蒲公英總黃酮通過調控腸道菌群對小鼠肥胖的抑制作用機制

關鍵詞蒲公英總黃酮；肥胖；腸道菌群；脂肪代謝

肥胖是以體重超重為特點，由體內脂肪細胞蓄積過甚引起的慢性疾病，同時伴隨脂肪組織慢性炎癥反應[1]。隨著人們生活水平的提高，以脂質代謝異常為共同特征的相關代謝疾?。òǚ逝帧⑻悄虿　⑿难芗膊?、肝臟疾病、衰老等）發病率逐年升高，預計到2030年，我國成人超重及肥胖患病率將達到65.3%[2]。目前我國用于治療肥胖的藥物僅有奧利司他及胰高血糖素樣肽1受體激動劑（利拉魯肽），但伴隨如嘔吐、腹瀉等副作用[3]。肥胖屬中醫“肥滿”范疇，以腹部肥滿、腰圍增粗為主要表現，即《內經》所謂的“縱腹垂腴”，以健脾化濕為主要治法，并兼用行氣解郁、清瀉胃火、活血化瘀等治則[4]。臨床實踐顯示，中醫藥防治肥胖具有多途徑、多環節、多靶點的特點，且具有療效確切、不良反應少等優勢[5]。

蒲公英味苦而甘，入肝胃經，具有清熱解毒、利尿、活血的功效。研究表明，其黃酮類成分對代謝綜合征具有潛在的治療作用[6]。有研究報道，腸道微生物尤其是菌群與肥胖之間關系密切，對機體的能量代謝紊亂及修復至關重要[7]；菌群若失調，將通過增加腸黏膜通透性、誘導低水平慢性炎癥反應等途徑誘發肥胖[8]。因此，本研究初步探討蒲公英總黃酮對小鼠飲食性肥胖的干預作用及其對小鼠腸道菌群的影響，探討其可能的作用機制，以期為肥胖的治療提供理論依據。

1 材料

1.1 主要儀器

680型酶標儀購自美國Bio-Rad公司；KDC-160HR型高速冷凍離心機購自科大創新股份有限公司中佳分公司；50TS8型洗板機購自美國BioTek公司；JXFSTPRP-48型研磨儀購自上海凈信實業發展有限公司；AL204型電子天平購自瑞士MettlerToledo公司；NanoDropOne型超微量分光光度計、QuantStudioTM6Flex型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）儀、Arktik型梯度PCR儀均購自美國ThermoFisherScientific公司；PE300型NextSeq2000測序儀購自美國Illumina公司。

1.2 主要藥物與試劑

蒲公英總黃酮（純度50%）委托南京澤郎生物科技有限公司提取、制備；FastPureCell/TissueTotalRNAIsolationKitV2（批號7E760C3）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；逆轉錄試劑盒、SYBRGreenqPCRMasterMix（批號分別為H1201881、H7327110）均購自上海翌圣生物科技股份有限公司；總膽固醇（totalcholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-densitylipoproteincholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-densitylipoproteincholesterol，HDL-C）試劑盒（批號分別為20240229、20240115、20240315、20240314）均購自南京建成生物工程研究所；糞便基因組DNA提取試劑盒（批號Y2023）購自天根生化科技（北京）有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活劑1α（peroxisomeproliferatoractivatedreceptorgammacoactivator1alpha，Ppargc1α）、乙酰輔酶A羧化酶1（acetyl-CoAcarboxylase，ACC1）、細胞色素c氧化酶亞基7A1（cytochromecoxidasesubunit7A1，COX7A1）、COX8B引物由北京睿博興科生物技術有限公司設計、合成。

1.3 實驗動物與飼料

6周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠24只，體重20～22g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[生產許可證號為SCXK（魯）20230002]，飼養于河南中醫藥大學動物實驗中心（室溫20～25℃，相對濕度50%～70%，每12h光照/黑暗循環），自由進食、飲水。高脂飼料（含60%脂肪，批號D12492）購自江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司；普通飼料（批號20230815）購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。本研究方案經河南中醫藥大學實驗動物福利倫理委員會審查和批準（倫理號為IACUC-202312030）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

小鼠適應性喂養1周后，隨機分為空白組、模型組（生理鹽水，0.2mL/只）、蒲公英總黃酮組[400mg/（kg·d），0.2mL/只，根據蒲公英中藥材給藥劑量結合小鼠體表面積折算]，每組8只。除空白組外，其余兩組小鼠給予高脂飼料喂養持續造模8周。與此同時，蒲公英總黃酮組小鼠灌胃相應藥液，空白組和模型組灌胃生理鹽水，每天1次，連續8周。每周監測各組小鼠表觀和體重變化，并記錄每周前后其食物質量變化，即進食量。若監測到模型組小鼠較空白組小鼠體重平均值增加20%以上，判斷為模型構建成功[8]。

2.2 實驗取材

末次給藥后，留取小鼠糞便，置于凍存管中，于－80℃下凍存，備測；留取小鼠眼球血，置于1.5mL離心管中，于2～8℃下靜置2h后，于4℃下以3500r/min離心15min，吸取上層血清，于－40℃下保存，備測；取少量肝臟組織，一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，備測，另一部分于－80℃下凍存，備測；取皮下腹股溝白色脂肪組織（inguinalwhiteadiposetissue，iWAT）、附睪白色脂肪組織（epididymalwhiteadiposetissue，eWAT）、腎周白色脂肪組織（perirenalwhiteadiposetissue，pWAT），稱定并記錄質量，然后將一部分eWAT置于4%多聚甲醛溶液中固定，其余脂肪組織于－80℃下凍存，備測。

2.3 小鼠脂肪指數的測定

觀察各組小鼠iWAT、eWAT、pWAT大小、厚度和顏色，稱定質量并按下式計算脂肪指數：脂肪指數＝脂肪質量/小鼠體重。

2.4 小鼠血清血脂水平檢測

取“2.2”項下小鼠血清樣本，根據相應試劑盒說明書操作，使用酶標儀測定各組小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

2.5 小鼠肝臟和脂肪組織病理形態觀察

取“2.2”項下固定的小鼠肝臟組織和eWAT，采用蘇木精-伊紅（HE）染色，置于顯微鏡下觀察小鼠上述組織的病理形態變化，并拍照。

2.6 小鼠腸道菌群分析

取“2.2”項下各組小鼠糞便樣本，使用糞便基因組DNA提取試劑盒從小鼠糞便樣本中提取細菌DNA。采用16SrRNA（V3～V4）擴增子測序方法，使用測序儀分析小鼠腸道菌群的豐度及多樣性。采用QIIME平臺對序列進行生物信息學分析，其中序列同源性高于97%的序列歸屬于相同的操作性分類單元（operationaltaxonomicunit，OTU），基于Greengenes數據庫（http：//greengenes.secondgenome.com/）的選擇策略選擇OTU表。采用Shannon和Sobs指數代表微生物中物種的α多樣性，采用線性判別分析（lineardiscriminantanalysis，LDA），以LDA評分絕對值≥3.0作為標準，鑒別發揮潛在作用的關鍵細菌?；诿兰镌破脚_（https：//www.majorbio.com/）分析腸道微生物組健康指數（gutmicrobiomehealthindex，GMHI），該值側重確定患病的可能性，獨立于臨床診斷，用以評估健康狀況。根據未加權的UniFrac距離，采用QIIME平臺進行主坐標分析用以展示微生物中物種的β多樣性。

2.7 小鼠肝臟脂肪代謝相關基因表達的檢測

取“2.2”項下各組小鼠凍存的肝臟組織，稱取20mg，提取總RNA。根據逆轉錄試劑盒說明書將RNA轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行qPCR擴增。反應體系包括：SYBRGreen混合液5μL、cDNA樣品1μL、正向引物0.2μL、反向引物0.2μL，加水至10μL。擴增條件如下：95℃預變性2min；95℃變性10s，60℃退火30s，共循環40次。以GAPDH為內參，采用2－ΔΔCt法計算與脂肪合成與分解相關基因[9]的mRNA表達水平。引物序列及產物長度見表1。

2.8 統計學方法

采用SPSS23.0軟件對數據進行統計分析，并使用GraphPadPrism9.5軟件制圖。滿足正態分布的計量資料以x±s表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較使用LSD-t檢驗。腸道菌群相關分析中，α、β多樣性以及菌群健康指數的分析組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 蒲公英總黃酮對小鼠表觀變化的影響

在造模第4周時，模型組小鼠體重平均值增加20%以上，說明造模成功?？瞻捉M小鼠體態正常，活潑好動。與空白組比較，模型組小鼠體態寬胖，毛發油膩，身體倦怠少動。與模型組比較，蒲公英總黃酮組小鼠體重降低，活動較為靈活，被毛油脂明顯減少。

3.2 蒲公英總黃酮對小鼠體重、進食量和脂肪質量的影響

實驗期間，小鼠體重由高到低為模型組＞蒲公英總黃酮組＞空白組，見圖1A；體重上漲速率由高到低為模型組＞蒲公英總黃酮組＞空白組，見圖1B。蒲公英總黃酮組小鼠的進食量與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1C。與模型組比較，蒲公英總黃酮組小鼠iWAT、eWAT的脂肪指數顯著降低（P＜0.05），見圖1D。

3.3 蒲公英總黃酮對小鼠血脂水平的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均顯著升高，HDL-C水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，蒲公英總黃酮組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均顯著降低，HDL-C水平顯著升高（P＜0.01）。結果見表2。

3.4 蒲公英總黃酮對小鼠肝臟和脂肪組織病理變化的影響

小鼠肝臟組織病理切片結果顯示，空白組小鼠肝細胞未見任何病理改變；與空白組比較，模型組小鼠肝臟可見大量肝細胞脂肪空泡變性；與模型組比較，蒲公英總黃酮組小鼠肝細胞脂肪空泡變性程度明顯減輕，僅少量肝細胞存在空泡變性。結果見圖2。

小鼠eWAT病理切片結果顯示，空白組小鼠附睪脂肪細胞大小均勻，分布密集；與空白組比較，模型組小鼠附睪脂肪細胞數量減少，脂肪細胞直徑大小和橫截面積增加；蒲公英總黃酮組小鼠附睪脂肪細胞數量仍較空白組少，但脂肪細胞直徑較模型組變小。結果見圖2。

3.5 蒲公英總黃酮對小鼠腸道菌群的影響

3.5.1 腸道菌群OTUs數與多樣性

腸道菌群分析結果顯示，3組小鼠糞便樣品共有OTUs378個，其中空白組與模型組小鼠共有59個，空白組與蒲公英總黃酮組小鼠共有55個，模型組與蒲公英總黃酮組小鼠共有338個。α多樣性分析結果顯示，蒲公英總黃酮處理后，蒲公英總黃酮組菌群多樣性有上升趨勢，Shannon指數與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05），Sobs指數則較模型組顯著升高（P＜0.05），見圖3A～3B。β多樣性分析結果顯示，蒲公英總黃酮組和模型組分為2個較為明顯的不同簇，β多樣性差異有統計學意義（P＜0.05），提示2組小鼠腸道菌群結構有明顯差異，見圖3C。小鼠健康狀況評估結果顯示，蒲公英總黃酮組GMHI顯著高于模型組（P＜0.01），見圖3D。

3.5.2 腸道菌群組成與相對豐度

與空白組比較，模型組和蒲公英總黃酮組的Blautia（經黏液真桿菌屬）、Dubosiella（杜氏菌屬）、Colidextribacter、Faecalibaclum（糞桿菌屬）、norank_f_OscillospiraOscillospiraceae的相對豐度升高，norank_f_MuLachnospiraceae_NK4A136_group（毛螺菌科NK4A136組）、Bacteroides（擬桿菌屬）、Alistipes（另枝菌屬）的相對豐度降低。與模型組比較，蒲公英總黃酮組的經黏液真桿菌屬、擬桿菌屬、另枝菌屬、unclassified_f_Oscillospiraceae及Rikenella（理研菌屬）的相對豐度升高，杜氏菌屬、Colidextribacter、糞桿菌屬、Roseburia（羅氏菌屬）及Lactobacillus（乳桿菌屬）的相對豐度下降。結果見圖4。

3.5.3 腸道差異菌群種屬水平

在屬水平對模型組和蒲公英總黃酮組進行差異菌群篩選。結果顯示，在屬水平上，經黏液真桿菌屬、norank_f_Ruminococcaceae、Bilophila（嗜膽菌屬）、另枝菌屬、classified_f_Ruminococcaceae、Parabacteroides（副擬桿菌屬）、norank_f_Desulfovibrionaceae、Anaerotruncus（厭氧短桿菌屬）的菌群相對豐度顯著升高（P＜0.05），糞桿菌屬、Erysipelatoclostridium（丹毒梭菌屬）、GCA-900066575、Tuzzerella（梭菌屬）、乳桿菌屬、norank_f_norank_o_RF39、achnospiraceae_FCS020_group的菌群相對豐度顯著下降（P＜0.05），見圖5。在種水平上，將是否有培養方法作為篩選標準，Lachnospiraceae_bacterium_28-4（毛螺菌屬28-4），Bacteroides_vulgatus（普通擬桿菌）菌群相對豐度顯著升高（P＜0.05），Faecalibaculum_rodentium（嚙齒糞桿菌）、Lactobacillus_murinus（鼠乳桿菌）的相對豐度顯著下降（P＜0.05），見圖6。

3.6 蒲公英總黃酮對小鼠脂肪代謝相關基因的影響

與空白組比較，模型組小鼠肝臟組織中Ppargc1α、COX7A1、COX8BmRNA表達水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，蒲公英總黃酮組小鼠肝臟組織中COX7A1、COX8BmRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見表3。

4 討論

4.1 蒲公英總黃酮可降低肥胖小鼠肝臟脂肪量

相關研究表明，植物黃酮類成分在肥胖的治療中發揮了巨大的作用，如多甲氧基黃酮可能通過調節脂肪因子的水平和干預腸道微生物及其代謝產物等途徑，增強胰島素活性，改善胰島穩態，調節機體糖脂代謝[10]；高粱米糠黃酮可以抑制肥胖小鼠體內脂質蓄積，并顯著改善高血糖、胰島素抵抗及瘦素抵抗[11]；大豆異黃酮[12]、青錢柳黃酮[13]、胡柚黃酮[14]等均對肥胖具有良好的治療作用。肥胖常伴隨脂肪在組織中的積累（異位脂肪沉積在肝臟、心臟、骨骼肌等），繼而導致高脂血癥、糖尿病、心血管疾病等[15]。高脂血癥的特征是血清中TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低[16]。據報道，正常水平范圍的LDL-C與HDL-C共同作用，可以調節體內膽固醇含量，降低心血管疾病風險[17]。本研究通過高脂飲食建立肥胖小鼠模型，探討了蒲公英總黃酮對肥胖小鼠脂質代謝的影響，結果顯示，給予蒲公英總黃酮干預可以逆轉肥胖小鼠肝細胞脂肪變性，恢復脂肪細胞的健康狀態，顯著降低小鼠血清TC、TG、LDL-C水平，提高血清HDL-C水平，說明蒲公英總黃酮對血脂水平具有調節作用，能夠改善肥胖小鼠的高脂血癥。

4.2 蒲公英總黃酮可調控小鼠腸道菌群結構

高脂飲食會導致腸道菌群多樣性降低、菌群結構紊亂，伴隨有益菌減少及致病菌增加。相關報道表明，腸道菌群在肥胖、胰島素抵抗等代謝性疾病的發生和發展中起至關重要的作用[18]。本研究結果顯示，蒲公英總黃酮能夠緩解肥胖小鼠體重增加，降低iWAT和eWAT的脂肪指數，在治療肥胖中具有潛在價值；蒲公英總黃酮還能夠增加肥胖小鼠腸道菌群多樣性，提高腸道菌群GMHI；在屬水平上，蒲公英總黃酮上調黏液真桿菌屬、另枝菌屬、瘤胃球菌屬、副擬桿菌屬，下調糞桿菌屬、丹毒梭菌屬、梭菌屬和乳桿菌屬。研究表明，黏液真桿菌屬與內臟脂肪呈負相關，而內臟脂肪被認為是發生心血管和代謝疾病風險的肥胖生物標志物[19]。Parker等[20]研究顯示，另枝菌屬與肝硬化、非酒精性脂肪性肝病或非酒精性脂肪性肝炎等肝性疾病呈負相關；Liao等[21]研究發現，嚙齒類桿菌是一種在肥胖大鼠中容易富集的細菌；Luo等[22]研究發現，丹毒梭菌屬在經過高脂飼料喂養過的小鼠腸道中顯著上升，乳桿菌屬中有部分菌株可能會導致體重增加，而其他菌株可能會導致體重減輕。本研究結果顯示，蒲公英總黃酮可以調節有關肥胖治療相關菌屬的相對豐度，上調有益菌屬，下調有害菌屬。在種水平上，蒲公英總黃酮上調的毛螺菌屬28-4是肥胖及肥胖抵抗組小鼠的關鍵菌種，與肥胖呈負相關[23]；下調的嚙齒糞桿菌是葡萄糖轉運體1條件性基因敲除小鼠中的另一種富集微生物，雖然是短鏈脂肪酸產生者并且能發揮抗癌作用，但微生物的短鏈脂肪酸可能為宿主提供額外的能量進而促進肥胖[24]。由此可知，蒲公英總黃酮具有調節肥胖腸道菌群向健康狀態恢復的功能，這表明在經蒲公英總黃酮調控后的菌群可能存在輔助減緩肥胖的作用。

4.3 蒲公英總黃酮可促進高脂飲食小鼠的脂肪氧化

ACC1是脂肪酸合成過程的關鍵限速酶，可催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A，為脂肪酸的合成提供底物[25]。Ppargc1α基因參與調控線粒體的生成、能量轉換以及脂肪細胞的成熟等生理功能，并通過影響這些關鍵的代謝途徑，影響維持機體的能量平衡和細胞功能[26]。本研究發現，肥胖小鼠在經過蒲公英總黃酮處理后，ACC1、Ppargc1αmRNA的表達同模型組比較無明顯變化，表明蒲公英總黃酮并不影響丙二酰輔酶A的合成，說明兩組小鼠脂肪酸的合成無明顯差異。COX是線粒體電子傳遞鏈中的重要復合體，線粒體相關基因COX7A1、COX8B在脂肪酸氧化途徑中發揮重要作用[27]。本研究中肥胖小鼠在經蒲公英總黃酮處理后，COX7A1、COX8BmRNA的表達明顯上調，表明蒲公英總黃酮能促進肥胖小鼠脂肪的氧化，從而降低體重，抑制肥胖。

綜上所述，蒲公英總黃酮可改善高脂飲食肥胖小鼠體重及病理損傷，可能通過上調脂肪的COX7A1、COX8BmRNA改善高脂血癥；這一作用與其上調肥胖治療有益菌群、下調有害菌群從而改善肥胖所致微生態紊亂有關。