斛具有較高的觀賞價值，是春石斛雜交品種群的重要親本之一，為探索金釵石斛花響應高溫脅迫的生理和分子機制，本研究結合水勢、細胞膜通透性監測、乙烯相關化合物含量測定，以及轉錄組學分析，以36"℃高溫脅迫5、10、24"h為處理組，常溫培養為對照組，研究36"℃下金釵石斛花的生理特性，分析其對高溫的響應轉錄組特征。結果表明：36"℃高溫脅迫在24"h內對金釵石斛花水分狀況和細胞膜通透性幾乎沒有影響，3個高溫處理組的金釵石斛花乙烯前體（ACC）含量與對照組（Dno-CK）相比均顯著增加；高溫處理5"h與常溫對照組（Dno-CK"vs"Dno-5h）、高溫處理10"h與常溫對照組（Dno-CK"vs"Dno-10h）、高溫處理24"h與常溫對照組（Dno-CK"vs"Dno-24h）3個比較組的差異基因分別為25"204、25"528、26"878個，上調表達與下調表達的基因量約為1∶1，隨著高溫脅迫時間的延長，金釵石斛花的差異表達的基因總數逐漸上升。KEGG富集分析結果表明，3個比較組差異基因均富集到單萜生物合成通路，說明高溫促進金釵石斛花揮發性萜類化合物的合成。GO功能富集分析結果表明，金釵石斛花受高溫脅迫大部分差異基因富集到遺傳信息處理途徑、代謝途徑相關的通路，在核苷酸切除修復、淀粉和蔗糖代謝、內質網中的蛋白質加工3條通路中差異基因數量最多，說明高溫激發金釵石斛花提高各類代謝活動響應熱脅迫。對差異表達基因中熱激蛋白基因（HSP）篩選發現，金釵石斛花的HSP基因大量上調表達響應高溫脅迫，金釵石斛花在24"h內響應高溫脅迫的HSP基因主要是HSP20基因，其次是HSP90基因。金釵石斛花的熱響應基因的進一步研究可針對HSP20基因和HSP90基因。本研究結果可為石斛耐熱育種研究提供參考，為耐高溫春石斛品系的培育提供理論支持。

關鍵詞：金釵石斛；高溫脅迫；生理特性；轉錄組分析；熱激蛋白中圖分類號：S567.239""""""文獻標志碼：A

Physiological"and"Transcriptome"Response"Analysis"of"Dendrobium"nobile"Flowers"under"High"Temperature"Stress

MENG"Hongxia1，2，"LI"Jiawei1，2*，"GONG"Jianying3，"WANG"Huaxin3

1."College"of"Forestry，"Guangxi"University"/"Guangxi"Key"Laboratory"of"Forest"Ecology"and"Conservation，"Nanning，"Guangxi""530004，"China;"2."State"Key"Laboratory"for"Conservation"and"Utilization"of"Subtropical"Agro-bioresources，"College"of"Forestry，"Guangxi"University，"Nanning，"Guangxi"530004，"China;"3."Guangxi"Forestry"Research"Institute，"Nanning，"Guangxi"530002，"China

Abstract："Dendrobium"nobile"has"a"high"ornamental"value"and"is"one"of"the"important"parental"plants"in"the"hybridization"group"of"Dendrobium."To"explore"the"physiological"and"molecular"mechanisms"of"D."nobile"flowers"in"response"to"high-temperature"stress，"this"study"combined"water"potential，"cell"membrane"permeability"monitoring，"ethylene-related"compound"content"determination，"and"transcriptome"analysis."Treatment"groups"were"subjected"to"36"℃"high-tempe rat ure"stress"for"5"h，"10"h"and"24"h，"with"a"normal"temperature"culture"as"the"control."The"physiological"characteristics"of""D."nobile"flowers"under"36"℃"and"the"transcriptome"response"to"high"temperature"were"studied."The"results"shoed"that"36"℃"high-temperature"stress"had"almost"no"effect"on"the"water"status"and"cell"membrane"permeability"of"D."nobile"flowers"within"24h."The"content"of"ethylene"precursor"（ACC）"in"the"flowers"significantly"increased"in"all"three"high-temperature"treatment"groups"compared"to"the"control"（Dno-CK）."The"number"of"differentially"expressed"genes"between"the"5"h"high-temperature"treatment"and"the"control"group"（Dno-CK"vs"Dno-5h），"the"10"h"high-temperature"treatment"and"the"control"（Dno-CK"vs"Dno-10h），"and"the"24"h"high-temperature"treatment"and"the"control"（Dno-CK"vs"Dno-24h）"was"25"204，"25"528"and"26"878，"respectively，"with"the"number"of"genes"up-and"downregulated"was"approximately"1∶1."As"the"duration"of"high-temperature"stress"increased，"the"total"number"of"differentially"expressed"genes"in"D."nobile"flowers"gradually"rose."KEGG"enrichment"analysis"showed"that"the"differential"genes"of"the"three"comparison"groups"were"enriched"tonbsp;the"monoterpene"biosynthesis"pathway，"indicating"that"high"temperature"promoted"the"synthesis"of"volatile"terpenoids"in"D."nobile."Functional"enrichment"analysis"indicated"that"most"of"the"differentially"ex-pressed"genes"in"response"to"high-temperature"stress"were"enriched"in"pathways"related"to"genetic"information"processing"and"metabolic"pathways，"with"the"highest"number"of"differential"genes"in"the"nucleotide"excision"repair，"starch"and"sucrose"metabolism，"and"protein"processing"in"the"endoplasmic"reticulum"pathways."This"suggests"that"high"temperature"stimulates"D."nobile"flowers"to"enhance"various"metabolic"activities"in"response"to"heat"stress."Screening"of"differentially"expressed"genes"revealed"that"heat"shock"protein"（HSP）"genes"in"D."nobile"flowers"were"significantly"up-regulated"in"response"to"high-temperature"stress."The"HSP"genes"responding"to"high-temperature"stress"within"24"h"in"D."nobile"flowers"were"primarily"the"HSP20"genes，"followed"by"the"HSP90"genes."Further"research"on"the"heat"re-sponse"genes"of"D."nobile"flowers"can"focus"on"the"HSP20"and"HSP90"genes."This"study"on"the"physiological"and"transcriptome"response"of"""""D."nobile"flowers"to"high-temperature"stress"would"provide"a"reference"for"heat-tolerant"breeding"research"and"theoretical"support"for"the"cultivation"of"heat-resistant"D."varieties.

Keywords："Dendrobium"nobile;"high"temperature"stress;"physiological"property;"transcriptome"analysis;"heat"shock"protein

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.02.003

蘭科石斛屬（Dendrobium）園藝種是盆花與切花中的名貴類群，可分為春石斛和秋石斛兩類雜交品種群。春石斛是以原產于東亞低緯度高海拔地區的落葉種類為親本，主要親本包括原產于中國的金釵石斛（D."nobile）。金釵石斛性喜溫暖濕潤，生于山地林中樹干上或山谷巖石上，目前在中國廣西、湖北、貴州、云南、西藏等地區均有分布[1]。花香可以增強觀賞植物的美學特性，在植物的繁殖過程中起著重要作用，金釵石斛花香輕清，具有較高觀賞價值的同時還可以用于鎮靜解郁、抗炎等[2]。金釵石斛生境的特殊性導致其生長發育容易受到各種環境因子的影響，高溫便是其中之一。目前針對植物高溫脅迫的研究主要集中在植物營養器官的形態、生理生化特性、光合作用與呼吸作用、分子調節機制等方面[3]，對于花器官的直接關注較少。

植物水分生理狀態可以通過植物器官的水勢直接反映，植物在面臨脅迫時水勢變化較為敏感，大部分植物通過降低水勢應對脅迫，如景天植物在低鹽與高鹽脅迫下葉片水勢均呈下降趨勢[4]，新疆大葉苜蓿在輕度與重度水分脅迫下葉片水勢均呈下降趨勢[5]。也有部分植物如豬毛菜采用升高葉水勢的方式適應脅迫環境[6]。高溫脅迫會導致細胞膜受損，內穩態失衡，電導率可以在一定程度上反映其受損程度。一般情況下，耐熱性強的植株細胞膜穩定性高于耐熱性差的植株，植物遭受溫度脅迫的程度與電導率大小呈正比關系[7-8]。氣態植物激素乙烯參與植物對脅迫環境的響應，如40"℃高溫脅迫下黑油冬白菜在48"h內乙烯含量呈直線上升狀態[9]。乙烯的合成主要由2種特定的酶促過程完成，ACC合酶（ACS）將底物轉化為ACC后，氧化酶（ACO）將ACC轉化為乙烯，研究表明，ACC（乙烯前體）預處理可以提高擬南芥在40"℃下的存活率，減少氧化損傷，并誘導其耐熱性[10-11]。

高溫脅迫啟動各種代謝途徑，目前已有大量與響應高溫脅迫高度相關的途徑被鑒別，如谷胱甘肽代謝途徑（glutathione"metabolism"pathways）、光合作用-天線蛋白代謝通路（photosyn thetic-an t enna"protein"metabolism"pathway）、葉綠素代謝通路（the"chlorophyll"metabolism"pathway）、碳代謝途徑（carbon"metabolic"pathways）、單萜類生物合成（monoterpene"class"biosynthesis）等[12-15]。處于高溫脅迫的植物通過各種熱響應基因的表達適應脅迫環境，近年研究發現，熱激蛋白（heat"shock"proteins，"HSP）在植物遭受高溫脅迫過程中大量表達，如火龍果在40"℃高溫脅迫下處理5"h后HSP21基因開始大量上調表達[16]。月季RcHSP18.1基因常溫下不表達，受到46"℃高溫脅迫2.5"h內大量表達[17]。三棱蝦脊蘭在高溫脅迫后的差異基因中鑒定到XTH、HSP等基因家族，且脅迫后HSP20、HSP40和HSP70基因全部上調表達[18]。在42"℃高溫脅迫處理6"h內，黃瓜HSP20、HSP70和HSP90基因也全部上調表達[19]。高溫脅迫會導致生物體中的蛋白質變性，HSP作為分子伴侶，協助蛋白質復性、穩定、細胞內轉運和降解，防止受損蛋白質的積累，維持細胞內環境的穩定性[20-21]。

前人針對石斛高溫脅迫分子機制的相關研究表明，翅萼石斛花在40"℃高溫脅迫3"h后有82個HSP基因明顯上調表達[22]；鐵皮石斛經歷35"℃高溫脅迫后，與跨膜轉運功能相關的基因均下調表達，推測高溫脅迫會降低石斛的質膜轉運能力[23]；40"℃高溫脅迫1"h后，鼓槌石斛花中表達量最高的10個基因均為HSP基因[24]。目前有關金釵石斛高溫脅迫轉錄組響應分析的相關研究較少，基于前人對石斛屬植物高溫脅迫的研究，本研究以金釵石斛作為試驗材料，常溫下的植株作為對照組，利用人工氣候箱進行36"℃高溫處理5、10、24"h，利用RNA-seq技術對處理后的金釵石斛花被進行轉錄組測序，利用液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）法測定花被乙烯類激素含量，同時測定水勢、電導率參數。通過解讀金釵石斛高溫脅迫生理響應及轉錄組響應，以期為金釵石斛的耐高溫品種選育提供科學依據。

1""材料與方法

1.1""材料

供試材料為金釵石斛（圖1），采自廣西壯族自治區林業科學研究院，于花期（2024年4月）選取長勢一致且健康的12株石斛進行試驗。高溫處理：在花朵完全展開時將植株放入人工氣候箱，設置36"℃高溫5"h（Dno-5h）、10"h（Dno-10h）、24"h（Dno-24h）3組處理，光照12"h/d。常溫培養（24～26"℃）的金釵石斛植株作為對照（Dno-CK），每個處理3株金釵石斛。各處理結束后采集花朵的花瓣放入50"mL離心管中，液氮速凍6～8"min，于?80"℃冰箱中保存，用于后續轉錄組測序及乙烯類激素含量測定。

1.2""方法

1.2.1""花朵水勢及電導率測定""對照組（Dno-"CK）采集常溫下的花朵，高溫處理組（Dno-5h、Dno-10h、Dno-24h）在處理結束后將植株拿出人工氣候箱后，迅速采集測定。花朵水勢采用壓力勢水勢儀（PMS，"Corvallis，Oregon，USA）測定，花朵電導率采用電導率儀（DDSJ-319L型）測定，每個處理在3株金釵石斛上各自采集1朵花朵測定。

1.2.2""乙烯類激素含量測定""采用液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS）測定，研磨Dno-CK、Dno-5h、Dno-10h、Dno-24h四個處理的樣品后加入內標混合溶液、提取劑，離心后80%甲醇溶液復溶，過濾，置于樣瓶里。設置液相條件和質譜條件提取代謝物采集質譜數據，采用Analyst"1.6.3軟件和MultiQuant"3.0.3軟件處理質譜數據，繪制激素的標準曲線并計算其含量。

1.2.3""轉錄組測序""（1）RNA提取、cDNA文庫構建及測序。采用乙醇沉淀法和CTAB-"PBIOZOL提取試驗樣本總RNA，使用Qubit熒光定量儀和Qsep400高通量生物片段分析儀對總RNA進行鑒定和定量。cDNA文庫構建步驟主要包括：富集mRNA，以小片段mRNA為模板反轉錄生成第一鏈cDNA并合成第二鏈cDNA，對雙鏈cDNA進行測序接頭連接后獲取250～350"bp的插入片段的文庫，經PCR擴增后構建完成文庫。庫檢合格后進行Illumina測序。

（2）轉錄組數據處理。使用fastp對原始數據進行過濾得到clean"reads，轉錄本組裝使用Trinity軟件完成，聚類去冗余由Corset軟件完成。利用DIAMOND軟件在KEGG、NR、Swiss-Prot、GO、COG/KOG、Trembl數據庫中對去冗余后的轉錄本序列進行注釋分析。

（3）差異表達基因分析。使用RSEM軟件計算轉錄本的FPKM值，以此定量基因表達水平。使用DESeq"2分析Dno-CK"vs"Dno-5h、Dno-CK"vs"Dno-10h、Dno-CK"vs"Dno-24h三組之間的差異表達基因（DEGs），差異基因的篩選條件為|log2"（Fold"Change）|≥1，且FDRlt;0.05。基于超幾何檢驗進行富集分析，KEGG富集分析以Pathway為單位進行超幾何分布檢驗，GO富集分析則基于GO-term進行。

1.2.4""揮發性成分分析""采用HS-SPME-GC-MS進行揮發性成分分析。選擇3株生長良好的金釵石斛于盛花期采集花朵，每株采集2朵花，保存于?80"℃冰箱中。樣品進行液氮研磨，每個樣本稱取約500"mg于頂空瓶中，加入飽和NaCl溶液和20"μL內標溶液，設置HS-SPME萃取條件、色譜條件和質譜條件，進行樣本萃取及GC-MS分析。通過MassHunter軟件處理質譜分析后的原始數據，對樣本的代謝物進行質譜定性定量分析，根據離子流峰面積歸一化法計算各組分在總揮發物中的相對含量。

1.3""數據處理

使用Excel"2016軟件處理數據，使用SPSS"26.0軟件評估差異的顯著性，使用Origin"2021軟

件制圖。

2""結果與分析

2.1""高溫脅迫下金釵石斛花朵生理響應

在電導率方面，3個高溫組處理的花朵電導率與對照組基本一致，保持在4.29～4.95"μs/cm，無顯著性差異（圖2A），說明36"℃高溫脅迫在24"h內對金釵石斛花朵細胞膜幾乎無影響。在水勢方面，3個高溫組處理的花水勢基本一致，保持在?1.36～?1.34"MPa，與對照組相比略有降低但無顯著性差異（圖2B），說明36"℃高溫脅迫在24"h內對金釵石斛花朵水勢的影響不大。乙烯前體（ACC）含量，與Dno-CK相比，Dno-5h增加了76.9%，差異顯著；Dno-10h增加了17.9%，差異顯著；Dno-24h增加了92.9%，差異顯著。金釵石斛在36"℃高溫脅迫24"h時ACC變化量達到最高，增長量最低點則在脅迫10"h時（圖2C）。

2.2""測序數據質量評估

本研究對4個處理結束后的金釵石斛花朵進行轉錄組測序，得到12組金釵石斛花朵的原始數據和質控數據（表1）。其中，過濾后獲得的clean"reads量共102.17"Gb，占原始數據（raw"reads）的98.01%以上。12組金釵石斛花朵的GC含量均大于45%，Q30堿基百分比保持在95%以上，Q20堿基百分比則保持在98%以上。表明本試驗的轉錄組測序質量較好，能滿足基因功能注釋和分析要求。

2.3""差異表達基因篩選和分析

3個高溫處理組與對照組Dno-CK差異表達基因的篩選結果顯示（圖3），金釵石斛經過5"h的36"℃高溫脅迫后共差異表達25"204個基因，包括11"703個上調表達基因和13"501個下調表達基因；經過10"h的36"℃高溫脅迫后共差異表達25"528個基因，表達上調和下調的差異基因分別為12"532個和12"996個；在24"h的36"℃高溫脅迫后，金釵石斛差異表達的基因總數有26"878個，包括13"876個上調表達基因和13"002個下調表達基因。隨著高溫脅迫時間的延長，金釵石斛差異表達的基因總數逐漸上升。與5"h相比，10"h高溫脅迫多了324個差異表達基因，而經過24"h高溫脅迫的金釵石斛比Dno-5h、Dno-10h分別多了1674個、1350個差異表達基因。說明金釵石斛遭受高溫脅迫5"h后差異基因數量有較大程度上升，且在熱處理24"h的差異基因數量保持持續增長的狀態。

2.4""差異表達基因KEGG分析

對高溫處理組與對照組的差異表達基因進行KEGG信號通路富集分析（圖4），結果表明，Dno-"CK"vs"Dno-5h組富集最顯著的20條通路中差異基因數量排名前5的通路主要包括剪接體（ko03040）、內質網中的蛋白質加工（ko04141）、RNA聚合酶（ko03020）、核苷酸切除修復（ko03420）、淀粉和蔗糖代謝（ko00500）；Dno-CK"vs"Dno-10h組富集的通路主要包括內質網中的蛋白質加工（ko04141）、淀粉和蔗糖代謝（ko00500）、植物激素信號轉導（ko04075）、剪接體（ko03040）、次生代謝物的生物合成（ko01110）；Dno-CK"vs"Dno-24h組富集的通路主要包括次生代謝物的生物合成（ko01110）、淀粉和蔗糖代謝（ko00500）、植物激素信號轉導（ko04075）、內質網中的蛋白質加工（ko04141）、核苷酸切除修復（ko03420）。

此外，Dno-CK"vs"Dno-5h、Dno-CK"vs"Dno-"10h、Dno-CK"vs"Dno-24h三組中差異表達基因顯著富集的相同通路有8個，分別是歸屬于遺傳信息處理過程的內質網中的蛋白質加工（ko04141）、核苷酸切除修復（ko03420）通路；歸屬于代謝過程的角質、木栓質和蠟生物合成（ko00073）、牛磺酸和低牛磺酸的代謝（ko00430）、氰氨基酸代紅色方框代表3個比較組合差異表達基因顯著富集的相同通路。

謝（ko00460）、淀粉和蔗糖代謝（ko00500）、脂肪酸降解（ko00071）、單萜生物合成（ko00902）通路。說明金釵石斛在經高溫脅迫5～24"h的過程中，遺傳信息處理途徑和代謝途徑發生了較大變化，其中內質網中的蛋白質加工（ko04141）、核苷酸切除修復（ko03420）、淀粉和蔗糖代謝（ko00500）3條通路富集程度較顯著，且差異基因數量較多，說明這3條信號通路可能在金釵石斛響應高溫脅迫上具有重要作用。

2.5""差異表達基因GO富集分析

對高溫處理組與對照組的差異表達基因進行GO富集分析（圖5）發現，Dno-CK"vs"Dno-5h組的差異表達基因GO富集有14"696個基因，Dno-CK"vs"Dno-10h組有14"865個基因，Dno-CK"vs"Dno-24h組有15"654個基因。分別取3組富集最顯著的9個GO"term進行分析，結果表明，Dno-CK"vs"Dno-5h組的差異表達基因主要富集于2-羥戊二酸依賴性雙加氧酶活性、伴侶蛋白結合、綠葉揮發性物質生物合成過程、sm樣蛋白家族復合物、二十碳烷酸代謝過程、解剖結構形態發生的調控、剪接體snRNP復合物、細胞對熱的響應和生長素穩態。Dno-CK"vs"Dno-10h組的差異表達基因主要富集于果膠分解代謝過程、酶抑制劑活性、伴侶蛋白結合、綠葉揮發性物質生物合成過程、二十碳烷酸代謝過程、天冬氨酸酯酶活性、L-甲硫氨酸從甲基硫代腺苷的回收、氨基酸回收和L-甲硫氨酸回收。Dno-CK"vs"Dno-24h組的差異表達基因主要富集于氧化還原酶活性、綠葉揮發性物質生物合成過程、黃酮類生物合成過程、外肽酶活性、絲氨酸型外肽酶活性、絲氨酸型羧基肽酶活性、羧肽酶活性、二十碳烷酸代謝過程和脂氧酶途徑。此外，Dno-CK"vs"Dno-5h、Dno-CK"vs"Dno-10h、Dno-CK"vs"Dno-24h三組中差異表達基因顯著富集的相同通路為綠葉揮發性物質生物合成過程和二十碳烷酸代謝過程。

2.6""熱激蛋白基因分析

熱激蛋白（heat"shock"proteins，"HSP）是在高溫下合成的重要蛋白質，已被證明參與對環境壓力的各種反應并調節許多發育過程。在高溫處理組與對照組的差異表達基因功能注釋列表中篩選紅色方框代表3個比較組合差異表達基因顯著富集的相同通路。

熱激蛋白表達相關基因，結果表明（附表1），Dno-CK"vs"Dno-5h組差異表達基因中有71個上調表達的熱激蛋白基因（48個HSP20基因，23個HSP90基因）和8個下調表達的熱激蛋白基因（4個HSP20基因，4個HSP90基因）；Dno-CK"vs"Dno-10h組差異表達基因中有78個上調表達的熱激蛋白基因（49個HSP20基因，1個HSP70基因，28個HSP90基因）和9個下調表達的熱激蛋白基因（7個HSP20基因，2個HSP90基因）；Dno-CK"vs"Dno-24h組差異表達基因中有69個上調表達的熱激蛋白基因（41個HSP20基因，28個HSP90基因）和6個下調表達的熱激蛋白基因（5個HSP20基因，1個HSP90基因）。說明金釵石斛熱激蛋白基因大量上調表達響應高溫脅迫且表達的熱激蛋白基因以HSP20為主。

對Dno-CK"vs"Dno-5h、Dno-CK"vs"Dno-10h、Dno-CK"vs"Dno-24h三組中共同上調表達的49個熱激蛋白基因進行分析，結果如圖6所示。有28個基因在5～24"h的高溫脅迫處理下表達量呈下降趨勢（圖6A）；有12個基因在5～10"h的表達量呈上升趨勢，10～24"h的表達量呈下降趨勢，10"h的表達量最高（圖6B），而余下9個基因趨勢與其相反，在10"h的表達量最低（圖6C）。這49個熱激蛋白基因由33個HSP20基因和16個HSP90基因組成。此外，Cluster-61924.7（HSP90基因）的表達量在3個高溫脅迫處理中明顯高于其余48個基因，在Dno-CK"vs"Dno-5h組中的表達量為其余基因的1.17～8.63倍，在Dno-CK"vs"Dno-10h組中的表達量為1.82～15.28倍，在Dno-CK"vs"Dno-24h組中的表達量為1.81～14.19倍。推測金釵石斛的Cluster-61924.7在響應高溫脅迫過程中發揮重要作用。

2.7""金釵石斛花朵揮發性成分分析

對金釵石斛盛花期的花朵揮發性成分進行鑒定，共檢測出1480種揮發性物質，其中，萜類化合物的種類最多（296種），占總量的20%，其次為酯類（266種），占總量的18%，其余主要成分包括酮類、醇類、雜環化合物、醛類等（圖7A）。揮發性成分相對含量較高的化合物為雜環化合物、脂類、萜類、酮類，分別達到271.74、271.67、267.39、266.06"μg/g（圖7B）。對金釵石斛花中的揮發性萜類化合物進行分析，共有21種成分對花香具有貢獻（圖7C、圖7D），其中2，6-二甲基-7-辛烯-2-醇和3，7-二甲基-1，3，7-辛三烯的貢獻最大，"其相對含量分別為0.91、0.45"μg/g。

3""討論

短期高溫脅迫會對植物基因表達、生理活動、植株形態等造成一定的影響，為了生存和適應高溫的逆境，植物在進化過程中發展出了復雜的自我防御機制。一般情況下，植物組織通過升高或降低水勢響應脅迫環境，其水勢與吸水能力成反比關系，金釵石斛在面臨干旱脅迫時，葉片通過升高水勢延遲脫水來應對干旱環境[25]。本研究發現高溫處理下的花朵水勢與常溫對照組相比略有降低但無顯著性差異，說明36"℃高溫脅迫在24"h內對金釵石斛花朵水分狀況影響不高。同一高溫脅迫下不同種金線蓮葉片電導率趨勢不同，福建金線蓮于脅迫的第2天電導率顯著下降，第6天顯著上升，而臺灣金線蓮葉片在高溫脅迫6"d的電導率與對照組相比無顯著性差異，這與大部分研究高溫脅迫與電導率關系的結果不完全一致[26]。本研究中4個處理下的金釵石斛花朵電導率均無顯著性差異，與臺灣金線蓮葉片電導率的變化情況相似，說明金釵石斛對36"℃高溫脅迫具有較強的適應能力，此溫度處理對其細胞膜通透性幾乎沒有影響。趙暉等[27]研究表明在高溫脅迫下杜鵑花葉片乙烯釋放速率增高且乙烯合成相關酶活性升高，本研究中3個高溫處理組的金釵石斛花乙烯前體（ACC）含量與對照組Dno-CK相比均顯著增加，這與趙暉等的研究結果相似。

本研究利用轉錄組測序篩選出Dno-CK"vs"Dno-5h、Dno-CK"vs"Dno-10h、Dno-CK"vs"Dno-24h三個比較組的差異基因分別為25"204、25"528、26"878個，上調表達與下調表達的基因量約為1∶1，這些基因可以作為后續研究與金釵石斛響應高溫脅迫密切相關基因的候選基因。隨著高溫脅迫時間的延長，金釵石斛差異表達的基因總數逐漸上升。這與程秋如等[28]低溫脅迫處理油棕的研究結果一致，說明植物通過激活大量基因表達響應溫度脅迫。本研究前期對常溫狀態下金釵石斛進行揮發性成分分析發現，萜類化合物的種類及相對含量均較高，賦花香的主要成分為2，6-二甲基-7-辛烯-2-醇、3，7-二甲基-1，3，7-辛三烯。對差異基因進行KEGG功能富集分析發現，Dno-CK"vs"Dno-5h、Dno-CK"vs"Dno-10h、Dno-CK"vs"Dno-24h三個比較組差異基因均富集到單萜生物合成通路，說明高溫促進金釵石斛花揮發性萜類化合物的合成。對差異基因進行GO功能富集分析發現，金釵石斛受高溫脅迫大部分差異基因富集到遺傳信息處理途徑、代謝途徑相關的通路，在核苷酸切除修復、淀粉和蔗糖代謝、內質網中的蛋白質加工3條通路中差異基因數量最多。說明高溫激發金釵石斛提高各類代謝活動響應熱脅迫，這與菜心、茶樹等植物受高溫脅迫后差異基因富集結果一致[29-30]。

熱激蛋白是植物在溫度脅迫下產生的一類保護性蛋白質，高度保守并存在于幾乎所有生物體中，參與許多生長發育過程并對逆境脅迫做出反應[31]。對差異表達基因中HSP基因的篩選發現，金釵石斛熱激蛋白基因大量上調表達，響應高溫脅迫，Dno-CK"vs"Dno-5h、Dno-CK"vs"Dno-10h、Dno-CK"vs"Dno-24h三組中共同上調表達的49個熱激蛋白基因由33個HSP20基因和16個HSP90基因組成。這說明金釵石斛在24"h內響應高溫脅迫的HSP基因主要是HSP20基因，其次是HSP90基因。研究表明，HSP20是植物中最大的HSP家族，HSP20蛋白是許多高等植物中高溫脅迫誘導的最豐富的蛋白質，HSP20基因在植物的非生物脅迫中起著關鍵作用[32]；HSP90基因與植物脅迫信號轉導、受體折疊、轉錄因子和激酶以及輔助細胞在脅迫下的存活有關[33-35]。共同上調表達的HSP基因大部分在5"h的表達量最高，5～24"h的表達量呈下降趨勢。這與朱白婢等[36]研究高溫處理后冬瓜耐熱基因在0～4"h的表達模式相同，熱響應基因在高溫脅迫短時間內迅速表達，植物適應高溫后開始逐漸下降。金釵石斛熱響應基因的進一步研究可針對HSP20基因和HSP90基因進行，本研究對金釵石斛高溫脅迫轉錄組響應的分析可為石斛耐熱育種研究提供參考。

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