防腐劑羥苯甲酯和對羥基苯乙酮皮膚局部刺激性及駐留量和透皮量研究

[摘要]目的：評估防腐劑羥苯甲酯和對羥基苯乙酮皮膚局部刺激和皮膚中暴露量。方法：應用雞胚絨毛膜尿囊膜模型評估皮膚局部刺激；應用巴馬小型豬皮膚模型評估防腐劑經皮透過量和皮膚中駐留量。結果：雞胚試驗確定羥苯甲酯在濃度≤0.2%時，無刺激性。對羥基苯乙酮在濃度≤1.0%時，無刺激性。離體透皮試驗表明，面膜貼敷20 min、1 h和2 h后，羥苯甲酯和對羥基苯乙酮在皮下接收液和皮膚中均有暴露，且皮膚中駐留量遠高于皮下接收液的量。在貼敷20 min時，兩種防腐劑在皮膚中駐留量分別約是皮下接受液含量的14和12倍。離體透皮試驗也顯示，透明質酸能降低羥苯甲酯和對羥基苯乙酮經皮透過量，但能顯著增加兩者在角質層和真皮層皮膚中暴露量。皮膚中暴露與安全性分析顯示，羥苯甲酯在真皮層中2個時間點的濃度均高于細胞毒性濃度，可能存在潛在局部皮膚毒性。對羥基苯乙酮有效抑菌濃度和安全濃度相差較小，長時間貼敷面膜，皮膚中駐留量累積也可能產生潛在副作用。結論：本方法可用于評估化妝品中防腐劑局部皮膚刺激和經皮透過量和皮膚中駐留量，為化妝品防腐劑的安全性評估提供一種評估方法。

[關鍵詞]羥苯甲酯；對羥基苯乙酮；雞胚絨毛膜尿囊膜模型；巴馬小型豬模型；皮膚駐留量；皮膚刺激性；經皮透過量

[中圖分類號]R943" " [文獻標志碼]A" " [文章編號]1008-6455（2025）02-0001-06

Study on Local Irritation and Skin Resident Amount and Penetration of Methyl Para-hydroxybenzoate and P-hydroxy-acetophenone Preservatives

LI Hewei， DAI Ying， WEI Guozhi

（ Changzhou Weibo Hi-Tech Co.Ltd .， Changzhou 213000， Jiangsu， China ）

Abstract： Objective" To evaluate the local skin irritation and exposure in skin for methyl para-hydroxybenzoate and p-hydroxy-acetophenone preservatives. Methods" The chorioallantoic membrane vascular assay was used to evaluate local skin irritation， while the Bama miniature pig skin model was used to evaluate transdermal penetration and skin resident amount of preservatives. Results" The chorioallantoic membrane vascular test determined that methyl para-hydroxybenzoate at a concentration of ≤0.2% was non-irritating， whereas p-hydroxy-acetophenone at a concentration of ≤1.0% was non-irritating. The in vitro transdermal penetration test showed that after 20 minutes， 1 hour， and 2 hours of facial mask application， both methyl para-hydroxybenzoate and p-hydroxy-acetophenone were exposed in the receiver solution and skin， and the resident amount in the skin was much higher than the amount of receiver solution， with approximately 14 and 12 times， respectively. Hyaluronic acid can reduce transdermal penetration of methyl para-hydroxybenzoate and p-hydroxy-acetophenone， but can significantly increase resident amount in the stratum corneum and dermis. The analysis of exposure in skin and safety showed that the concentration of methyl para-hydroxybenzoate at two time points in the dermis was higher than the cytotoxic concentration， indicating potential local skin toxicity. The effective bacteriostatic concentration of p-hydroxy-acetophenone and the safe concentration differ only slightly， and long-term use of facial masks may result in cumulative resident amount in skin and potential side effects. Conclusion" This method can be used to evaluate the local skin irritation and percutaneous penetration of preservatives in cosmetics and the retention of preservatives in the skin， providing an evaluation method for the safety evaluation of cosmetic preservatives.

Key words： methyl para-hydroxybenzoate; p-hydroxy-acetophenone; chorioallantoic membrane vascular assay; Bama miniature pig skin model; resident amount in skin; shin irritation; percutaneons penetration

化妝品不良反應主要為皮膚刺激導致的過敏性皮炎，占化妝品不良反應的絕大多數[1-2]，其中由于防腐劑引起的皮膚過敏反應在多個文獻中已被報道[3-4]。面膜在化妝品領域中占有重要的位置，在貼敷時與皮膚接觸面積較大，會導致更多的防腐劑滲透進入皮膚，增加面部皮膚中暴露量，可能產生更大的皮膚刺激，甚至長期駐留在皮膚內導致皮膚損害。

化妝品的防腐劑主要包括4大類，甲醛供體類、苯甲酸及其衍生物類、醇類和其他有機化合物[2]。羥苯甲酯是經典的防腐劑，一直在化妝品中被廣泛使用[5]，但由于皮膚過敏反應，在化妝品中安全使用一直存在爭議[6]。有文獻研究羥苯甲酯抗菌有效性濃度是0.1%，但0.04%濃度會產生一定細胞毒性[7]。在《化妝品安全技術規范》2015年版和2022年征求意見稿中規定羥苯甲酯最大允許使用濃度單一酯為0.4%。對羥基苯乙酮近年在化妝品領域中也開始逐漸被越來越多的產品使用，但在《化妝品安全技術規范》2015年版和2022年征求意見稿中尚未規定該防腐劑用量上限。皮膚刺激文獻研究發現在質量分數為2%時，對羥基苯乙酮無刺激性，體外多肽反應為陰性，對細胞存活半數抑制濃度為3.1%[8]。在對羥基苯乙酮抑菌有效性研究中，對3種細菌的最低有效濃度為5.0 mg·ml-1（相對于0.5%）[9]。在另一個以水蚤作為研究對象的急性毒性試驗中，對羥基苯乙酮半數毒性量為64 mg·L-1[10]。這些研究數據均揭示這些化妝品中防腐的安全使用值得更多關注。

一般來說，面膜的面積較大，加入的防腐絕對量較多。這些防腐劑不僅與皮膚表面接觸可能產生局部皮膚刺激性，也可能長時間駐留在皮膚內部和進入系統血液循環中，導致其他刺激性，甚至細胞毒性。本研究以羥苯甲酯和對羥基苯乙酮作為研究對象，以雞胚絨毛膜尿囊膜模型（Chorioallantoic membrane vascular assay，CAMVA）評估兩種防腐劑的局部皮膚刺激性；應用巴馬小型豬皮膚模型，采用離體透皮試驗評估兩種防腐劑在貼敷不同時間后從面膜中滲透到皮下接收液和駐留到皮膚中（角質層和真皮層）暴露量。

1" 材料和方法

1.1 儀器：BSA323S（精度0.001 g）電子天平（德國賽多利斯公司）和PR224ZHE型（精度0.0 001 g）電子天平（沙鷹科學儀器有限公司）；LC-2030C型高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV-2600型紫外檢測器（日本島津公司）；TT-B（D）型Franz透皮試驗儀（天津市正通科技有限公司）；TD6M型臺式低速離心機（昆山祥辰酉五金機電有限公司）；pH計[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；BIO-DL型移液槍（賽多利斯公司）；LHS-100F恒溫恒濕培養箱（上海精其儀器有限公司）；XT-02C體視顯微鏡（上海浦柘光電儀器有限公司）；裕達牌全自動孵化機（裕達孵化設備廠）；F6/10型電動均漿機（上海凈信實業發展有限公司）。

1.2 材料：羥苯甲酯對照品（純度：≥98%，上海詩丹德標準技術服務有限公司）；對羥基苯乙酮對照品（純度：≥98%，上海詩丹德標準技術服務有限公司）；羥苯甲酯原料（廣州市榮宸生物科技有限公司）；對羥基苯乙酮原料（肌理夫人）；透明質酸（分子量：7 000，華熙生物科技股份有限公司）；Welch Xtimate C18-WR（150 mm×4.6 mm，5μm）（上海月旭科技股份有限公司）；濾膜（0.22μm，天津津騰公司）；色譜純乙腈（Fisher公司）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；生理鹽水，三氟乙酸，十二烷基硫酸鈉（SDS）等均為分析純（北京化工集團股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 CAMVA試驗

1.2.1.1 試驗步驟：參考文獻方法[10]，結合企業制訂的標準操作規程，將雞胚置于恒溫恒濕箱中孵育9 d（溫度37℃1℃，濕度50%～70%）。選取已受精和有活性的雞胚，用牙科鋸齒彎鑷剝去帶標記的蛋殼，暴露白色蛋膜，應小心操作不破壞蛋膜完整性。隨機分組，陰性對照組（0.9% NaCl溶液），陽性對照組（1.0% SDS溶液），試驗組。用塑料吸管將受試防腐劑溶液（羥苯甲酯用5%丁二醇溶解，分別配成質量濃度為0.1%，0.2%和0.4%的溶液；對羥基苯乙酮用水加熱溶解，分別配成質量濃度為0.5%，1%和2%的溶液）滴于蛋白膜血管富集處，反應3 min后，用0.9% NaCl溶液沖洗至樣品無明顯殘留并可清晰觀察膜血管，3次。根據如下方程1和表1中評分標準計算刺激得分。

1.2.1.2 CAMVA 判定標準：采用反應時間法進行試驗，采用式（1）計算刺激評分（Irritation score，IS）。

（1）

公式中sec H（出血時間）：CAM膜上觀察到開始發生出血的平均時間；sec L（血管融解時間）：CAM膜上觀察到開始發生血管融解的平均時間；sec C（凝血時間）：CAM膜上觀察到開始發生出現凝血的平均時間；所有時間單位均為s。判定標準為：IS＜1，無刺激；1≤IS＜5，輕微刺激；5≤IS＜9，中度刺激；IS＞10，強刺激。評分標準見表1。

1.2.2 離體豬皮透皮試驗

1.2.2.1色譜條件：色譜柱為C18（4.6 mm×150 mm，5.0μm）；流動相為0.1%三氟乙酸乙腈：0.1%三氟乙酸水溶液（30∶70）；流速1.0 ml·min-1；柱溫30℃，檢測波長 254 nm；進樣量20μl。

1.2.2.2 離體豬皮制備：巴馬小型豬處死后立即剪取腹部皮膚，剝離皮下脂肪和結締組織，用95%酒精棉球反復擦拭皮膚表面，再用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分，備用。

1.2.2.3 試驗步驟：參考文獻方法[11-12]，應用Franz透皮擴散儀進行透皮試驗。樣品接收液：生理鹽水5 ml（含有1.0%丁二醇），至與皮膚完全接觸無氣泡，試驗開始前平衡30 min。皮膚使用濾紙吸干水分放置于接收池頂面，皮膚角質層向上，暴露的皮膚面積為0.71 cm2。樣品溶液（含3%丁二醇的甲醇）加入至透皮供給池內（生理鹽水溶液）。擴散池溫度（320.5）℃，攪拌速度450 rpm/min，取樣時間點20 min、1 h、2 h。①皮膚角質層駐留：參考文獻方法[13]，用棉球擦拭干凈皮膚表面殘留物，再用生理鹽水沖洗皮膚表面3次，然后膠帶粘貼法粘貼表皮20次，將角質層粘下，并將膠帶置于20 ml甲醇中超聲提取。②皮膚真皮層駐留：將剩余部分剪碎，在勻漿機內加入20 ml 50%甲醇溶液進行勻漿處理，離心，取上清液。皮下接收液：取接收液1.0 ml，0.22μm微孔濾膜過濾后超聲脫氣1 min進樣，取樣后向接收池內補充同體積接收液。在考察透明質酸對防腐劑皮膚透過和皮膚內駐留影響時，在給予池中同時加入含有1%透明質酸溶液。將上述各個樣品在高效液相（HPLC）儀器中進樣分析，隨行進樣兩種防腐劑對照品溶液（質量濃度8μg·ml-1），采用“1.2.2.1色譜條件”項下色譜方法進行HPLC含量測定分析。通過HPLC儀器積分獲得樣品中防腐劑的積分面積，再將樣品中防腐劑峰面積代入其對照品線性（2.2.2項下）方程中，應用線性方程計算獲得上述樣品中防腐劑的質量濃度（Ci和Cn）。試驗過程和主要樣品制備見圖1。

1.2.2.4 數據分析：單位面積皮膚內駐留量，按如下公式（2）計算：

式中Qr（μg·cm-2）代表面膜中防腐劑在某個時間點的單位面積皮膚內駐留量；Ci（μg·ml-1）代表在“1.2.2.3“項下不同時間點的①和②中防腐劑濃度；Vi（ml）代表提取溶液體積（20 ml）；S（cm2）代表擴散池暴露皮膚面積（離體豬皮：0.71 cm2）。

單位面積皮膚上面膜中防腐劑經皮累積透過量采用文獻[14]的公式（3）計算：

式中Qt（μg·cm-2）代表面膜中防腐劑在某個時間點的單位面積累積透過量；Cn（μg·ml-1）代表不同時間點防腐劑在接收液中濃度；Vrec（ml）代表接收液體積（5.0 ml）；Ct（μg·ml-1）代表在Cn前一個時間點的防腐劑在接收液中濃度；Vt（ml）代表取樣體積（1.0 ml）。單因素方差分析（Tukey-Kramer HSD檢驗）比較均值，以P＜0.05表示差異有統計學意義。本研究中數據統計分析均由JMP 11.0.0平臺實現（SAS Institute Inc.）。

2" 結果

2.1 CAMVA試驗結果：結果顯示為雞胚接觸羥苯甲酯和對羥基苯乙酮之前和接觸3 min之后顯微鏡下觀察的結果。在接觸防腐劑之前，雞胚CAM膜上的血管網絡呈現正常狀態，清晰且連續。在與0.1%和0.2%濃度的羥苯甲酯以及0.5%和1.0%濃度的對羥基苯乙酮接觸后，血管網絡保持了原有的清晰度和連續性，未出現異常的擴張或收縮現象，也沒有出血、凝血或血管融解的情況（見圖2A～E、G～K）。然而，在0.4%濃度的羥苯甲酯（見圖2F）和2.0%濃度的對羥基苯乙酮（見圖2L）接觸后，雖然血管網絡整體上仍然清晰且連續，沒有明顯的擴張或收縮，但在個別小血管中觀察到了輕微的出血和凝血現象（見圖2F、L），高濃度羥苯甲酯接觸后局部毛細血管末端出現輕微溶解現象（見圖2F）。

CAMVA試驗結果顯示，0.9% NaCl作為陰性對照，IS值是0.0。1%SDS作為陽性對照，IS值范圍在10～19，陰性和陽性對照的IS值證明CAMVA實驗結果可靠。羥苯甲酯在濃度為0.4%時，IS值為2.3，顯示了輕微刺激；在濃度≤0.2%時，IS值小于1，無刺激性。對羥基苯乙酮在濃度為2%時，IS值為3.9顯示了輕微刺激；在濃度≤1.0%時，IS值小于1，無刺激性。在CAMVA試驗中，對羥基苯乙酮對局部皮膚安全性的濃度是羥苯甲酯的5倍。見表2。

2.2 HPLC測定羥苯甲酯和對羥基苯乙酮經皮滲透和皮膚中駐留量方法學驗證結果

2.2.1 對照品溶液制備：精密稱取羥苯甲酯和對羥基苯乙酮對照品各約20 mg，加入甲醇溶解并定容于10 ml量瓶中，搖勻，即得濃度約為2.0 mg·ml-1的對照品儲備溶液，備用。

2.2.2 線性關系考察：用移液槍量取兩種防腐劑對照品溶液不同體積，再用甲醇進行稀釋，配制系列對照品溶液，羥苯甲酯和對羥基苯乙酮質量濃度均為200、80.0、16.0、8.0、4.0、0.4μg·ml-1。以濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），分別繪制標準曲線，得羥苯甲酯回歸方程分別為Y=54 000X+55 280，r=0.999 7；對羥基苯乙酮回歸方程為Y=28 053X+34 617，r=0.999 7。結果表明，羥苯甲酯和對羥基苯乙酮均在0.4～200μg·ml-1內線性關系良好。

2.2.3 精密度試驗：配置羥苯甲酯（8μg·ml-1）和對羥基苯乙酮（8μg·ml-1）混合對照品溶液，精密吸取對照品溶液20μl，分別于同1 d之內連續進樣測定6次，并在3 d之內連續進樣測定，記錄峰面積。結果顯示兩者日內精密度RSD分別為1.94%和0.99%，日間精密度RSD分別為2.33%和1.13%。

2.2.4 穩定性試驗：精密量取供試品溶液20μl（透皮接收液和皮膚內樣品），放置在室溫條件下，分別于0、1、2、4、8 h測定峰面積，結果顯示2個供試樣品中羥苯甲酯和對羥基苯乙酮峰面積RSD分別為1.84%、0.83%和1.37%、2.17%，表明供試品溶液在室溫條件下8 h內穩定性良好。

2.2.5 回收率試驗：在已知高（10μg·ml-1）、中（5μg·ml-1）、低（0.5μg·ml-1）3個濃度的溶液中按1∶1比例分別加入高、中、低3個濃度的羥苯甲酯和對羥基苯乙酮對照品溶液，每個濃度平行制備3份供試品，按既定的色譜條件測定，計算回收率。3個濃度下兩種防腐劑的回收率均在95.0%～105.0%，RSD均在3.0%以內。

2.2.6 專屬性試驗：取供試品溶液，混合對照品溶液、陰性樣品（空白接收液和豬皮提取液），按“1.2.2.1”項下色譜條件檢測，記錄色譜圖。對照品峰形良好，供試品與對照品在相應位置上存在相同峰，且陰性樣品溶液對測定結果不產生干擾。見圖3。

2.3 離體豬皮透皮試驗結果

2.3.1 防腐劑在豬皮膚中的透皮吸收量：結果顯示面膜中羥苯甲酯和對羥基苯乙酮在豬皮膚模型中貼敷20 min、1 h和2 h 后，兩種防防腐劑在接收液中經皮透過量測定結果。兩種防腐劑從面膜中經皮透過速度較快，面膜貼敷20 min時，兩種防腐劑即可在透皮接收液中檢測到，Qt分別為0.56μg·cm2和0.84μg·cm2。隨著面膜貼敷時間的增加，Qt也逐漸增加，2 h羥苯甲酯和對羥基苯乙酮的平均經皮累積透過量Qt分別為5.6μg·cm2和10.2μg·cm2。并且對羥基苯乙酮的經皮透過量增加速度更快和累積透過量更高。見圖4A。

2.3.2 防腐劑在不同層次離體豬皮膚中駐留量：結果顯示，面膜中羥苯甲酯和對羥基苯乙酮在豬皮膚模型中貼敷20 min、1 h和2 h后，兩種防腐劑在皮膚角質層和真皮層中駐留結果。結果顯示，兩種防腐劑在皮膚真皮和角質層中駐留量Qr也是隨著貼敷時間的增加而增加。角質層和真皮層中3個時間點的羥苯甲酯平均駐留量均小于對羥基苯乙酮平均駐留量，這與皮下接收液中兩種防腐劑的經皮滲透量趨勢是一致的。此外，皮膚真皮層中兩種防腐劑在面膜貼敷2 h的駐留量明顯增加，顯著高于角質層中同樣時間點的駐留量。并且研究顯示，皮膚中防腐劑駐留量顯著高于經皮透過量，在20 min時間點，兩種防腐劑在皮膚中駐留量相當于皮下接受液量約14和12倍。見圖4B～C。

2.3.3 透明質酸對防腐劑皮膚透過和皮膚內駐留影響：結果顯示，透明質酸對羥苯甲酯和對羥基苯乙酮在豬皮膚經皮透過量（見圖4A）和皮膚角質層、真皮層中駐留量（見圖4B～C）的影響。透明質酸能降低兩種防腐劑經皮透過量，在2 h時兩種防腐劑透過量均有顯著性降低。相反，透明質酸能增加兩種防腐劑在皮膚角質層和真皮層中駐留量。

2.4 皮膚內暴露量與安全性分析：結合皮膚中兩種防腐劑的駐留量數據，表3計算了皮膚角質層和真皮層中兩種防腐劑的濃度。根據CAMVA試驗的結果，皮膚中駐留的羥苯甲酯和對羥基苯乙酮濃度均小于不產生皮膚刺激性安全濃度，對羥基苯乙酮的濃度離產生皮膚刺激性相差較多。但羥苯甲酯在2 h真層中濃度比較接近產生刺激性的濃度

3" 討論

巴馬小型豬的皮膚各種生理特征和透過性均被認為是與人類皮膚最為接近的，歐盟委員會等多個國際組織均推薦可用于代替人類皮膚進行經皮給藥研究[14]。因此本研究采用巴馬小型豬皮膚來評估化妝品中兩種防腐劑羥苯甲酯和對羥基苯乙酮在該皮膚模型中經皮透過量和皮膚內駐留量。目前多數文獻主要是測定皮下接收液中藥物透過量[11，15-16]，較少的研究會同時關注皮膚中駐留量[12，17]。本研究同時測定兩種防腐劑透皮透過量和皮膚中駐留量，為更全面分析防腐在人體局部皮膚和系統暴露量提供一種新的離體模型方法。試驗中發現兩種防腐劑在面膜貼敷20 min和1 h時，皮膚角質層和層中駐留量較為接近；但在貼敷2 h時，真皮層中防腐劑駐留量顯著高于角質層中駐留量。這可能是兩種防腐劑均屬于脂溶性成分，能較容易穿透皮膚角質層，隨著貼敷時間的延長，防腐逐漸進入深層皮膚內。在貼敷1和2 h，透明質酸能顯著增加羥苯甲酯和對羥基苯乙酮在皮膚中駐留量。這可能是透明質酸對皮膚的水合作用，或是與防腐劑的相互作用增強了其在皮膚中駐留量。化妝品中防腐劑多數均屬于脂溶性化合物，理論上均具有良好的皮膚透過性能。同時面膜中防腐劑用量較大（常規面膜25 ml，以加入0.4%羥苯甲酯計，相當于一片面膜中含有羥苯甲酯100 mg），因此需要關注面膜中防腐劑進入皮膚后，對皮膚內部可能產生的局部副作用。

面膜的使用人群主要為女性，此處使用女性的生理參數來計算皮膚內羥苯甲酯和對羥基苯乙酮駐留濃度。女性皮膚的平均重量為3 200 g，皮膚中平均含水量約為30%，面部占皮膚的比例約為3%，這樣計算女性皮膚中水分的平均含量為28.8 g。化妝品中成分的皮膚刺激性的評價方法主要包括重建人表皮3D皮膚模型[18]、直接多肽反應試驗[8]、雞胚絨毛膜尿囊膜模型和近年剛興起的斑馬魚胚模型[20-21]。在本研究中，主要采用CAMVA方法評估防腐劑羥苯甲酯和對羥基苯乙酮對局部皮膚潛在刺激性。《化妝品安全技術規范》中規定羥苯甲酯的最大允許使用濃度為0.4%。本研究評估結果顯示，0.4%的羥苯甲酯能產生輕微皮膚刺激性。此外，皮膚內暴露與安全性分析也揭示羥苯甲酯按0.4%添加到面膜中，在局部皮膚內可能產生一定的毒副作用。對羥基苯乙酮在CAMVA試驗中顯示1.0%濃度不會產生皮膚刺激性，但由于本品的有效抑制濃度為0.5%[9]。有效濃度和安全濃度相差較小，如果面膜中加入能確保抑菌效果的用量，長時間貼敷面膜，皮膚中駐留量累積也可能產生潛在副作用。

此外，有研究顯示，面膜中某些成分，比如低分子量透明質酸會增加藥物在皮膚中駐留量[22-23]。本試驗也證實了低分子量透明質酸會增加羥苯甲酯和對羥基苯乙酮在皮膚中駐留量。化妝品中其他成分是否也會增加防腐劑在皮膚中駐留量，或是其他防腐劑在透明質酸作用下是否也會顯著增加其在皮膚內駐留量仍然是未知的，但這可能為潛在局部皮膚安全性帶來更復雜的情況。

本研究首次評估了面膜中防腐劑羥苯甲酯和對羥基苯乙酮經皮透過量和在皮膚中駐留量，并且分析了皮膚局部暴露濃度和安全性關系，為化妝品中防腐劑的安全使用提供了一種新的評估方法。

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[收稿日期]2023-07-03

本文引用格式：李和偉，代穎，魏國志.防腐劑羥苯甲酯和對羥基苯乙酮皮膚局部刺激性及駐留量和透皮量研究[J].中國美容醫學，2025，34（2）：1-6.