活性氧響應型甲氨蝶呤修飾紫杉醇/淫羊藿苷膠束的工藝優化與體外抗腫瘤作用評價

關鍵詞活性氧響應型膠束；甲氨蝶呤；靶向藥物遞送；紫杉醇；淫羊藿苷

紫杉醇（paclitaxel，PTX）是一種廣泛使用的抗腫瘤藥物，主要通過穩定微管、抑制細胞分裂來誘導細胞凋亡；但PTX存在水溶性低、毒性強、多藥耐藥性突出等缺點，臨床應用受限[1]。淫羊藿苷（icariin，ICA）是一種從傳統中藥淫羊藿中提取的黃酮類化合物，具有顯著的抗腫瘤、抗炎和抗氧化活性[2]。研究表明，ICA不僅能抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，還能夠增強化療藥物的療效[3]。然而，ICA的臨床應用面臨著水溶性差和靶向性不足等問題。為了克服這些問題，可考慮將ICA與其他抗腫瘤藥物（如PTX）聯合使用，并開發合適的藥物遞送系統，以共同改善ICA和PTX的水溶性、靶向性及生物利用度[4]。

腫瘤細胞代謝異常和快速增殖導致腫瘤微環境中活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）水平較高，因此ROS響應型藥物遞送系統能夠在腫瘤部位選擇性釋放藥物，從而提高療效并減少對正常組織的損傷[5―6]。ROS響應鍵——酮縮硫醇鍵（thioketal，TK）能夠在高ROS水平環境下被氧化從而斷裂，被廣泛用于設計ROS響應型藥物遞送系統。含有TK的藥物載體可以在腫瘤部位選擇性地裂解，從而實現藥物的靶向遞送，減毒增效[7―8]。此外，甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）可以通過葉酸受體介導的途徑顯著增強藥物的腫瘤靶向性，從而減少對正常組織的影響[9―10]。

基于上述背景，本研究制備了一種ROS響應型MTX修飾PTX/ICA膠束（MTX-oxi-Ms@PTX/ICA）。該膠束利用疏水核心包載水溶性較差的PTX和ICA；膠束的最外層由聚乙二醇5000（PEG5000）形成水化層，隱藏主動靶向配體MTX，以減少正常細胞對膠束的攝取并減輕不良反應。本研究通過協同實驗確定兩藥的最優配比，采用Box-Behnken設計-響應面法優化制劑工藝，對MTX-oxi-Ms@PTX/ICA進行表征，并考察了其體外靶向性以及體外抗腫瘤作用，旨在為抗腫瘤制劑的研發提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

FA1004型電子天平購自上海越平科學儀器有限公司；RE52CS型旋轉蒸發器購自上海亞榮生化儀器廠；KQ3200E型超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司；JY92-2D型超聲波細胞破碎機購自寧波新芝生物科技股份有限公司；2010型高效液相色譜（HPLC）儀（包含紫外檢測器）購自日本Shimadzu公司；LITESIZER500型納米粒度及Zeta電位分析儀購自英國Malvern公司；CKX53型倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司；CLARIOstar型全波長熒光掃描酶標儀購自德國BMGLabtech公司；HBS-1096A型酶標儀購自南京德鐵生物科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

PTX對照品（批號D1205C，純度≥98%）、ICA對照品（批號J0703A，純度≥98%）、香豆素（coumarin，Cou）原料藥（批號C104161）、4′，6-雙脒基-2-苯基吲哚（DAPI，批號D489987）均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（Soluplus?，批號50477909）購自德國BASFSE公司；維生素E琥珀酸酯聚乙二醇1000（TPGS1000，批號MB3962）購自大連美侖生物技術有限公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-甲氨蝶呤（DSPEPEG2000-MTX，批號R-EL-090）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-酮縮硫醇-聚乙二醇5000（DSPEPEG2000-TK-PEG5000，批號R-EL-089）均購自西安瑞禧生物科技有限公司；CCK-8試劑盒（批號CA1210）、DMEM高糖培養基（批號11995）、1640培養基（批號90023）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號P903593，pH7.4）均購自北京索萊寶科技有限公司；其余常見溶劑均為色譜級純度。

1.3 細胞

小鼠腎癌細胞RENCA購自億奧邦（北京）生物科技研究有限公司。

2 方法與結果

2.1 PTX/ICA協同毒性實驗的濃度篩選與分析

為了評估PTX和ICA的協同毒性，將RENCA細胞以1×104個/孔的密度接種到96孔板中，并在細胞貼壁后向細胞孔中加入不同濃度的PTX和ICA溶液。PTX的終濃度分別設置為0、0.31、0.62、1.25、2.50、5.00、10.00、15.00μmol/L，ICA的終濃度分別設置為0、0.62、1.25、2.50、5.00、10.00、15.00、20.00μmol/L。根據上述濃度范圍，形成不同的PTX和ICA濃度組合，每個組合設置3個復孔。培養48h后，每孔加入10%CCK-8試劑10μL，繼續培養1～4h。采用酶標儀在450nm波長下檢測各孔光密度（OD）值。采用在線SynergyFinder軟件（https：//synergyfinder.fimm.fi）計算藥物協同評分（ZIPSynergyscore）。ZIPSynergyscore＞0分被認為具有協同作用，＞10分被認為具有強協同作用[11]。結果表明，在協同毒性實驗中，PTX/ICA組合在抑制RENCA細胞增殖方面表現出了高度的協同效應（ZIPSynergyscore＞10分），相較于單獨用藥，聯合應用顯著增強了對RENCA細胞的殺傷作用。當PTX濃度在2.5～10μmol/L區間、ICA濃度在5～15μmol/L區間時，表現出最強的協同毒性。

2.2 MTX-oxi-Ms@PTX/ICA膠束的制備

采用薄膜水合法制備膠束。精密稱取處方量的DSPE-PEG2000-MTX、DSPE-PEG2000-TK-PEG5000、Soluplus?、TPGS1000、PTX、ICA于圓底燒瓶中，加甲醇溶解，減壓除去溶劑，此時圓底燒瓶內壁形成一層均勻的薄膜；向燒瓶中加入PBS，超聲振蕩使薄膜溶在PBS中；靜置，待溶液透明后，用0.22μm聚碳酸酯膜擠壓2次，即得MTX-oxi-Ms@PTX/ICA。

采用相同方法制備不加DSPE-PEG2000-TKPEG5000的MTX修飾的PTX/ICA膠束（MTXMs@PTX/ICA）、不加DSPE-PEG2000-MTX和DSPEPEG2000-TK-PEG5000的PTX/ICA膠束（Ms@PTX/ICA）、不加PTX和ICA的空白膠束（Blank-Ms）。

2.3 MTX-oxi-Ms@PTX/ICA工藝優選

2.3.1 色譜條件

參考文獻[12―13]設置本研究中HPLC檢測條件：色譜柱為AgilentC18柱（250mm×4.6mm，5μm），流速為1.0mL/min，柱溫為27℃；PTX以乙腈-甲醇-水（42∶28∶30，V/V/V）為流動相，檢測波長為227nm；ICA以乙腈-水（25∶75，V/V）為流動相，檢測波長為275nm；進樣量為20μL。

2.3.2 包封率測定

參考文獻[14]進行包封率測定。取0.5mL膠束溶液至5mL容量瓶中，以甲醇定容，過0.45μm微孔濾膜，收集濾液，得過柱前溶液；取0.5mL膠束溶液至葡聚糖凝膠柱頂部，加入0.5mLPBS洗脫2次，合并洗脫液，以甲醇定容至5mL，過0.45μm微孔濾膜，收集濾液，得過柱后溶液。采用HPLC法測定藥物含量，并參照2020年版《中國藥典》（四部）相關通則要求進行含量測定方法學考察。考察符合要求后，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄過柱前后溶液中PTX和ICA含量，根據下式計算膠束中PTX和ICA的包封率：PTX包封率（%）＝膠束中PTX的質量/總PTX的質量×100%，ICA包封率（%）＝膠束中ICA的質量/總ICA的質量×100%。

2.3.3 工藝優化

本研究在前期預實驗基礎上，確定以Soluplus?質量（X1）、Soluplus?與TPGS1000的質量比（X2，mg/mg）、水合溫度（X3）為考察因素，以PTX和ICA包封率的綜合評分Y[Y（%）＝PTX包封率×0.5+ICA包封率×0.5]為響應值，利用Design-Expert8.0.6.1軟件進行響應面分析。因素與水平表見表1，實驗設計及結果見表2。

利用Design-Expert8.0.6.1軟件，根據表2數據進行多元二次項擬合，得到擬合方程為Y＝91.61+0.042X1+9.43X2－5.42X3－15.62X1X2+2.24X1X3－12.86X2X3－12.36X12－14.44X22－28.03X32（R2＝0.9751，P＜0.05）。方差分析結果（表3）顯示，所建模型具有極高的顯著性（P＜0.01），而失擬項的P＞0.05，實驗模型相關系數為0.9430。這提示該模型能較好地反映出響應值的變化，可用于篩選MTX-oxi-Ms@PTX/ICA的最優工藝。

由表3可知，因素X1對Y無顯著影響（P＞0.05），因素X3對Y影響顯著（P＜0.05），因素X2、X1X2、X2X3、X12、X22、X32對Y有極顯著影響（P＜0.01）。通過Design-Expert8.0.6.1軟件對各因素之間的交互作用進行效應面分析，結果見圖1。根據圖1結果，再結合膠束制備經驗及膠束制備的實際情況，最終確定MTX-oxi-Ms@PTX/ICA的最優工藝如下：X1為80mg，X2為4∶1，X3為35℃，DSPE-PEG2000-TK-PEG5000為2mg，DSPE-PEG2000-MTX為2mg，PTX為1mg，ICA為1.5mg，超聲功率為500W，處方量為5mL。

2.3.4 工藝驗證

根據最優工藝制備3批MTX-oxi-Ms@PTX/ICA。結果顯示，3批MTX-oxi-Ms@PTX/ICA中2個藥的總包封率分別為92.36%、92.01%、93.88%，平均為92.75%，與預測值（93.90%）相近，表明所建模型具有良好的預測性，優選的工藝穩定性與重現性良好。

2.4 MTX-oxi-Ms@PTX/ICA的表征

2.4.1 臨界膠束濃度

采用芘作為熒光探針進行臨界膠束濃度（criticalmicelleconcentration，CMC）測定[15]。將MTX-oxi-Ms@PTX/ICA稀釋至不同質量濃度（0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0mg/mL），然后向每個樣品中加入終濃度為6×10－7mol/L的芘，將混合物在室溫下避光孵育12h，使芘嵌入膠束的疏水核中。記錄激發波長340nm和發射波長300～400nm下的熒光光譜圖，并計算CMC。結果，MTX-oxi-Ms@PTX/ICA的CMC為0.0079mg/mL，明顯低于血液中膠束的降解濃度（約0.5mg/mL）[16]。

2.4.2 粒徑、多分散性指數和Zeta電位

使用納米粒度及Zeta電位分析儀測定MTX-oxi-Ms@PTX/ICA的粒徑、多分散性指數（polydispersityindex，PDI）和Zeta電位。為進一步評估膠束在氧化環境中的響應性，向MTX-oxi-Ms@PTX/ICA溶液中添加0.1mmol/L的H2O2，并在37℃下孵育2h，隨后測定膠束的粒徑、PDI和Zeta電位。另外，將MTX-oxi-Ms@PTX/ICA儲存于4℃環境中，分別于0、10、20、30d時取樣，測定其粒徑和PDI的變化情況，評價膠束的儲藏穩定性。

結果顯示，MTX-oxi-Ms@PTX/ICA的粒徑為（62.09±1.68）nm；加入H2O2后，粒徑收縮至（57.78±2.14）nm。其Zeta電位為（－2.47±0.15）mV，加入H2O2后升高至（－1.60±0.10）mV。其PDI較小（0.046±0.032），表明膠束分布均一；加入H2O2后PDI略增大，但仍低于0.30。

MTX-oxi-Ms@PTX/ICA在10、20和30d時的粒徑分別為（62.39±1.00）、（62.68±0.91）和（63.06±0.53）nm，相應的PDI分別為0.071±0.031、0.069±0.034和0.070±0.023。這表明在30d內膠束未發生明顯的聚集或沉淀，顯示出良好的穩定性。

2.5 膠束的體外釋放特點考察

采用透析袋法研究膠束在2種釋放介質中的體外釋放行為。釋放介質1為含5%吐溫80的PBS，釋放介質2為含5%吐溫80和1mmol/LH2O2的PBS。將1mLPTX/ICA游離藥溶液（含0.2mgPTX、0.3mgICA的甲醇溶液）和按最優工藝制備的Ms@PTX/ICA、MTX-oxi-Ms@PTX/ICA分別裝入分子截留量為8～14kDa的透析袋，浸入20mL釋放介質1中，在溫度37℃、轉速100r/min條件下振蕩。同法將MTX-oxi-Ms@PTX/ICA裝入透析袋并置于釋放介質2中，以評估其在氧化環境中的響應性。分別在4、8、12、24、48h時采集0.5mL釋放介質樣品（每次取樣后補充等體積新鮮介質），每個時間點重復取樣3次。利用HPLC法分別測定各樣品中PTX、ICA含量，計算各時間點的藥物釋放率[釋放率（%）＝釋放的藥物量/總藥量×100%]，并繪制體外釋放曲線（圖2）。

結果顯示，PTX/ICA游離藥溶液在48h內釋放了（92.66±2.87）%的PTX和（92.86±2.50）%的ICA，呈現出初期的突釋現象。48h內，MTX-oxi-Ms@PTX/ICA在釋放介質1中釋放了（61.46±3.91）%的PTX和（65.55±3.40）%的ICA，而在釋放介質2中釋放了（90.51±4.07）%的PTX和（88.75±2.22）%的ICA，表現出顯著的釋放增強現象。

2.6 膠束的體外靶向性評價

2.6.1 熒光顯微鏡觀察膠束體外攝取情況

由于PTX和ICA不具有熒光，因此本研究選用具有綠色熒光信號的Cou代替藥物，按“2.2”項下方法制備各熒光探針膠束，以此來評價膠束的體外細胞攝取情況。將RENCA細胞按1.6×105個/孔的密度接種于24孔板中，孵育24h。隨后，細胞被分為Blank-Ms組、Cou組、Ms@Cou組、MTX-Ms@Cou組、MTX-oxi-Ms@Cou組以及MTX-oxi-Ms@Cou+H2O2組（經0.1mmol/LH2O2誘導氧化應激[16]，下同）。各藥物組中Cou的終濃度均控制在3μmol/L[15]，每組設置3個復孔。加入各膠束后繼續孵育2h，加入DAPI室溫避光染色15min，利用熒光顯微鏡觀察并拍照。采用ImageJ軟件分析熒光強度。使用GraphPadPrism軟件進行數據分析，數據以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析和Scheffé檢驗，檢驗水準α＝0.05。結果見圖3。

結果顯示，Blank-Ms組細胞未觀察到綠色熒光信號，其余各組細胞均觀察到不同程度的熒光信號。其中，Cou組熒光強度（48192.00±11096.84）最低；Ms@Cou組熒光強度（175941.33±10509.75）較Cou組顯著升高（P＜0.05）；MTX-Ms@Cou組熒光強度（220732.33±23304.96）進一步高于Ms@Cou組（P＜0.05）；MTX-oxi-Ms@Cou組熒光強度（179027.00±6403.55）則較MTXMs@Cou組顯著降低（P＜0.05）。此外，MTX-oxi-Ms@Cou+H2O2組熒光強度（221047.33±12576.07）顯著高于MTX-oxi-Ms@Cou組（P＜0.05），但與MTXMs@Cou組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.6.2 流式細胞術考察膠束體外攝取情況

細胞分組、培養、給藥同“2.6.1”項下。將RENCA細胞在含藥培養基中培養1h后，用冷PBS洗滌3次，隨后，消化細胞并用0.3mLPBS重懸。通過流式細胞儀測定與細胞結合的Cou的熒光強度。按“2.6.1”項下方法進行統計分析。

結果顯示，Blank-Ms組的熒光強度（8.60±1.67）最低，Cou組熒光強度升高至553.00±37.80，而Ms@Cou組進一步升高至635.33±8.50。在MTX修飾后，MTXMs@Cou組的熒光強度達到702.33±12.42，顯著高于Ms@Cou組（P＜0.05）。MTX-oxi-Ms@Cou組的熒光強度為661.33±12.86。MTX-oxi-Ms@Cou+H2O2組的熒光強度（741.00±25.24）顯著高于MTX-oxi-Ms@Cou組（P＜0.01），且與MTX-Ms@Cou組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。流式細胞儀的測定結果與熒光顯微鏡觀察結果一致，進一步驗證了MTX-Ms@Cou在RENCA細胞中表現出更好的穿透性，藥物更容易在給藥部位蓄積。

2.7 膠束對RENCA細胞存活率的影響

采用CCK-8法測定。按2×104個/孔的密度將RENCA細胞接種于96孔板中，培養24h后，根據預實驗結果加入不同濃度的Blank-Ms（空白對照）和Ms@PTX/ICA、MTX-Ms@PTX/ICA、MTX-oxi-Ms@PTX/ICA以及MTX-oxi-Ms@Cou+H2O2（總藥物終濃度均設置為0.032、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00μmol/L），每個濃度設置5個復孔；并以DMEM培養基為空白對照。加入各膠束，繼續培養48h后棄培養液，向各孔中加入含10%CCK-8的培養液100μL，繼續孵育2h，于450nm波長處測定樣品吸光度（A），計算細胞存活率[細胞存活率（％）＝Ax/Ay×100％；式中，Ax為給藥孔細胞的A，Ay為空白對照孔細胞的A]，并計算各樣品對細胞的半數抑制濃度（halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50）。結果顯示，Ms@PTX/ICA、MTX-Ms@PTX/ICA、MTX-oxi-Ms@PTX/ICA和MTX-oxi-Ms@PTX/ICA+H2O2對細胞的IC50依次為（5.990±0.032）、（3.990±0.036）、（5.170±0.036）、（2.930±0.042）μmol/L。

2.8 膠束對RENCA細胞遷移、侵襲能力的影響

2.8.1 細胞遷移實驗

將Transwell小室置于24孔板中，用無血清1640培養基重懸RENCA細胞，以1.5×103個/孔的密度接種于小室上腔室；同時，在下腔室中加入600μL含10%胎牛血清的培養基。實驗分為Blank-Ms組（空白對照組）、Ms@PTX/ICA組、MTX-oxi-Ms@PTX/ICA組和MTXoxi-Ms@PTX/ICA+H2O2組（給藥組的總藥物終濃度均為20.00μmol/L）。將對應膠束加入各組小室的上腔室后，于37℃孵育12h。取出小室，用PBS清洗3次，并用棉簽刮除未通過膜的細胞。用4%多聚甲醛固定通過膜遷移的細胞30min，再用0.1%結晶紫溶液在室溫下染色20min。用PBS清洗染液，晾干后在顯微鏡下觀察、拍照并計算遷移細胞的平均數量。實驗重復3次。按“2.6.1”項下方法進行統計分析。結果見圖4、表4。結果顯示，與Blank-Ms組相比，Ms@PTX/ICA組遷移細胞數顯著減少（P＜0.05）；與Ms@PTX/ICA組比較，MTXoxi-Ms@PTX/ICA組、MTX-oxi-Ms@PTX/ICA+H2O2組遷移細胞數進一步減少（P＜0.05），但MTX-oxi-Ms@PTX/ICA組與MTX-oxi-Ms@PTX/ICA+H2O2組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.8.2 細胞侵襲實驗

將Matrigel基質膠（5μmol/L）在冰上融化，吸取30μL加入到Transwell小室上腔室，在37℃下孵育1h；在下腔室中加入600μL含10%胎牛血清的完全培養基。用無血清培養基將RENCA細胞重懸，并以5×104個/孔的密度接種于小室上腔室。實驗分組、給藥、培養同“2.8.1”項下。將小室置于37℃、5%CO2的培養箱中孵育24h。用棉簽輕輕擦拭上腔室，去除未侵襲的細胞。隨后，將小室置于4%多聚甲醛中固定20min，并用PBS清洗2次。用0.1%結晶紫溶液染色15min，再用PBS清洗多余染液。晾干后，在顯微鏡下觀察并計數穿過基質膠到達下腔室的細胞數目。實驗重復3次。按“2.6.1”項下方法進行統計分析。結果見表4、圖5。結果顯示，與Blank-Ms組相比，Ms@PTX/ICA組侵襲細胞數顯著減少（P＜0.05）；與Ms@PTX/ICA組相比，MTX-oxi-Ms@PTX/ICA組、MTX-oxi-Ms@PTX/ICA+H2O2組侵襲細胞數進一步減少（P＜0.05），但MTX-oxi-Ms@PTX/ICA組與MTX-oxi-Ms@PTX/ICA+H2O2組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.8.3 細胞劃痕實驗

將RENCA細胞以1×105個/孔的密度接種于6孔板中，置于培養箱中孵育24h，使細胞生長形成單層。用劃痕器在細胞層中央劃出一條直線形成劃痕模型，用PBS清洗2次，去除細胞碎片。實驗分組、給藥、培養同“2.8.1”項下。將細胞置于培養箱中，分別在0、12、24h時用倒置顯微鏡拍攝劃痕區域的圖片，記錄細胞愈合過程。使用ImageJ軟件分析并量化劃痕區域的寬度，計算細胞遷移的距離和速度，并計算各組細胞的劃痕愈合率[劃痕愈合率（%）＝（初始劃痕寬度－特定時間點劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%]。按“2.6.1”項下方法進行統計分析，結果見表4、圖6。結果顯示，與Blank-Ms組比較，Ms@PTX/ICA組細胞在12、24h后的劃痕愈合率均顯著降低（P＜0.05）；與Ms@PTX/ICA組比較，MTXoxi-Ms@PTX/ICA組、MTX-oxi-Ms@PTX/ICA+H2O2組細胞在12、24h后的劃痕愈合率進一步降低（P＜0.05），且MTX-oxi-Ms@PTX/ICA+H2O2組顯著低于MTX-oxi-Ms@PTX/ICA組（P＜0.05）。

3 討論

在腫瘤治療領域，開發高效且具有特異性的藥物遞送系統一直是研究的熱點與挑戰。本研究聚焦于提高PTX和ICA在腫瘤防治中的應用效能，通過協同毒性實驗探究了2種藥物抑制腎癌細胞增殖的協同效果。結果表明，在特定濃度范圍內，PTX與ICA的聯合使用能夠在低于單一藥物最大有效濃度的情況下，實現對腫瘤細胞更有效的抑制，這可能源于它們在細胞內作用機制的互補性。這一協同作用的發現不僅為藥物劑量的優化提供了科學指導，而且為臨床治療提供了堅實的實驗基礎。本研究創新性地制備了MTX-oxi-Ms@PTX/ICA膠束，并優化了膠束的最優制備工藝，在最優工藝條件下制備的膠束中PTX和ICA的包封率均超過90%，表明該制劑能夠高效地包裹并保護活性藥物成分，有助于減少藥物在儲存和體內循環過程中的泄漏，從而維持藥物的穩定性并提高其生物利用度。此外，MTX-oxi-Ms@PTX/ICA的CMC為0.0079mg/mL，表明該膠束具有較強的結構穩定性，能夠在體內避免因血液稀釋而導致的膠束解聚[16]。在體內血液循環過程中，膠束不可避免地會被血液稀釋，而低CMC的膠束能夠有效抵抗這種稀釋作用，防止膠束解聚，從而確保藥物能夠穩定存在并精準地靶向遞送至腫瘤部位。這一特性對于提高藥物在腫瘤組織中的濃度，減少對正常組織的毒副作用具有關鍵意義。

粒徑、PDI以及Zeta電位的測定結果表明，MTXoxi-Ms@PTX/ICA在水溶液中呈現穩定的分散狀態。這有利于膠束在體內的循環與分布，使其能夠更好地穿越生理屏障，抵達腫瘤組織。此外，本研究所制膠束的粒徑大小處于納米級別，這有助于膠束通過增強的滲透與滯留效應被動靶向腫瘤組織。30d的穩定性測試實驗進一步證實了該膠束優異的物理穩定性，這為其長期儲存和臨床應用提供了可能。值得注意的是，加入H2O2后，ROS敏感鍵斷裂，最外層PEG5000脫落，表現為粒徑尺寸收縮。這一現象揭示了膠束的氧化敏感特性。在腫瘤微環境中，由于存在較高水平的ROS，這種氧化敏感特性能夠觸發膠束結構的變化，進而促進藥物的釋放。這與腫瘤組織的特殊微環境相契合，腫瘤細胞在快速增殖過程中往往伴隨著氧化應激水平的升高，使得膠束能夠在腫瘤部位特異性地釋放藥物，提高治療效果并減少對正常組織的毒性。

本研究通過透析袋法對MTX-oxi-Ms@PTX/ICA的體外釋放行為進行了系統評估。實驗設計模擬了2種不同的生理環境：一種是接近生理條件的釋放介質1（含5%吐溫80的PBS），另一種是模擬腫瘤微環境中氧化應激條件的釋放介質2（含5%吐溫80和1mmol/LH2O2的PBS）。MTX-oxi-Ms@PTX/ICA在釋放介質1中表現出較為緩和的藥物釋放特性，這可能歸因于膠束在模擬生理條件下的穩定性。然而，在釋放介質2中，膠束的釋放行為顯著增強，這種氧化敏感性觸發了膠束結構的變化，導致藥物的快速釋放，從而實現了對腫瘤細胞的高效殺傷。

RENCA細胞存活率實驗結果顯示，MTX修飾顯著增強了膠束的抗腫瘤活性。MTX作為一種靶向配體，能夠與腫瘤細胞表面過度表達的葉酸受體特異性結合，從而提高膠束對腫瘤細胞的靶向性，使更多的藥物能夠進入腫瘤細胞內發揮殺傷作用。此外，MTX-oxi-Ms@PTX/ICA+H2O2對細胞的IC50低于MTX-oxi-Ms@PTX/ICA，這進一步證實了MTX-oxi-Ms@PTX/ICA具有ROS響應能力。在氧化應激條件下，膠束的外層水化層脫落，暴露出的靶向配體增強了腫瘤細胞對膠束的攝取能力，同時也促進了藥物的釋放，協同增強了抗腫瘤效果。體外攝取實驗進一步驗證了與非靶向膠束Ms@PTX/ICA相比，MTX修飾的膠束MTX-Ms@PTX/ICA在RENCA細胞中的攝取量顯著增加，表明MTX修飾提高了膠束對癌細胞的靶向效果。此外，細胞對MTX-oxi-Ms@Cou+H2O2的攝取效率高于MTX-oxi-Ms@Cou，再次驗證了ROS響應特性在增強膠束靶向性和藥物釋放中的重要性。這一系列結果表明，MTX-oxi-Ms@PTX/ICA通過整合靶向性、氧化敏感性和納米載體的優勢，有望提高腫瘤治療的精準性和有效性。

細胞遷移和劃痕實驗結果顯示，在高ROS水平下，MTX-oxi-Ms@PTX/ICA抑制RENCA細胞侵襲、遷移的能力變強。這一結果不僅證明了MTX-oxi-Ms@PTX/ICA能夠在高ROS環境下實現藥物的響應釋放，更重要的是揭示了其在抑制腫瘤轉移方面的潛力。本研究制備的膠束能夠在抑制腫瘤細胞增殖的同時，有效抑制其侵襲、遷移，為腫瘤的綜合治療提供了新的思路。

綜上所述，MTX-oxi-Ms@PTX/ICA在提高藥物穩定性、增強對RENCA細胞靶向性和抑制腫瘤侵襲、遷移等方面表現出優異的性能，這為腫瘤靶向治療提供了新的研究思路。本課題組后續將深入研究該膠束在動物模型中的體內靶向性及抗腫瘤作用機制，并進一步評估其在臨床應用中的可行性和安全性。