新疆不同連作年限棉田土壤健康評價

摘要： 【目的】從土壤性質和微生物群落結構評價新疆地區連作棉花土壤的健康狀況，為該區棉花連作生態防治和土壤健康管理提供科學依據。【方法】采集了新疆喀什地區伽師縣連作年限在 5、7、12、20、25、30 年的棉田土壤樣品，分析土壤理化性質、胞外酶活性、微生物群落組成和真菌病原體豐度，運用主成分分析法構建最小數據集，以土壤健康指數面積法（SHI-area） 評估土壤健康狀況，并探討植物病原體與土壤健康之間的關聯性。【結果】隨著連作年限的增加，棉田土壤電導率和鹽度呈升高趨勢，微量元素鐵和錳以及與碳、氮和磷循環相關的β-葡萄糖苷酶、纖維二糖水解酶、亮氨酸氨基肽酶和堿性磷酸酶活性隨著連作年限的增加而增加。土壤微生物多樣性受連作年限的顯著影響，其中在連作7 年的棉田土壤微生物α 多樣性較低。經主成分分析篩選，得到全氮、β-葡萄糖苷酶、有效錳、鹽度和真菌α 多樣性（Simpson 指數） 5 個指標為土壤健康評價的最小數據集。基于該數據集計算得到的土壤健康指數，隨連作年限的增加呈先下降（SHIY7=0.07） 再逐漸恢復的趨勢，在20 年恢復到最高點（SHIY20=0.53），但沒有超過連作5 年時的水平（SHIY5=0.58）。植物真菌病原體豐度與最小數據集計算的土壤健康指數之間呈顯著負相關（y=?0.0727x+0.561，R2=0.46，P=0.002）。相關分析表明，全氮含量是影響植物病原體豐度的極顯著因素（R=?0.912，Plt;0.001），真菌優勢屬Pseudogymnoascus、Gymnoascus 和Canariomyces 豐度與土壤健康指數呈顯著負相關性（Rlt;?0.612，Plt;0.01）。【結論】土壤健康指數在連作初期不斷下降，之后雖然有所恢復，但仍未達到連作5 年的水平。土壤全氮、鹽度、有效錳、β-葡萄糖苷酶和真菌多樣性是評價土壤健康狀況的關鍵指標。植物病原體數量受全氮的抑制而降低，全氮含量隨著連作年限的增加，是土壤健康指數恢復性提升的最顯著影響因子。電導率和鹽度的不斷提升也是需要關注并檢測的一個指標。

關鍵詞： 棉花連作；土壤養分；胞外酶活性；微生物群落；土壤健康指數

棉花作為重要的經濟作物，在全球范圍內廣泛種植。得益于其優越的光熱和適宜的土壤條件，新疆地區近年來一直是我國棉花的主產區，2021 年棉花種植面積達2 5 0 6 . 1 萬h m 2，產量約占全國的90%[1?2]。然而，隨著集約化管理和長期連作種植面積的不斷擴大，部分地區出現了土壤肥力下降、土壤環境惡化的現象，導致棉花出現病害問題，造成其產量和品質的下降，嚴重影響了棉花產業的長期可持續性發展[3?5]。因此，研究長期連作對土壤微生物群落組成和土壤健康狀況的影響，對棉田的可持續管理具有重要意義。

長期連作引起土壤微環境的變化是導致土壤肥力和健康狀況下降的主要原因[6]。玉蘇甫等[7]發現，棉花連作15 年后土壤有機質（SOM） 呈增加趨勢，土壤全氮（TN） 含量達到最大值，而連作25 年后則呈現下降趨勢。貢璐等[8]研究指出，連作10～15 年棉花農田SOM 及養分顯著提高；而短期連作農田SOM、TN 和有效磷（AP） 含量有所增加，而連作15 年后則迅速下降[9]。研究發現連作棉田中微量元素，如有效鐵（Fe）、有效錳（Mn）、有效銅（Cu） 和有效鋅（Zn） 的含量在連作5 年時最高，以后隨著連作年限的增加呈下降的趨勢[10]。對連作甜瓜農田的研究發現，土壤質量指數與土壤多功能性隨著連作年限的增加均呈現先下降后上升的趨勢[11]。另一方面，土壤作為一個動態的生態系統，土壤微生物在維持土壤功能的可持續性方面發揮著至關重要的作用，也通常被認為是表征土壤健康的敏感性指標[12]。研究指出，隨著棉田連作年限的增加，土壤中真菌數量增加，細菌數量減少[13]。另外，植物病原體的存在也會影響土壤健康[14]。盡管針對棉花連作對土壤環境的影響已有大量研究報道[7?10]，但對長期不同連作年限土壤養分和微生物群落特征與土壤健康狀況的關系仍有待深入研究。此外，基于最小數據集（minimum data set，MDS）的土壤健康指數（soil health index，SHI） 是一種簡化而高效的評估工具，廣泛用于評估和比較不同農業生產系統和土壤退化程度[15?16]，土壤管理措施也應根據對土壤健康影響較大的關鍵屬性（即MDS） 進行調整，以實現土壤改良[17]。此外，有研究指出，在不同地區評估土壤健康或質量時，MDS 存在差異，因此，土壤健康應根據區域特點進行評估[18]。

為探究棉花長期連作下土壤性質、胞外酶活性和土壤微生物群落結構的變化，并構建最小數據集評價土壤健康狀況，本研究在田間調研基礎上，采集了新疆伽師縣不同連作年限的棉田土壤樣品，分析了土壤養分狀況、中微量元素含量和碳氮磷循環的胞外酶活性變化，并通過擴增子技術測定了土壤細菌和真菌群落組成和結構，同時使用FUNGuild 數據庫解析真菌功能類別，探討植物病原體（plantpathogen） 與土壤健康之間的關系，以期為區域農田土壤健康和產能提升提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

研究區位于新疆維吾爾自治區喀什地區伽師縣（39°29′32″N，76°44′12″E），該地區屬于溫帶大陸性干旱氣候，土壤類型為灰漠土和灌淤土，土壤質地為粘壤土。該地區年平均降雨量64.6 mm，年均蒸發量2051.5 mm，年平均氣溫11.7℃。全年日照時數2923.7 h，無霜期平均在233 天左右。2023 年7 月開始田間調研與采樣，根據田間調研結果，選擇連作年限為5 年（Y5）、7 年（Y7）、12 年（Y12）、20 年（Y20）、25 年（Y25） 和30 年（Y30） 棉田，棉花前茬作物主要為小麥或者玉米，各地塊按照當地農業技術規范進行施肥和灌溉。在棉花成熟期，采集田間土壤樣品，具體點位如圖1 所示。

1.2 土壤樣品采集與分析

在每個連作年限采樣點選擇3 塊樣地，樣地之間距離在30 m 以上。在每個樣地設置3 個1 m×1 m 的樣方，各樣方按“S”形采集表層土壤樣品，隨后將3 個樣方的樣品均勻混合。將采集的0—20 cm表層土壤新鮮樣品用干冰處理運送到實驗室，挑去可見的動植物殘體、石礫等雜質后將其分成3 部分：一部分過2 mm 篩后儲存在4℃ 冰箱，用于胞外酶活性等指標的測定；另一部分過2 mm 篩后儲存在?80℃ 超低溫冰箱，用于土壤微生物DNA 的提取和高通量測序；剩余部分土樣自然風干后過0.15 mm篩，用于土壤有機碳（SOC）、全氮（TN）、有效磷（AP）及中微量元素等性質的測定。

土壤電導率（EC） 和鹽度（salinity） 采用一體檢測儀（TR-8D，北京順科達） 在樣地采樣時測定。SOC和TN 含量使用元素分析儀（EA3000，意大利米蘭）測定。AP 采用0.5 mol/L 的NaHCO3 提取—分光光度計測定[ 1 9 ]。土壤pH 值采用電位法，土水比為1∶2.5 （w/v）[20]。土壤交換性鈣（Ca） 和鎂（Mg） 采用1 mol/L 乙酸銨浸提—原子吸收分光光度法測定[21]。土壤有效態Fe、Mn、Cu 和Zn 采用DTPA 浸提—原子吸收分光光度法測定。

胞外酶活性采用熒光微板法[22]測定，包括與碳循環相關的β-葡萄糖苷酶（BG） 和纖維二糖水解酶（CB），與氮循環相關的亮氨酸氨基肽酶（LAP） 和N-乙酰葡萄糖苷酶（NAG），與磷循環相關的堿性磷酸酶（ALP），以及與木質素氧化相關的多酚氧化酶（PPO） 和過氧化物酶（PER）。使用96 微孔酶標板，在多功能酶標儀（Synergy H1M，BioTek，美國） 激發波長365 nm、發射波長450 nm 的條件下測定。

1.3 土壤DNA 提取、測序和處理

稱取0.5 g 土壤，用試劑盒Soil DNA ExtractionCZ Kit （FINDROP，中國廣州） 提取土壤微生物DNA，將純化后的DNA 進行擴增。細菌的引物是520F 和802R，真菌的引物是ITS1F 和ITS2R。PCR 反應條件如下：98℃ 預變性30 s，98℃ 變性30 s，50℃ 退火30 s，72℃ 延伸30 s，27 個循環；72℃ 保溫5 min，在4℃ 下保存[23]。基因文庫的構建和上機測序由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。測序完成后，分別使用SILVA v138 和UNITEv8.0 數據庫對細菌和真菌的ASVs 進行生物學注釋分類。使用FUNGuild v1.0 數據庫根據營養方式對真菌群落的功能群進行分類[24]，其中具有“Pathotroph”營養方式和“Plant Pathogen”群落的ASVs 被認定為潛在的植物病原體。

1.4 指標篩選和評價方法

對指標進行主成分分析，提取出特征值≥1 且方差貢獻率gt;10% 的主成分[11]。選取高因子載荷指標，即因子絕對載荷值為該主成分中最大因子絕對載荷值90% 以上的指標。當一個主成分中僅有一個高因子載荷指標時，該指標進入最小數據集（MDS）。當一個主成分高因子載荷指標有多個時，若指標間皮爾遜相關系數較低，各高因子載荷指標均被選入MDS；若指標相關系數≥0.60，選擇具有最高絕對載荷值的指標[25?26]。在主成分分析過程中，通過方差最大化旋轉（varimax rotation） 來增強不相關成分的解釋性[27]。

基于篩選得到MDS，利用土壤健康指數面積法（SHI-area），計算不同連作年限下MDS 指標形成的雷達圖的面積來評估不同連作年限下的SHI[28]。土壤健康指標的標準化公式如下：

1.5 數據統計與分析

使用幾何平均值指數（geometric mean，GMeanindex） 對胞外酶活性進行評估，該指數可用于評估土壤微生物功能多樣性[30]。具體公式如下：

使用單因素方差分析（one-way ANOVA） 比較不同連作年限棉田土壤指標間的差異，并采用Duncan檢驗。采用QIIME2 軟件計算土壤中細菌和真菌的α 多樣性，包括Shannon 和Simpson 指數。微生物β 多樣性采用基于Bray-Curtis 相似性矩陣的PCoA分析，并用PERMANOVA 檢驗顯著性。使用基于最小二乘法的線性回歸分析（ordinary least squares，OLS） 解析SHI 和植物病原體之間的關系。土壤環境因子與微生物之間的關系采用皮爾遜（Pearson） 相關性分析。所有統計分析和可視化作圖均使用R （version4.3.1） 進行。

2 結果與分析

2.1 連作棉田土壤理化性質、中微量元素及胞外酶活性

連作年限對棉田土壤理化性質影響顯著。由圖2可知，隨著連作年限的增加，土壤電導率和鹽度呈升高的趨勢，Y30 達到最高值，分別為550 μs/cm 和302 mg/L，較Y5 分別顯著提高346% 和348%，表明長期連作導致土壤中鹽分積累，特別是干旱地區灌溉水中的鹽分無法有效淋洗。而SOC、TN 和AP 含量隨著連作年限呈先升后降的趨勢，最高值出現在Y20，分別為16.19 g/kg、0.79 g/kg 和17.81 mg/kg；SOC 和TN 最低值出現在Y7，相較于Y5 分別顯著降低21.72% 和13.21%。隨著連作年限的增加，Mg 含量在Y7 顯著提高，相較于Y5 顯著增加48.43%；微量元素Fe 和Mn 在Y7 最低，分別為7.80 和4.61 mg/kg，Cu 和Zn 在Y5 最低，分別為1.05 和0.54 mg/kg。這說明連作年限的增加影響了土壤有機質分解和養分循環過程，同時改變了中微量元素的生物有效性。

胞外酶參與土壤中幾乎所有的化學反應，且對土壤環境變化敏感[31]。針對GMean 分析可知，連作5 年時，GMean 達到峰值44.95 （圖2），表明這一連作年限下各土壤酶活性相對較高。而Y7 的GMean值最低，較Y5 減少69.00%，同時與碳氮磷循環相關的5 個土壤胞外酶活性除NAG 外也最低。之后隨連作年限增加土壤GMean 呈升高趨勢，表明在Y7之后，各酶活性逐漸恢復或提高。這種趨勢說明，在更長的連作過程中，土壤?微生物特定的互作關系可能促進了土壤養分循環過程的變化，進而土壤酶活性可能趨于穩定或改善。

2.2 連作棉田土壤微生物多樣性

不同連作年限土壤微生物細菌和真菌多樣性存在顯著差異（圖3）。微生物α 多樣性分析結果表明，不同連作年限下棉田土壤細菌群落的Shannon 指數和Simpson 指數在Y7 顯著降低（Plt;0.05），其中相對于Y5 分別降低了32.38% 和6.42%；真菌α 多樣性在Y7 時均顯著降低（Plt;0.05），相對于Y5 分別降低了28.01% 和7.83%。微生物β 多樣性的分析表明，連作年限顯著影響了土壤細菌（Adonis R2=0.86，P=0.001） 和真菌（Adonis R2=0.70，P=0.001） 的群落結構。因此，棉花長期連作導致的土壤微生物群落結構的變化，可能導致土壤生態系統功能的改變。

2.3 不同連作年限棉田土壤健康指數變化

主成分分析結果顯示，5 個主成分的特征值gt;1 且方差貢獻率值大于10%，累計貢獻率為93% （表1）。PC1 中的高因子載荷指標為PPO、Mg、S 和Mn，PC2 中的高因子載荷指標為SOC、TN、AP 和Ca，PC3 中的高因子載荷指標為BG、NAG 和ALP，PC4中有真菌Simpson 指數和真菌Shannon 指數，電導率和鹽度為PC5 中的初選指標。

Pearson 相關性分析表明（圖4），PC1、PC2、PC3、PC4 和PC5 中的高因子載荷指標之間均顯示較高的相關性，因此分別選擇具有較高因子載荷的Mn、TN、BG、真菌Simpson 指數和鹽度進入MDS。最終，MDS 指標為Mn、TN、BG、鹽度和真菌Simpson 指數。

基于構建的MDS，不同連作年限棉田SHI 存在顯著差異（圖5A），隨連作年限增加SHI 呈先下降后逐漸恢復的趨勢，其中在連作7 年土壤健康指數最低（SHIY7 =0.07），在 20 年恢復到最高點 （SHIY20=0.53），但未恢復到 連作5 年的水平（SHIY5=0.58）。通過分析MDS 指標對SHI 的貢獻（圖5B） 可知，連作5 年時BG 貢獻最大。回歸分析結果表明，SHITDS 和SHIMDS 之間呈顯著正相關關系（圖5C），線性函數回歸方程為：y=1.25x?0.884 （R2=0.81，Plt;0.001）。因此， 通過最小數據集可代替全數據集評價土壤健康。

2.4 植物病原體與土壤健康及環境因子之間的關系

真菌病原體豐度與SHITDS 和SHIMDS 之間均呈現極顯著負相關關系，即隨著真菌病原體豐度的增加，SHITDS 和SHIMDS 均呈顯著下降趨勢（Plt;0.01，圖6A、B）。這說明植物?土壤之間存在復雜的相互作用，其中病原菌的積累會導致的土壤生態功能下降，進一步影響土壤健康。通過分析環境因子與微生物之間的相關性（圖6C），結果顯示土壤TN 和BG 活性與植物病原體相對豐度呈極顯著負相關（TN：r=?0.912，Plt;0.001；BG 酶：r=?0.740，Plt;0.001）。在真菌優勢屬中，Pseudogymnoascus、Gymnoascus 和Canariomyces 豐度與SHIMDS 呈顯著負相關（rlt;?0.612，Plt;0.01）。因此，植物病原體的增加可能會通過多種途徑影響土壤的理化性質和微生物活性，進而影響土壤健康和功能的發揮。

3 討論

3.1 棉花不同連作年限對土壤理化性質的影響

土壤有機碳和養分含量是衡量土壤健康的重要指標，連作農田土壤性質的改變受連作時間的影響[32]。本研究中，棉花連作對土壤SOC、TN、AP 及中微量元素含量影響顯著，其含量隨著連作年限增加呈先升后降的趨勢（圖2），這種連作年限影響資源有效性的變化可能與微生物群落的改變有關[33]。細菌Simpson 指數在0.911～0.998，真菌Simpson 指數在0.820～0.966，在連作7 年時土壤微生物多樣性顯著降低（圖3）。微生物作為土壤養分循環的驅動者，其多樣性的增加/降低會影響群落結構和功能，進而影響土壤物理性質、有機碳以及氮磷養分狀況[34]。在本研究中，土壤電導率和鹽度隨著連作年限的增加呈升高的趨勢，新疆地區較高的土壤鹽漬化程度與土壤母質、地形、高地下水位以及地下水高鹽度密切相關，且長期灌溉導致次生鹽漬化發生[35]。Ca2+是土壤中最豐富的陽離子之一，其有效性可能與土壤微生物（如Flavobacteriaceae 和 Betaproteobacteria）密切相關[36]，本研究中連作7 年時土壤交換性Ca2+含量最低，同時土壤微生物多樣性顯著降低（圖3）。與短期連作相比，長期連作（gt;10 年） 時土壤有效態Fe和Mn 顯著增加，這與韓麗梅等[37]研究連作大豆的結果相似，可能與長期連作農田土壤具有較高水平的SOC 含量，可以通過絡合和螯合作用直接與游離態金屬元素結合固定有關[38]。

胞外酶活性能夠反映土壤生物活性和生化反應的強度，對土壤健康狀況具有重要影響[39]。本研究發現，BG、CBH 以及ALP 活性隨著連作年限的增加呈先降后升的趨勢，其中在連作7 年時胞外酶活性達到最低值，與土壤有機質含量水平相一致（圖2），這是由于參與纖維素水解的BG 和CBH 活性變化與土壤環境中碳源可用性密切相關[40]。同時，連作20 和25 年時LAP 和NAG 分別達到最高值[LAPY20=202.99 μmol/（g·h）]，NAGY25=2.26 μmol/（g·h）]，此時土壤健康指數顯著提高（SHIY20=0.528，SHIY25=0.416），而真菌病原體含量顯著降低（從Y12 的2.62% 顯著降至Y20 的0.11%）。真菌病原體的減少可能反映了土壤生態系統的改善，這在土壤健康指數的提高上有所體現（圖6B）。與此同時，植物微生物活性增強，特別是對氮素的需求，促進了LAP 和NAG 活性的提升。由此，催化蛋白質或多肽水解的LAP 和催化幾丁質水解的NAG 活性增加，進一步促進了氮的循環[41]。另一方面，較高的土壤氮素水平也表明棉花連作20 和25 年時土壤氮素循環較為活躍，有利于氮的持續供應。此外，本研究中GMean 值在連作7 年時最低（13.93，圖2），顯著低于Y5 （44.95） 和Y12（32.70），這與連作年限增加導致病原菌積累（植物病原體豐度增至4.22%） 及土壤退化（SOC 降至9.45 g/kg，TN 降至0.42 g/kg） 抑制了微生物活性及碳氮磷養分循環過程有關。同時，GMean 值與土壤健康指數均表現為連作7 年時最低，這一發現進一步證實了連作種植對土壤健康可能產生的負面影響，GMean 值可作為一個有價值的補充指標，為土壤健康評估提供更全面的信息。當連作＞10 年后，隨著連作年限的增加土壤微環境改善，微生物群落多樣性恢復，因此酶活性進一步得到提升，該研究結果與劉姣姣等[42]相一致。

3.2 棉花不同連作年限對土壤健康的影響

土壤健康是可持續農業的關鍵，良好的土壤健康狀況有助于維持作物生長、養分循環和其他生態系統功能的發揮[43]。由于土壤健康的響應具有區域特異性，篩選的關鍵指標多取決于區域氣候特性和土壤屬性等環境因素[18]。在本研究中TN、BG、Mn、鹽度和真菌多樣性被識別為評估新疆地區棉花連作土壤健康狀況的MDS。TN 作為土壤質量的重要指標[44]，有研究指出土壤中TN 的增加與團聚體形成、孔隙度、根系發育和根際微生物活性有關[45]。土壤β-葡萄糖苷酶（BG） 是微生物降解纖維素的關鍵酶，它能夠分解植物細胞壁中的纖維素，從而為微生物提供碳源，BG 的活性通常被用作衡量微生物碳獲取能力的重要指標[46]，在本研究中BG 在Y5 中的貢獻最為顯著（圖5B）。微量元素Mn 是生物體內酶、維生素和激素的重要組分，缺乏Mn 影響生物體的正常生長發育[47]。偏堿性地區土壤有效Mn 含量一般較低[48]，有效Mn 含量低于7 mg/kg 時被認為土壤缺Mn[49]。本研究中所有樣點有效Mn 含量均處于缺乏狀態（圖2），因此本研究中Mn 是表征土壤健康的重要指標。土壤鹽度是衡量干旱區耕地質量的關鍵指標[50]。真菌在生態系統中扮演著重要角色，在分解有機物，促進植物對養分的吸收，提高作物生產力等方面發揮著重要作用[51]。在本研究中，真菌多樣性在Y7 （ShannonY7=3.78） 相較于Y5 顯著降低了28.01%，在Y12 顯著升高（ShannonY12=5.51），這種現象表明，真菌多樣性受連作年限影響顯著，進一步證實了其對管理措施的敏感性，因此可用作評估土壤健康的關鍵指標[52]。

依據本研究指標計算的連作土壤健康指數，隨著連作年限的增加呈先降后升的趨勢，其中在連作7年時顯著降低，隨后呈現恢復趨勢（圖5A）。其中SHI 的下降可歸因于植物病原體的積累[ 1 4 ， 5 3 ]，這種積累會導致疾病壓力增加和連作土壤健康狀況的下降。土傳病原體已成為影響全球農業生產的一個關鍵因素，病原體的存在可能會影響土壤微生物群落組成，導致土壤養分失衡以及土壤酶活性和微生物功能的降低[54]。有研究指出，連作時作用于該作物的特定病蟲害會在土壤中累積，這種積累會導致植物病害程度的增加，降低作物產量和品質[11]。另一方面，研究發現連作7 年時細菌和真菌α 多樣性（Shannon 指數和Simpson 指數） 顯著降低（圖3），說明微生物群落平衡受到嚴重破壞，更易遭受病原菌的侵害。其中隸屬于Pseudeurotiaceae 科的真菌優勢屬Pseudogymnoascus 與SHI 呈顯著負相關，高鹽土壤中顯著富集的Pseudogymnoascus 可能包含一些病原體，進而感染植物或土壤微生物影響土壤健康[55]。而隨著連作時間的增加，生態系統恢復能力增加，土壤健康狀況得到改善，這也與有益土壤微生物的積累和土壤養分含量的增加有關[56]，在本研究中，土壤全氮含量在連作20 年時顯著增加至0.79 g/kg（相較于連作7 年的0.42 g/kg）。且基于MDS 發現TN 與植物病原體之間存在顯著負相關（r=?0.912，Plt;0.001，圖6C），表明土壤中較高的氮素有效性可以降低植物病原體豐度，增強土壤健康。本研究結果為進一步土壤健康管理和養分高效利用提供了重要的科學依據。

4 結論

隨著連作年限的增加，棉田土壤胞外酶活性和微生物多樣性呈現先降低后增加的趨勢，低谷出現在連作7 年地塊，土壤健康指數也最低，表明連作7 年時土壤微生物對環境壓力的適應性較弱，土壤養分礦化和循環受到了一定程度的抑制。隨著連作時間繼續增加，土壤養分含量增加，土壤生態系統功能變好，土壤健康狀況得到恢復。此外，連作導致的植物病原體豐度增加會降低土壤健康指數，通過增加棉田土壤氮素有效性不僅能夠提升植物抗病能力，還能夠通過抑制植物病原體提升土壤健康狀況。因此，維持土壤健康需要綜合的管理措施，配合養分和微生物群落調控，以促進土壤健康和棉花生產的可持續發展。