基于WGCNA構建的免疫相關基因模型對皮膚黑素瘤及免疫微環境的影響

[摘要]目的：基于加權基因共表達網絡分析（WGCNA）構建免疫相關基因預后模型，篩選預后標記物，探索與腫瘤微環境的關系。方法：黑素瘤基因表達數據和相關臨床數據從癌癥基因組圖譜（TCGA）和表達綜合（GEO）數據庫中下載。采用加權基因共表達網絡分析、單因素Cox回歸分析和LASSO回歸分析對黑素瘤預后進行分類。采用ESTIMATE和CIBERSORT算法探討風險評分與腫瘤免疫微環境的關系。GSEA分析用于探索生物信號通路。結果：共獲得1 793個標志性的免疫相關基因，其中與黑素瘤的總生存期相關的基因有246個。五個免疫相關基因的風險評分模型顯示了很強的預測能力。與當前臨床特征對疾病預后預測能力相比，該評分模型具有更好的預測能力。同時高、低風險評分組之間基因集富集分析（GSEA）存在多種差異信號通路。此外，風險評分模型基因作為生物標志物與腫瘤微環境中的多種免疫細胞和免疫浸潤息息相關。結論：基于加權基因共表達網絡分析構建了皮膚黑色素免疫相關基因預后評估模型，為預測預后提供參考，且可能通過影響腫瘤微環境中的免疫細胞的生物學功能發揮作用。

[關鍵詞]皮膚黑素瘤；免疫；預后；腫瘤微環境；免疫浸潤

[中圖分類號]R739.5" " [文獻標志碼]Anbsp; " [文章編號]1008-6455（2025）02-0007-07

Effects of Immune Related Gene Model Constructed Based on WGCNA on Skin Melanoma and Immune Microenvironment

LING Chen， SONG Pan， YE Jinmao， ZHANG Haiyang， SUN Min

（ Department of General Surgery， Taihe Hospital， Hubei University of Medicine， Shiyan 442000， Hubei， China ）

Abstract： Objective" To construct an immune related gene prognosis model， screen prognostic markers， and explore the relationship with tumor microenvironment based on weighted gene co-expression network analysis. Methods" Melanoma gene expression data and related clinical data were downloaded from the Cancer Genome Map （TCGA） and Expression Synthesis （GEO） databases. The prognosis of melanoma was classified using weighted gene co-expression network analysis， univariate Cox regression analysis， and LASSO regression analysis. The relationship between risk score and tumor immune microenvironment was investigated using ESTIMATE and CIBERSORT algorithms. GSEA analysis was used to explore signaling pathways. Results" A total of 1793 significantly immune related genes were obtained， of which 246 genes were associated with the overall survival of melanoma. The risk scores model for five immune related genes showed strong predictive power. Compared to the current clinical features' ability to predict prognosis， this risk scores model had a better predictive capability. At the same time， there were multiple different signaling pathways in gene set enrichment analysis （GSEA） between high and low risk scores groups. In addition， five immune related genes were closely related to multiple immune cells and infiltration in the tumor microenvironment. Conclusion" Based on weighted gene co-expression network analysis and immune related genes， a prognostic evaluation model for skin melanoma was constructed， which provided a reference for predicting prognosis and might play a role by influencing the biological functions of immune cells in the tumor microenvironment.

Key words： skin melanoma; immune; prognosis; tumor microenvironment; immune cell infiltration

黑素瘤是一種威脅人民生命的惡性腫瘤，具有極高的轉移率和死亡率[1-2]。2020年全球約有324 635例新增的黑素瘤患者，同年有死亡患者57 043例[3]。黑素瘤預后不良和早期診斷差導致極高死亡率。因此，提出早期診斷的方法極其重要，目前TNM分期是檢測癌癥分期的有效方法，對癌癥預后非常重要，并為正確的治療方法提供指導[4]。然而，有研究觀察到TNM分期法相關的總生存率之間也存在差異[5]。目前隨著腫瘤研究的深入，TNM分期法的臨床局限性逐漸顯現。因此，有必要探尋新的黑素瘤標志物來用于指導臨床治療和改善黑素瘤的預后。隨著人類基因測序的進展，基于基因的生物標志物變得越來越流行。

研究發現大多數免疫系統成分與黑素瘤的發生和發展有關[6]。在腫瘤免疫中，腫瘤細胞充當抗原，而免疫細胞和白細胞通過免疫防御的趨化性浸潤腫瘤組織功能。免疫逃逸也是腫瘤發生的一個重要因素。目前，許多新的免疫療法用于治療黑素瘤，包括PD1、PD-L1和CTLA-4抑制劑。然而，這些方法僅對少數患者有效，而大多數患者對治療反應局限或無反應，尤其是在黑素瘤進展期間。因此，全面分析免疫基因和黑素瘤總生存率之間的相關性對于探索免疫基因和新生物標志物的潛在預后價值非常重要。

本研究目標是利用TCGA和GEO數據，基于加權基因共表達網絡分析（WGCNA）構建一種新的免疫相關基因的預后模型，用于黑素瘤的免疫治療和預后監測。同時，探索生物標志物在腫瘤中的潛在機制、與免疫細胞浸潤的關系。這項研究為黑素瘤的后續個性化診斷和治療提供了潛在指導作用。

1" 材料和方法

1.1 數據獲取與處理：檢索TCGA-SKCM黑素瘤樣本的轉錄組和臨床數據，用于R包分析。排除沒有隨訪信息和生存時間小于1 d的樣本。TCGA的428個黑素瘤樣本用于分析。GSE65904數據集從基因表達綜合數據庫（GEO：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中檢索下載。在這項研究中，生存數據小于1 d的剔除。檢索了210個黑素瘤樣本用于R包的外部驗證分析。此外，GEO表達式文件被轉換為log2（表達），以便進一步分析。免疫相關基因數據從免疫報告數據庫（https：//immport.niaid.nih.gov）中檢索。選擇來自GEO數據集、TCGA數據集和免疫組的重疊免疫相關基因進行進一步分析。

1.2 統計方法分析：所有分析均由R-4.2.1版本和相應的包進行。Kaplan-Meier生存曲線被進一步用來評估免疫評分和總生存率之間的關系，中間值設定為截斷值。glmnet包用于LASSO分析。

1.3 加權基因共表達網絡分析：TCGA表達數據使用WGCNA包進行加權基因共表達網絡分析（WGCNA）。用WGCNA探討臨床特征與表達模塊的關系。模塊特征基因（MEs）被定義為每個基因模塊的第一主成分，并被用作每個模塊中所有基因的代表。基因顯著性（GS），作為每個基因的中介P值（GS=lg P），表示該模塊的基因表達和臨床特征之間的線性相關程度。根據P≤0.01定義生存相關模塊，提取較高的GS值用于進一步分析。

1.4 模型的建立：進行單變量Cox回歸分析，以探討每個基因對總生存率的影響。P＜0.01的生存相關模塊的免疫相關基因（Immune-related genes，IRG）被確定為生存相關IRG，并整合到最小絕對收縮和選擇算子（LASSO）回歸中，用于識別預后風險特征。每個樣本的風險評分（Risk Score，RS）使用以下公式計算：風險評分=Σexpgenei* βi，構建風險預測模型。進一步進行Kaplan-Meier曲線分析，以評估風險評分與總生存率之間的關系。采用單因素和多因素Cox回歸分析研究該指標與臨床特征的關系。為了預測模型的準確性和預測能力，在驗證集GSE65904中計算ROC曲線下面積并進行比較，以使用timeROC包檢查風險預測模型的性能。

1.5 風險評分與腫瘤微環境的關系：為了探討風險評分與黑素瘤預后的關系，本研究分析了風險評分與腫瘤微環境的關系。腫瘤微環境包括多種細胞類型，包括間充質細胞、內皮細胞、免疫細胞、炎癥介質和細胞外基質分子。使用ESTIMATE算法，使用R軟件確定每個樣本的免疫評分，并通過Wilcoxon檢驗進一步比較高風險組和低風險組之間免疫細胞浸潤程度的差異。

1.6 高、低風險評分組之間22種免疫細胞亞型的比較：為了探索免疫細胞亞型的差異，使用R語言中CIBERSORT軟件包評估了22種免疫細胞亞類型的比例。參數設定在1 000。CIBERSORT分析結果中P＜0.05的樣品用于進一步分析。Mann-Whitney U檢驗用于比較高風險評分和低風險評分組中免疫細胞亞型的差異。

1.7 基因集富集分析（GSEA）：為了確定高低風險評分組之間差異激活的信號通路，本研究通過limma包選擇了一個有序的基因列表，并使用cluster包進行了基因集富集分析（GSEA），選取矯正后P＜0.05。

2" 結果

2.1 用WGCNA方法鑒定出與生存相關模塊：對1326個重疊的免疫相關基因進行了WGCNA分析（見圖1）。三個數據集中有1 326個IRG重疊，所用的數值代表了整體標識和探針標識所覆蓋的基因符號的數量，被注釋的基因數量顯示在y軸上?；跓o標度R2（R2=0.95）確定WGCNA的軟閾值。基于平均鏈接層次聚類和軟閾值能力識別出六個模塊。其中黃色和藍色模塊顯示出與黑素瘤總生存率高度相關，選擇這兩個模塊的數據進行下一步分析（見圖2）。

2.2 基于免疫相關基因的預測預后模型的構建：黃色和藍色模塊的IRGs被鑒定為黑素瘤的生存最佳相關的免疫相關基因，標準為P＜0.01。LASSO分析確定了五個IRG（S100A14、PSME1、IFIH1、GBP2、KLRC1）（見圖3）并構建預后模型（見表1）。圖4顯示了其表達水平。時間相關的ROC曲線表明，該預后模型在TCGA數據集上具有很強的預測能力（見圖5A）。在訓練集中，1年的AUC為0.739，3年為0.701，5年為0.731（見圖5A）。根據Kaplan-Meier生存分析，高、低RS組相比，高RS組顯示出較差的總體生存率（見圖5B）。

2.3 GEO隊列作為測試集對預后風險模型進行驗證：本研究使用GEO數據庫中的GSE隊列來驗證預后模型的預測能力。時間相關的ROC曲線顯示，預后模型具有良好的準確性，1年為0.690，3年為0.684，5年為0.604（見圖5C）。Kaplan-Meier生存分析表明，高評分組的整體存活率很低（P＜0.05），見圖5D。此外，與其他臨床特征相比，該風險模型具有更好的預測能力和準確性（見圖5E～F）。此外，預后模型的RS是多因素Cox分析中的一個獨立預后因素，預后相關因素和總生存期的單因素和多因素分析結果見表2。

2.4 高、低免疫評分組間免疫浸潤評分：免疫評分、基質評分顯示高和低風險評分組之間有顯著差異，無論是訓練集還是測試集低風險評分組的免疫評分和基質評分都高于高風險評分組（見圖6）。

2.5 高、低風險評分組間的免疫細胞亞型：黑素瘤的22種免疫細胞比例結果顯示，M0巨噬細胞、M2巨噬細胞和CD8+T細胞占黑素瘤免疫細胞浸潤的很大比例。高和低RS組顯示不同的免疫細胞表達（見圖7）。

2.6 GSEA分析：GSEA分析顯示了15種與風險評分相關的顯著KEGG通路，包括MAPK信號通路、血管生成、血管發育、細胞活化、細胞因子產生及活化調節、免疫系統發育、細胞增殖的正調控、細胞內信號轉導的正調節、蛋白質修飾過程的正向調節、細胞遷移的調節。（見圖8）。

3" 討論

黑素瘤是一種致命的皮膚癌[7]。目前，免疫療法是黑素瘤患者一種成功的治療選擇[8-10]。許多研究人員證明了免疫細胞對腫瘤細胞的作用[11]。黑素瘤組織中的免疫成分可用于評估患者的治療效果和黑素瘤預后[12-13]。在本研究中，246個免疫相關基因與黑素瘤預后相關，其中5個顯著基因被用來構建模型。該模型具有可靠的預測價值和準確性。此外，本研究還探討了風險評分（RS）與黑素瘤預后之間的內在關系。研究結果表明，高RS組和低RS組的免疫細胞浸潤和多種信號通路存在差異。

模型中使用了S100A14、PSME1、IFIH1、GBP2、KLRC1這5個與免疫相關的標志基因（IRGs）。在以前的研究中，這些IRG被報道與腫瘤預后相關。S100A14調節腫瘤免疫逃逸，促進腫瘤轉移與腫瘤的預后息息相關[14-16]。PSME1免疫治療腫瘤逃逸有關，GBP2的低表達與SKCM中免疫細胞浸潤較少和預后不良相關，GBP2的高啟動子甲基化是SKCM預后不良的有希望的生物標志物[17-18]。IFIH1基因突變體能以不同的方式作用于癌癥免疫力，比如，攜帶能賦予1型糖尿病風險的IFIH1突變體的個體機體中更易于出現炎性腫瘤，但研究人員還看到了與克羅恩病相關突變體患者的效果恰恰相反，這就提示這類患者或許并不會受益[19]。目前IFIH1對于腫瘤關系還不清楚需要進一步研究。有研究表明KLRC1受體在細胞毒性淋巴細胞上表達，包括NK細胞和活化的CD8+T細胞亞群。阻斷KLRC1抗體釋放了這些效應細胞的反應性，從而控制了腫瘤[20-22]。

有研究表明，免疫細胞成分比例失衡與癌癥患者預后不良和存活率低高度相關[23-24]。為了進一步探索免疫和風險評分的關系，本研究使用CIBERSORT算法計算免疫細胞亞型。結果表明，兩個風險評分組表達不同的免疫細胞亞型。先前的一項研究報告稱，CD8+T細胞產生粒細胞和穿孔素來殺死腫瘤細胞。在本研究中，發現的免疫細胞主要包括M0巨噬細胞、M2巨噬細胞和CD8+T細胞。在這項研究中，高風險組的CD8+T水平較低，而M0和M2巨噬細胞水平較高。這寓意著CD8+T細胞和M0、M2巨噬細胞比例失衡可能會降低高危組患者的生存率。CD8+T細胞的高表達可以改善黑素瘤患者的預后，減少危險因素。

GSEA分析顯示了高和低RS組之間15條重要信號通路的差異。MAPK信號通路的抑制劑通過增強黑素瘤抗原表達和下調免疫抑制細胞因子來改善黑素瘤免疫微環境。此外，趨化因子信號通路參與腫瘤生長。

在本研究中，LASSO回歸分析被用來建立一個新的預后模型，并使用獨立隊列驗證了該模型[25]。目前，很少有研究使用ESTIMATE和CIBERSORT算法來探索黑素瘤的免疫浸潤。這些初步結果為探討免疫浸潤在黑素瘤中的作用提供了一個視角。然而，本研究有以下局限性。首先，由于缺乏體內外實驗，分子機制分析結果的可靠性有限；第二，這項研究是一項回顧性研究，因此，應進行前瞻性研究，以驗證本次研究結果。

綜上所述，本研究成功地構建了一個黑素瘤預后模型，其具有強大的預測功能。高、低風險組總生存率的差異與免疫浸潤、腫瘤微環境和多種信號通路的相互作用密切相關，為黑素瘤發病機制和臨床治療的分析提供了潛在指導作用。

[參考文獻]

[1]Rastrelli M， Tropea S， Rossi C R， et al. Melanoma： epidemiology， risk factors， pathogenesis， diagnosis and classification[J]. In Vivo， 2014，28（6）：1005-1011.

[2]Wei D. A multigene support vector machine predictor for metastasis of cutaneous melanoma[J]. Mol Med Rep， 2018，17（2）：2907-2914.

[3]Sung H， Ferlay J， Siegel R L， et al. Global cancer statistics 2020： Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin， 2021，71（3）：209-249.

[4]Bertero L， Massa F， Metovic J， et al. Eighth edition of the UICC classification of malignant tumours： an overview of the changes in the pathological tnm classification criteria-what has changed and why？[J]. Virchows Arch， 2018，472（4）：519-531.

[5]Perakis S O， Thomas J E， Pichler M. Non-coding RNAs enabling prognostic stratification and prediction of therapeutic response in colorectal cancer patients[J]. Adv Exp Med Biol， 2016，937：183-204.

[6]Angell H， Galon J. From the immune contexture to the Immunoscore： the role of prognostic and predictive immune markers in cancer[J]. Curr Opin Immunol， 2013，25（2）：261-267.

[7]董小龍，馬勇光，楊欣.皮膚惡性黑素瘤診斷及外科治療策略[J].中國美容醫學，2016，25（6）：108-112.

[8]Valpione S， Campana L G. Immunotherapy for advanced melanoma： future directions[J]. Immunotherapy， 2016，8（2）：199-209.

[9]高正君，謝沛霖，司小強，等.不同來源黑素瘤BRAF V600E基因突變分析[J].中國美容醫學，2018，27（1）：74-76.

[10]劉洋，劉林嶓.抗原負載的DC-CIK聯合化療治療晚期惡性黑素瘤的臨床研究[J].中國美容醫學，2015，24（2）：25-30.

[11]Fischer G M， Vashisht Gopal Y N， McQuade J L， et al. Metabolic strategies of melanoma cells： Mechanisms， interactions with the tumor microenvironment， and therapeutic implications[J]. Pigment Cell Melanoma Res， 2018，31（1）：11-30.

[12]Ladányi A. Prognostic and predictive significance of immune cells infiltrating cutaneous melanoma[J]. Pigment Cell Melanoma Res， 2015，28（5）：490-500.

[13]張學軍，亓發芝.內質網應激蛋白ATF4調控STAT3信號通路促進黑素瘤細胞生長及轉移的研究[J].中國美容醫學，2018，27（7）：83-86.

[14]Li X， Ding F， Wang L， et al. Disruption of enhancer-driven S100A14 expression promotes esophageal carcinogenesis[J]. Cancer Lett， 2022，545：215833.

[15]Li X， Wang M， Gong T， et al. A S100A14-CCL2/CXCL5 signaling axis drives breast cancer metastasis[J]. Theranostics， 2020，10（13）：5687-5703.

[16]Xiao M， Liang X， Yan Z， et al. A DNA-methylation-driven genes based prognostic signature reveals immune microenvironment in pancreatic cancer[J]. Front Immunol， 2022，13：803962.

[17]Zhang S， Chen K， Zhao Z， et al. Lower expression of GBP2 associated with less immune cell infiltration and poor prognosis in skin cutaneous melanoma （SKCM）[J]. J Immunother， 2022，45（6）：274-283.

[18]Ji G， Luo B， Chen L， et al. GBP2 is a favorable prognostic marker of skin cutaneous melanoma and affects its progression via the Wnt/β-catenin pathway[J]. Ann Clin Lab Sci， 2021，51（6）：772-782.

[19]Sayaman R W， Saad M， Thorsson V， et al. Germline genetic contribution to the immune landscape of cancer[J]. Immunity， 2021，54（2）：367-386.e8.

[20]Parrot T， Oger R， Allard M， et al. Transcriptomic features of tumour-infiltrating CD4（low）CD8（high） double positive αβ T cells in melanoma[J]. Sci Rep， 2020，10（1）：5900.

[21]Saputro R D， Rinonce H T， Iramawasita Y， et al. Potential prognostic value of PD-L1 and NKG2A expression in Indonesian patients with skin nodular melanoma[J]. BMC Res Notes， 2021，14（1）：206.

[22]van Hall T， André P， Horowitz A， et al. Monalizumab： inhibiting the novel immune checkpoint NKG2A[J]. J Immunother Cancer， 2019，7（1）：263.

[23]Ali H R， Chlon L， Pharoah P D， et al. Patterns of immune infiltration in breast cancer and their clinical implications： a gene-expression-based retrospective study[J]. PLoS Med， 2016，13（12）：e1002194.

[24]Bense R D， Sotiriou C， Piccart-Gebhart M J， et al. Relevance of tumor-infiltrating immune cell composition and functionality for disease outcome in breast cancer[J]. J Natl Cancer Inst， 2017，109（1）：djw192.

[25]沈劍，廖海英，黃謙.基于生物信息學構建GOPC的皮膚黑素瘤預后模型[J].中國美容醫學，2023，32（3）：70-74.

[收稿日期]2023-03-23

本文引用格式：凌晨，宋攀，葉金茂，等.基于WGCNA構建的免疫相關基因模型對皮膚黑素瘤及免疫微環境的影響[J].中國美容醫學，2024，34（2）：7-14.