光照時間對不同鎘耐受水稻品種鎘積累的影響

摘要： 【目的】品種性狀和環境因素均影響水稻對鎘（Cd） 的積累，通過分析不同光照時間下不同鎘耐受品種水稻的生長及Cd 積累和分配，為調控水稻Cd 積累提供技術參考。【方法】采用水培試驗方法，供試材料為兩個高Cd 積累品種‘玉針香’、‘湘晚秈12 號’和1 個Cd 吸收主效基因Nramp5 缺失品種‘韶香100’。營養液中添加 1 μmol/L Cd 模擬Cd 脅迫條件，設置光照/黑暗為12 h/12 h、16 h/8 h 兩個光照處理。在分蘗期調查水稻植株生長指標、各部位Cd 含量、亞細胞各成分（細胞壁、細胞器、可溶性部分） 中Cd 含量與分配，以及Cd 主要吸收、轉運基因表達的差異?！窘Y果】與光照12 h 相比，光照16 h 各水稻品種的SPAD 值顯著上升，‘玉針香’株高顯著降低，而‘湘晚秈12 號’和‘韶香100’株高則顯著增加；3 個品種根體積和根干重均降低；各品種水稻地上部和根部Cd 含量提高，反映在亞細胞水平上，‘玉針香’品種細胞壁和細胞器內Cd 含量顯著上升，而細胞可溶性部分Cd 含量顯著下降，而‘韶香100”和‘湘晚秈12 號’各亞細胞組分的Cd 含量均增加。相比于光照12 h，光照16 h 下‘玉針香’地上部中Cd 吸收基因OsNramp5 表達水平上調，而‘湘晚秈12 號’OsNramp5 表達水平下調；負責液泡Cd 富集的基因OsHMA3 在‘玉針香’和‘韶香100’兩品種中表達上調，在‘湘晚秈12 號’中表達下調?！窘Y論】無論品種是否耐受Cd，延長光照時間可顯著降低Cd 脅迫下水稻根系的生長發育，提高水稻體內的Cd 含量。不同Cd 積累特性品種亞細胞成分中Cd 的分配差異受吸收和運轉基因調控，并由此導致Cd 脅迫下植株地上部和根部生長的差異。延長光照時間導致同一Cd 吸收分配調節基因在不同水稻品種表達的差異及其作用還需進一步研究。

關鍵詞： 水稻；光照時間；鎘吸收；根系形態；亞細胞分配；鎘吸收基因Nramp5；液泡鎘螯合基因OsHMA3

鎘（Cd） 是生物活性極強的有毒重金屬元素，過量積累會阻礙植物生長，同時可以通過食物鏈進入人體內并長期積累，危害人體健康[1?2]。長期暴露在Cd 環境下，Cd 會通過腸道吸收進入血液循環系統，在體內形成穩定的絡合物，從而在人體的重要器官如肝臟、腎臟、骨骼等部位積累，對人體健康構成很大威脅[3?4]。自然環境中的Cd 背景值較低，但隨著工業的發展，大量的Cd 被釋放進入農田生態系統，造成農田土壤中的鎘嚴重超標。水稻作為主要的糧食作物，其產區土壤中Cd 污染問題的解決對國內糧食安全和公眾健康具有重要意義[5]。在Cd 污染稻田中，尤其是南方酸性土壤，Cd 離子通過根系進入水稻體內，對水稻生長發育及體內重要生理過程，如光合作用、氮代謝等產生影響，最終導致產量和品質下降[6?7]。研究表明，高濃度的Cd 會引起水稻葉片變黃、萎縮以及根系腐爛等癥狀，嚴重影響水稻的正常生長[8]。因此，Cd 在水稻體內累積特性的研究對定向培育耐隔、低鎘水稻新品種及農田可持續發展具有重要意義。

環境因素（土壤質地、水分、溫度、光照等） 對水稻的生長發育具有重要影響，同時也會影響水稻體內的Cd 累積特性。研究表明，水稻Cd 積累與土壤鎘活性密切相關，而土壤鎘活性因土壤類型、鎘濃度、酸堿度和氧化還原電位以及有機質含量及其組分而異[9?11]。在一定范圍內，提高空氣溫度會增加水稻體內的Cd 含量[12]，但這種相關性也會受到水稻品種的影響[13?14]。研究發現，水分對水稻生長及重金屬Cd 在土壤－水稻系統中的遷移作用影響顯著，淹水灌溉較干濕交替灌溉降低了水稻對Cd 的吸收[15]。此外，通過田間小區試驗，發現不同水分處理的水稻糙米Cd 含量順序為： 旱作gt;間歇灌溉gt;全生育期淹水灌溉[16]。光照是影響植物生長發育的重要因素之一，其通過促進植物葉綠體的發育，進而促進子葉生長發育[17]。光照對水稻產量及品質也有一定的影響，有研究發現，在12 h 的光照條件下，植株的產量最高，而在持續的光照條件下，分蘗數量增多但產量較低[18]。前人研究還發現，隨著光照時間的增加，晚稻籽粒中的Cd 含量普遍高于早稻，并推斷是光照通過影響根系的Cd 吸收能力，進而影響Cd 在植物不同組織部位中的分布[19?20]。因此，探究光照時間對水稻Cd 累積特性的影響，對理解和調控水稻中Cd 的積累機制具有重要意義。

水稻對Cd 的敏感性和耐受性與栽培品種有關，不同水稻品種在Cd 積累上存在顯著差異[21]?！叵?00’被認為是低鎘累積的水稻品種，是優質稻種‘44-5’通過重離子輻射誘變方法篩選出的新品種，由于該品種OsNRAMP5 基因丟失，從而獲得了低Cd 累積的特性，并在多地進行了測試和試驗[22]。‘玉針香’作為高鎘累積品種，其籽粒中的Cd 含量可達中國國家食品安全標準（0.2 mg/kg） 的1.4～5.8 倍[23]。‘湘晚秈12 號’是湖南省水稻研究所選育的中熟優質常規晚秈稻品種，相比于‘玉針香’，‘湘晚秈12 號’被認為是低Cd 累積的水稻品種。已有研究對晚稻品種‘玉針香’和‘湘晚秈12 號’在4 個生育時期3 個溫度環境進行了持續6 天的Cd 處理，結果發現兩個供試品種吸Cd 趨勢一致，但‘玉針香’在4 個生育時期的Cd 含量高于‘湘晚秈12 號’[13]。而栽培過程中的光照時間對水稻Cd 累積影響的研究較少，因此，本研究以高Cd 積累品種‘玉針香’、‘湘晚秈12 號’和Cd 吸收主效基因Nramp5 缺失品種‘韶香100’3 個水稻品種為材料，利用分子、生理學等研究方法，探究不同光照時間對Cd 脅迫環境下水稻生長、Cd 積累和相關基因表達的影響，為鎘污染農田可持續發展提供理論指導和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料和生長條件

供試材料：供試水稻品種來自湖南省農業科學院，包括高Cd 積累品種‘玉針香’、‘湘晚秈12 號’和Cd 吸收主效基因Nramp5 缺失品種‘韶香100’。

生長條件：將飽滿的水稻種子在去離子水中浸泡2 天后，轉移至恒溫箱（37°C，16 h） 中進行催芽處理。將已發芽的種子播種于底部被切除的96 孔PCR 板上，然后置于盛滿去離子水的培養盒中繼續培養。培養7 天后，選取長勢一致的幼苗，移植于含Cd 的Yoshida 營養液（pH 5.8） 中進行培養，營養液成分如下：0.37 mmol/L CaCl2、0.17 mmol/LNaH2PO4、0.47 mmol/L MgSO4、0.27 mmol/L K2SO4、0.70 mmol/L （NH4）2SO4、45 μmol/L Fe-EDTA、0.17mmol/L Na2 SiO3、15 μmol/L H3BO3、8 μmol/LMnSO4、0.07 mmol/L NaMoO4、0.15 μmol/L ZnSO4、0.16 μmol/L CuSO4 和1 μmol/L Cd2+[24]。移植后的水稻材料，放置于溫室中進行不同光照時間處理，試驗設置2 個光照時間條件，分別為12 h 光照/12 h 黑暗和16 h 光照/8 h 黑暗的晝夜循環條件，期間每4 天更換1 次營養液，直至分蘗初期，進行水稻相關生理指標的測定，每個材料設置5 株水稻作為重復，確保數據的可靠性。

1.2 生長指標測定

利用SPAD 儀，對每株水稻的頂端葉進行SPAD值測定，同一片葉進行5 次測量，取5 次測量的平均值作為該株水稻的SPAD 值。

1.3 生物量的測定以及元素含量測定

于分蘗初期，以單株為1 個樣本，共取4 個樣本作為重復。先將水稻株系分為地上部和根部，分別用1 μmol/L CaCl2 溶液浸泡，隨后用去離子水沖洗干凈。將沖洗干凈的組織樣本，于75°C 烘箱中干燥1 天后稱取干重。以優級純HNO3 浸泡樣本過夜，然后在100°C 消煮2 h，將消解液稀釋、定容、過濾，用 ICP-MS 測量Cd 元素含量。

1.4 亞細胞組分的提取以及含量測定

采用差速離心法提取各亞細胞組分[ 2 5 ]，稱?。?.000±0.005） g 地上部鮮樣，置于研缽中，加入8 mL提取劑（250 mmol/L 蔗糖；50 mmol/L Tris-HCl，pH7.5；1 mmol/L 二硫蘇糖醇） 于冰上研磨形成勻漿。將勻漿轉移至10 mL 離心管中，300×g 離心30 s，殘渣為細胞壁。將濾液轉移至新的10 mL 離心管中，20000×g 離心45 min，沉淀為細胞器，上清為可溶部分。提取的細胞壁和細胞器分別于烘箱中干燥，加入1 mL 優級純HNO3 消化過夜后進行消煮（100°C，2 h），消煮完成后，將消解液稀釋定容，過濾后使用ICP-MS 測定Cd 濃度；可溶性部分直接加HNO3 消化并消煮，消煮完成后，將消解液稀釋定容，過濾后用 ICP-MS 測定Cd 濃度。

1.5 根系掃描與構型分析

利用根系掃描儀（ M I C R O T E K S c a n M a k e ri800plus） 對水稻根系構型進行分析。將水稻根系完整剪下，使用清水進行充分漂洗。隨后，將清洗后的根系平鋪于樣品槽內，盡可能地散開根系，避免重疊，進行掃描。掃描完成后，使用 LA-S 根系掃描分析軟件（MICROTEK Scan Maer i800plus） 對掃描的根系圖片進行根系構型分析。

1.6 實時熒光定量PCR

使用Trizol 試劑（Invitrogen） 提取水稻根系以及根莖結合處的RNA，并利用HiscriptII RT SuperMixKit （Vazyme） 將RNA 逆轉錄合成cDNA。隨后使用ChamQTM SYBR Color qPCR Master Mix （Vazyme）和Step One Plus 實時PCR 系統進行qRT-PCR。所使用的引物序列詳見表1?；虮磉_量的相對表達水平將通過2?ΔCt 公式計算得出。

1.7 數據分析

采用SPSS 軟件數據處理系統進行方差分析，并通過Tukey 方法進行多重比較，Plt;0.05 為有統計學差異，使用Origin 2018 軟件繪制柱狀圖和基因表達圖。

2 結果與分析

2.1 不同光照時間對水稻地上部生長的影響

如圖1 所示，不同水稻品種生長發育對光照時間的敏感程度存在顯著差異（圖1A），與12 h 光照處理相比，16 h 光照條件下，各品種水稻的SPAD 值和株高顯著增加（圖1B、C）；“玉珍香”和 ‘韶香100’2 個品種的葉面積在不同光照時間處理下未表現出顯著差異，而‘湘晚秈12 號’在16 h 光照處理下的葉面積較12 h 光照處理顯著增加（圖1D）。在12 h光照處理下，“玉珍香”和‘韶香100’的地上部干重顯著高于16 h 光照處理，而‘湘晚秈12 號’在兩個處理之間沒有顯著差異（圖1E）。與12 h 光照處理相比，16 h 光照處理能夠顯著促進水稻植株的生長。

2.2 不同光照時間對水稻根系生長的影響

與光照12 h 相比，光照時間延長到16 h 對水稻品種的根系生長產生了顯著不同的影響（圖2A）。兩個Cd 積累型品種‘玉針香’和‘韶香100’的根尖數量和根表面積均顯著降低（圖2B、C），但主根長度未發生顯著變化（圖2D），而拒Cd 型品種‘湘晚秈12 號’的主根長度顯著增加（圖2D）。在Cd 脅迫條件下，盡管品種間存在差異，但長光照時間使了3 個品種的根體積顯著下降（Plt;0.05），根干重也呈降低趨勢（圖2E、F）。

2.3 不同光照時間對水稻鎘鐵、鋅元素含量的影響

在12 h 光照條件下，‘玉針香’和‘湘晚秈12 號’地上部Cd 濃度顯著高于‘韶香100’ （圖3A）。與12 h 光照相比，16 h 光照條件下‘玉針香’和‘湘晚秈12 號’地上部和根部的Cd 濃度均顯著增加，且根部Cd 濃度高于地上部（圖3A）。此外，光照時間的延長顯著提高了3 個品種根部的鐵（Fe） 濃度（圖3B）和‘韶香100’根部的鋅（Zn） 濃度（圖3C）。綜上所述，光照時間的增加促進了不同水稻品種地上部和根部Cd 濃度的增加，同時對Fe 和Zn 的累積也有一定影響。

2.4 光照時間對不同水稻品種亞細胞組分Cd 濃度的影響

由圖4 可以看出，相比于短光照12 h 處理，長光照16 h 處理顯著提高了高Cd 積累品種‘玉針香’細胞壁和細胞器內的Cd 濃度，降低了細胞可溶性部分的Cd 濃度，表明增加光照時間誘導 ‘玉針香’ 通過增強細胞壁和細胞器對Cd 的結合能力，來降低細胞內可溶部分Cd 的濃度，從而減輕Cd 對細胞內代謝活動的影響；高Cd 積累品種‘湘晚秈12 號’在光照時間增加后，細胞壁、細胞器以及細胞可溶性部分的Cd 濃度均顯著增加，但各亞細胞部位的分配沒有顯著變化；而拒Cd 品種‘韶香100’在光照時間延長后，各亞細胞組分的Cd 濃度及占比均沒有顯著變化，可能是由于其缺失了Cd 吸收主效基因Nramp5，本身對Cd 的吸收和積累能力較弱所致。

進一步分析發現，Cd 脅迫條件下，3 個水稻品種根系組織中Cd 的含量分配比例均為細胞可溶性部分gt;細胞壁gt;細胞器，表明水稻吸收的Cd 主要存在于細胞可溶部分和細胞壁中，較少進入細胞器。

2.5 光照時間增加對水稻Cd 吸收、轉運基因表達的影響

由圖5 可知，與12 h 光照相比，16 h 光照條件下‘玉針香’中參與Cd 吸收的基因OsNramp5 表達量顯著增加，而‘湘晚秈12 號’中顯著下降；‘韶香100’自身為Cd 吸收主效基因Nramp5 缺失品種，因此沒有檢測Nramp5 的轉錄表達水平。另一方面，液泡中Cd 螯合基因OsHMA3 在‘玉針香’ 、‘韶香100’品種中，延長光照時間后，其表達量顯著增加，而在‘湘晚秈12 號’中顯著減少。這些結果表明，光照時間對Cd 相關基因的表達有顯著影響，且這種影響因品種而異。

3 討論

Cd 是強毒性重金屬，抑制植物的細胞分裂和對代謝產生影響，嚴重影響植物的生長發育[26]。研究表明，一定濃度的Cd 會抑制水稻原生根的延長以及側根產生[10， 27?28]。然而，不同水稻品種對Cd 的吸收和積累存在差異，進而對Cd 脅迫的響應及耐受性程度也不一致。光照是水稻生長發育的必需因子之一，直接影響植物體內的生理生化、光合作用和生理代謝等過程，且光照時長的增加在一定范圍內能夠促進水稻的生長發育[17]。前人研究發現，高產品種對光照的利用效率要高于低產品種[29]。本研究選用3 種不同Cd 積累特性水稻品種，探討Cd 脅迫下光照時間對其生長發育的影響。結果表明，隨著光照時間從12 h 延長至16 h，各品種水稻的SPAD 值均顯著增加（圖1），說明光照時間的增加促進了水稻光合作用和生長發育。然而，光照時間對地上部干重和葉面積的影響因品種而異，這可能與各品種的光合特性和光照利用效率有關。另一方面，植物根部是植物體吸收水分和養分的關鍵結構，同時也是吸收Cd 等重金屬的主要器官，這一特性使根部受到Cd 脅迫的影響要早于其他組織部位。對3 個品種的根系構型進行分析，結果發現，隨著光照時長從12 h 延長至16 h，‘玉針香’ 和 ‘韶香100’ 的根尖數量和根面積隨光照時長增加而顯著降低，而湘晚秈12 號的主根長度顯著增加，此外，3 個品種的根體積和根干重下降（圖2）。說明光照可以通過影響水稻鎘脅迫下的根系形態來提高水稻對環境的適應性。

在一定的范圍內，光照會影響Cd 在水稻體內的累積。前人研究認為，隨著光照時間的增加，籽粒中Cd 含量也隨之提高，但品種間鎘累積量有差異，其中接受光照時間較長的品種其鎘含量普遍高于接受光照時間較短的水稻品種[19?20]。本研究結果表明，隨著光照時間由12 h 延長至16 h，3 種水稻品種地上部和根部的Cd 含量均呈現上升趨勢（圖3）。當Cd 進入水稻細胞后，細胞壁纖維素、半纖維素和果膠等成分與Cd 離子結合，有效阻止Cd 進入原生質層；而進入細胞后的Cd 大部分以螯合態存在，與谷胱甘肽（GSH）、植物螯合肽（PC） 等小分子化合物螯合，進一步減少Cd 與活性蛋白質的結合[30?31]。由于多層防御機制，導致根系吸收的Cd 在水稻體內呈現差異性分布，因此，通過亞細胞水平研究的方法，可深入了解水稻Cd 積累的分布性差異。有研究表明，水稻亞細胞組分的Cd 含量趨勢為細胞壁gt;可溶部分gt;細胞器，但這種趨勢也會因品種而異[32]。本研究對根系亞細胞水平的Cd 分布進行分析，發現雖然3 種不同Cd 積累特性的水稻品種在不同光照時間的影響下，其根細胞亞細胞組分中Cd 含量發生了顯著變化，但3 個品種根細胞亞細胞組分中的Cd 含量趨勢一致，均表現為：可溶部分gt;細胞壁gt;細胞器（圖4）。

Cd 通過與鋅（Zn）、鐵（Fe） 和鈣（Ca） 轉運蛋白相互作用，進入植物細胞內部[33?35]。有很多的離子轉運蛋白可以轉運游離形態的Cd2+進入根細胞，如NRAMP家族OsNRAMP5 蛋白，敲除OsNRAMP5 能減少水稻中Cd 的攝取和積累，同時增強對Cd 的耐受性，并改善錳（Mn） 的分配，對降低水稻Cd 毒性和積累風險具有重要作用[36]。OsHMA3 作為重金屬ATP 酶（HMA） 家族成員，在水稻根部定位于液泡膜，并調控Cd 的轉運，其過表達減少了籽粒中Cd 積累，同時增強了水稻對Cd 的耐受性[37]。在本研究中，當光照時間從12 h 增加至16 h 后，在‘玉針香’ 品種中，Cd 吸收的關鍵基因OsNramp5 的表達水平顯著上調，促進了‘玉針香’對Cd 的吸收，進而增加了植株體內Cd 的累積。而對于 ‘湘晚秈12 號’ 品種，OsHMA3 負責液泡Cd 的儲存、區隔化，光照時長的延長抑制了OsHMA3 的表達，鑒于OsHMA3在Cd 的液泡隔離和解毒過程中發揮著至關重要的作用，其表達水平的下調可能降低了 ‘湘晚秈12 號’將Cd 富集和隔離于液泡中的能力，從而增加了Cd在細胞質中的累積。在 ‘韶香100’ 品種中，觀察到了與 ‘湘晚秈12 號’中不同的趨勢，其光照時間的增加促進了OsHMA3 基因的表達，表明 ‘韶香100’可能通過增強Cd 在液泡中的存儲和區隔化，來提高其對Cd 脅迫的耐受性，這些基因的差異性表達也是不同水稻品種適應Cd 脅迫條件的調節方式之一。本研究系統揭示了光照時間對水稻生長發育、Cd 吸收和積累的影響，為深入探究植物在復雜環境條件下調節重金屬吸收和分配的分子機制奠定了堅實的理論基礎。

4 結論

Cd 脅迫條件下，延長光照時間促進了水稻高Cd 積累品種 ‘玉針香’ 、‘湘晚秈12 號’根尖數量和根面積的增加，增加了Cd 吸收主效基因Nramp5 缺失品種 ‘韶香100’主根長度，因而促進了Cd 的吸收和運轉。亞細胞水平分析表明，延長光照不同程度增加了3 個品種細胞壁和細胞器內Cd 的含量占比，Cd 吸收和液泡Cd 螯合相關基因的表達量變化與Cd 亞細胞水平分配的變化不完全一致，具體基因調節機制還需進一步研究。