山東鴨源糞腸球菌的分離鑒定及藥物敏感性分析

摘 要：為探究引起山東省某規(guī)模肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)雛鴨死亡的原因，本試驗(yàn)在病死鴨病變肝臟組織中分離到疑似糞腸球菌病原菌。通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)鑒定、16S rRNA序列分析鑒定病原菌，對(duì)分離菌進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，以便精準(zhǔn)用藥防控。結(jié)果顯示：分離菌為糞腸球菌，且該菌株多重耐藥性較強(qiáng)，對(duì)阿莫西林、安普霉素敏感，對(duì)頭孢噻肟、氟苯尼考、卡那霉素、恩諾沙星、氨芐西林、多黏菌素耐藥。本研究為鴨源糞腸球菌的臨床防控提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：糞腸球菌；分離鑒定；序列分析；最小抑菌濃度

收稿日期：2024-08-03

第一作者：劉洪港（1997—），男，從事家禽疫病診斷與防治工作，E-mail：LHG2013614@163.com

并列第一作者：張?bào)悖?997—），女，從事家禽疫病診斷與防治工作，E-mail：Zxxx2920@163.com

通信作者：汪建華（1993—），男，主要從事種禽疫病診斷與防治技術(shù)研究：E-mail：739322897@qq.com

糞腸球菌（Enterococcus faecalis，Ef）作為一種廣泛存在于人類、動(dòng)物腸道及自然環(huán)境中的革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧菌，機(jī)體健康狀態(tài)下也可穩(wěn)定地定植于胃腸道、口腔或生殖道內(nèi)[1]。糞腸球菌作為具有多種益生功能的菌群之一，能夠促進(jìn)消化、增強(qiáng)免疫力及降低腹瀉發(fā)病率，具有一定的治療效果，而且還在腸道中發(fā)揮著調(diào)節(jié)菌群平衡、維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵作用[2]。此外，糞腸球菌能有效提高家畜的抵抗力和生產(chǎn)性能，通過抑制大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌的生長(zhǎng)，顯著改善腸道微環(huán)境。有研究表明，仔豬口服糞腸球菌能顯著降低腹瀉率并增加平均日增重。

糞腸球菌作為禽類腸道正常菌群的組成部分，通常并不會(huì)引起疾病。然而，在特定的條件下如受到應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)不良、飼養(yǎng)環(huán)境惡劣等因素的影響下，糞腸球菌可能會(huì)大量繁殖，導(dǎo)致感染的發(fā)生[3]。因此，一般認(rèn)為糞腸球菌感染是繼發(fā)性的，即在其他疾病或因素導(dǎo)致鴨免疫力下降的情況下，糞腸球菌才會(huì)趁機(jī)侵入機(jī)體，引發(fā)感染[4-5]。近年來，由糞腸球菌引起的人及動(dòng)物感染、死亡的病例逐漸增多[6-7]。例如，糞腸球菌能引發(fā)人的傳染性心內(nèi)膜炎，也能導(dǎo)致雞、鵝敗血癥、公豬睪丸炎及家兔腹瀉等多種疾病。值得注意的是，這種病原菌具有在人與動(dòng)物之間水平傳播的能力，因此對(duì)其防控尤為重要。

本研究從山東省某規(guī)模肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)的病鴨肝臟組織中分離培養(yǎng)細(xì)菌，通過細(xì)菌形態(tài)觀察、生化鑒定、16S rRNA序列分析，鑒定分離菌為鴨源糞腸球菌，并通過藥物敏感性試驗(yàn)分析分離菌株的耐藥性特點(diǎn)，以期為鴨源糞腸球菌防控提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 病料來源于山東省某規(guī)模肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)17日齡病死雛鴨。

1.1.2 主要儀器與試劑 醫(yī)用潔凈工作臺(tái)，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；生化培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；N-300M顯微鏡，寧波永新光學(xué)股份有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；2×PCRmix，南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA Marker、核酸染料，北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；革蘭氏染色試劑盒，金克?。ū本┥锛夹g(shù)有限公司；小牛血清，平睿生物科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 剖檢與細(xì)菌分離 無菌采集病死鴨的肝臟、脾臟，接種至含有5%胎牛血清的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落的生長(zhǎng)形態(tài)。挑選出單一菌落革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。對(duì)疑似菌落，則進(jìn)一步純化培養(yǎng)。

1.2.2 生化鑒定 為確定分離菌株特性，將純化培養(yǎng)后的產(chǎn)物接種至不同細(xì)菌生化微量鑒定管中，包括葡萄糖、枸櫞酸鹽、尿素、麥芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖。此外還測(cè)試了菌株V-P、M-R試驗(yàn)特性。接種后的樣本，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h。依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行判定。

1.2.3 16S rRNA序列測(cè)定 從分離純化后的菌株中挑選目標(biāo)菌，按照細(xì)菌總DNA提取試劑盒的規(guī)范步驟，提取純化菌株總DNA。16S rRNA基因引物序列：正向引物5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，反向引物5’-TACGGYTACCTTTGACGACT T-3’，預(yù)期PCR產(chǎn)物條帶大小為1 500 bp。PCR擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系，包括25 μL Premix Ex Taq、上下游引物各1 μL、20 μL去離子水、3 μL菌液。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，循環(huán)30次；最后72 ℃延伸8 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察記錄結(jié)果，并將回收的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，選取與已知菌株同源性較高的16S rRNA基因序列，借助DNAstar同源性分析，利用MEGA 11.0.10軟件構(gòu)建分離菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）所確立的微量肉湯稀釋法，測(cè)試分離菌的藥物敏感性，精確測(cè)量8種不同藥物的最小抑菌濃度（MIC）。依據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)藥敏結(jié)果評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌采集病死鴨的肝臟、脾臟，接種至含有5%胎牛血清的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，結(jié)果培養(yǎng)基上生長(zhǎng)呈乳白色或灰白色、光滑且邊緣整齊的圓形或近似圓形的菌落，見圖1；革蘭氏染色、1 000倍鏡下觀察，分離菌為革蘭氏陽(yáng)性、單個(gè)菌體疏松分布或個(gè)別短鏈狀排列，見圖2。分離菌株與糞腸球菌形態(tài)特性觀察一致。

2.2 生化鑒定

分離菌株的生化鑒定結(jié)果顯示，該菌株可發(fā)酵麥芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇，M-R試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，過氧化氫、V-P試驗(yàn)結(jié)果陰性，符合糞腸球菌生化特征。生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.3 16S rRNA 基因序列同源性分析

將16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。利用GenBank進(jìn)行Blast序列對(duì)比，選取8段合適的基因序列作為參考；另外選取大腸桿菌、沙門氏菌16S rRNA片段作為參考對(duì)照，利用DNAstar軟件同源性分析，此分離菌株16S rRNA 序列與糞腸球菌的同源性達(dá)到98%以上，結(jié)果見圖3。

2.4 16S rRNA鑒定及序列分析

利用GenBank進(jìn)行Blast序列對(duì)比，進(jìn)一步利用MEGA11.0.10軟件深入分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，顯示此分離菌株與GenBank 登錄號(hào)MN880256.1處于統(tǒng)一分支上，親緣關(guān)系較近，結(jié)果見圖4。

中圖分類號(hào)：S858.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673-1085（2025）02-0026-06

2.5 藥物敏感性結(jié)果

分離菌株藥物敏感性結(jié)果見表2所示。該菌株多重耐藥性較強(qiáng)，對(duì)阿莫西林、安普霉素敏感，對(duì)頭孢噻肟、氟苯尼考、卡那霉素、恩諾沙星、氨芐西林、多黏菌素耐藥。

3 討論

臨床剖檢可見病鴨患肝周炎、氣囊炎，心包內(nèi)充滿黃色膿性液體并伴有纖維素性滲出物，這些病理變化與糞腸球菌感染特征相吻合。本試驗(yàn)從肝臟組織病料中成功分離到一株細(xì)菌，經(jīng)培養(yǎng)特性觀察、生化試驗(yàn)和16S rRNA PCR鑒定，證實(shí)分離出的菌株為糞腸球菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株多重耐藥性較強(qiáng)，對(duì)阿莫西林、安普霉素敏感，對(duì)頭孢噻肟、氟苯尼考、卡那霉素、恩諾沙星、氨芐西林、多黏菌素耐藥。吳云等[8]分離的糞腸球菌對(duì)萬古霉素、替考拉寧敏感；夏倫斌等[9]分離的糞腸球菌對(duì)頭孢噻肟、磷霉素、丁胺卡那等藥物敏感，對(duì)多西環(huán)素、卡那霉素、新霉素、氟苯尼考等耐藥；劉雨[10]研究表明61株雞源糞腸球菌多重耐藥菌株檢出率高達(dá)72.13%，優(yōu)勢(shì)耐藥譜是E-TE-S-CN（19.68%）。糞腸球菌多重耐藥性可能是由于長(zhǎng)期在復(fù)雜化的養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中針對(duì)不同種類的動(dòng)物治療時(shí)，頻繁采用多樣化的抗菌藥物策略，導(dǎo)致出現(xiàn)糞腸球菌耐藥性的復(fù)雜局面。鑒于此，獸醫(yī)臨床中，為了在治療初期對(duì)病原菌進(jìn)行精準(zhǔn)用藥，故對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏測(cè)試，以了解其對(duì)不同藥物的敏感性。

糞腸球菌在禽畜養(yǎng)殖中是一種常見的條件性致病菌，尤其在環(huán)境衛(wèi)生條件不佳、飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)那闆r下更容易誘使鴨群感染糞腸球菌。糞腸球菌的傳播途徑廣泛，可通過空氣、飲水、飼料、接觸傳播等多種方式感染畜禽。為有效防控糞腸球菌病，可采取一系列措施：首先，提高畜禽的免疫力是關(guān)鍵，可通過合理的飼養(yǎng)管理和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充來增強(qiáng)畜禽的抵抗力；其次，加強(qiáng)養(yǎng)殖環(huán)境的衛(wèi)生管理，定期清潔和消毒禽舍，減少病原體的滋生和傳播；注意飼料和飲水的衛(wèi)生質(zhì)量，避免污染；再次，人員管理也至關(guān)重要，養(yǎng)殖人員應(yīng)具備良好的衛(wèi)生意識(shí)，遵守養(yǎng)殖規(guī)范，避免將病原體帶入禽舍；最后，加強(qiáng)野鳥和昆蟲的控制，防止其成為糞腸球菌的傳播媒介。綜上所述，提高畜禽免疫力、加強(qiáng)養(yǎng)殖管理和改善環(huán)境衛(wèi)生，可有效防控糞腸球菌病的發(fā)生和傳播，保障畜禽的健康和養(yǎng)殖業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。

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Isolation， Identification and Drug Sensitivity Analysis of

Enterococcus faecalis from Duck Source in Shandong Province

LIU Honggang1， ZHANG Xiao1， ZHAO Jie1， SHI Yanhong1，WANG Zhen1， LI Yufeng2，

WANG Jianhua1

（1. Shandong Hekangyuan Biological Breeding Co.， Ltd.， Jinan 250100，China;

2. Poultry Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences/Poultry Breeding and Disease Prevention and Control Shandong Engineering Research Center， Jinan 250100，China）

Abstract： To investigate the etiology of duck mortality in a duck farm located in Shandong Province， pathogenic bacteria suspected to be Enterococcus were isolated from the liver tissues of deceased ducks. For precise pharmacological intervention， a comprehensive approach was employed， including bacterial isolation， morphological observation， biochemical testing， and 16S rRNA sequence analysis for pathogen identification. Additionally， drug sensitivity assays were performed on the isolated pathogens. The results indicated that the isolated strain was identified as Enterococcus faecalis， exhibiting significant multi-drug resistance. The strain demonstrated sensitivity to Amoxicillin and Ampramycin， while showing resistance to Cefotaxime， Flufenicol， Kanamycin， Enrofloxacin， Ampicillin， and Polycolistin. This study offers valuable insights for the clinical prevention and control of Enterococcus faecalis originating from ducks.

Keywords： Enterococcus faecalis; Isolation and identification; Sequence analysis; MIC