基于高通量測(cè)序技術(shù)的云南小曲清香型白酒水封發(fā)酵下的產(chǎn)酸特性研究

云南小曲清香型白酒憑借其別具一格的風(fēng)味深受大眾喜愛，在白酒的釀制流程中，發(fā)酵階段占據(jù)著關(guān)鍵地位，微生物群落的改變直接左右著酸的生成及最終成品的質(zhì)量。本研究借助高通量測(cè)序技術(shù)，全面剖析了水封發(fā)酵狀況下云南小曲白酒里微生物群落的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變，以及其對(duì)酸產(chǎn)特性產(chǎn)生的作用。研究結(jié)果顯示，發(fā)酵進(jìn)程中乳酸菌的大量繁殖極大地增強(qiáng)了酸度，構(gòu)建了繁雜的微生物生態(tài)體系。此項(xiàng)研究不僅為增進(jìn)白酒的風(fēng)味和品質(zhì)提供了科學(xué)支撐，也為精確調(diào)控釀造進(jìn)程提供了理論基石。

1.引言

在白酒的釀制過程里，發(fā)酵階段對(duì)最終產(chǎn)品的風(fēng)味、香氣和品質(zhì)發(fā)揮著舉足輕重的作用。近年來，高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛進(jìn)步，給微生物群落的分析帶來了全新的視角。本研究意在探究在水封發(fā)酵的狀況下，云南小曲白酒中微生物群落的變動(dòng)及其對(duì)酸產(chǎn)特性造成的影響。

2.高通量測(cè)序技術(shù)概述

2.1 高通量測(cè)序的原理與方法

高通量測(cè)序（HTS）作為一項(xiàng)具有開創(chuàng)性的技術(shù)，能夠在較短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)出海量的DNA序列數(shù)據(jù)，并在基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及微生物生態(tài)學(xué)等范疇得到了廣泛運(yùn)用，其根本原理涵蓋了樣本籌備、測(cè)序反應(yīng)以及數(shù)據(jù)分析等環(huán)節(jié)。起初DNA 片段借助限制性酶切或者隨機(jī)剪切等手段予以切割，以此保障片段的大小具有一致性或者呈現(xiàn)出多樣性；緊接著展開末端修復(fù)工作，使DNA片段的末端變得平滑，為后續(xù)的連接操作創(chuàng)造條件；而后把特定的測(cè)序接頭銜接至DNA片段的兩端，這些接頭促使DNA能夠穩(wěn)固在測(cè)序平臺(tái)之上；最終憑借聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）針對(duì)連接了接頭的DNA片段予以擴(kuò)增，從而獲取充足的模板用于測(cè)序。

2.2 高通量測(cè)序在微生物研究中的應(yīng)用

高通量測(cè)序在微生物研究中的應(yīng)用極為普遍，特別是在轉(zhuǎn)錄組學(xué)和微生物群落分析領(lǐng)域取得了顯著成效。以往的研究大多依賴培養(yǎng)技術(shù)，但高通量測(cè)序的誕生使在無培養(yǎng)條件下開展微生物多樣性分析成為現(xiàn)實(shí)。例如，Yoder-Himes等在針對(duì) Burkholderia cenocepacia 展開研究時(shí)借助Illumina測(cè)序察覺到了多種未曾知曉的非編碼RNA，闡明了其基因組相似度和致病潛力之間的關(guān)聯(lián)。Nadja Larsen 等在探究糖尿病與腸道微生物的關(guān)系時(shí)，運(yùn)用454高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)患者的腸道菌群進(jìn)行剖析，發(fā)現(xiàn)特定微生物的分布和糖尿病發(fā)生緊密相連。

3.云南小曲清香型白酒的發(fā)酵過程

3.1 小曲白酒的生產(chǎn)工藝

云南小曲清香型白酒的生產(chǎn)工藝憑借其獨(dú)有的地域特色與傳統(tǒng)技法聲名遠(yuǎn)揚(yáng)，過程涵蓋了原料挑選、糖化、發(fā)酵及蒸餾等步驟。在原料挑選方面，產(chǎn)自云南高海拔區(qū)域的紅高粱乃是主要的釀酒用料，因其飽含淀粉與單寧，有力保障了酒體的豐腴和醇厚。云南當(dāng)?shù)氐臍夂蚺c土壤狀況促使這種高粱顆粒大且堅(jiān)實(shí)，所釀之酒香氣馥郁口感別具一格。在糖化進(jìn)程中將傳統(tǒng)工藝和現(xiàn)代技術(shù)相融合，將選好的高粱予以蒸煮，促使淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)槟馨l(fā)酵的糖分。復(fù)配的多種酒曲進(jìn)行發(fā)酵，此環(huán)節(jié)極為關(guān)鍵，決定了酒體的香氣層級(jí)和風(fēng)味特點(diǎn)。云南的小曲白酒大多運(yùn)用多曲共釀之法，借由五種酒曲的復(fù)合搭配使酒體更為醇厚、口感越發(fā)豐富。

3.2 水封發(fā)酵的特點(diǎn)與作用

水封發(fā)酵是在云南傳統(tǒng)小曲釀造工藝的基礎(chǔ)上又一創(chuàng)新之舉，其效用在于憑借獨(dú)特的物理與化學(xué)特質(zhì)提升酒的品質(zhì)。水封發(fā)酵選取陶缸當(dāng)作發(fā)酵容器，具備出色的隔絕性能，能夠切實(shí)阻攔外部細(xì)菌及有害微生物的侵入，規(guī)避雜味的出現(xiàn)，由此提升了酒的純凈度。

陶缸的透氣性能和微氧環(huán)境能夠助推酒體的氧化反應(yīng)，有益于酒的陳化與風(fēng)味的優(yōu)化。相較于傳統(tǒng)的密閉發(fā)酵模式，水封發(fā)酵能夠有效排出在發(fā)酵進(jìn)程中生成的有害氣體，防止酵母帶來的干擾，確保酒體的順滑及香氣的純粹。就像菜根潭酒廠在這一技術(shù)運(yùn)用方面取得成功，使其產(chǎn)品于市場(chǎng)里獲得良好的口碑，消費(fèi)者大都反饋其酒體更為柔和余味干凈清爽。另外，水封發(fā)酵能夠構(gòu)建一個(gè)相對(duì)封閉的發(fā)酵空間，保障酒醅的水分均勻且穩(wěn)定，進(jìn)而守護(hù)酒的質(zhì)量。陶缸內(nèi)部的釉質(zhì)涂層不單能提升發(fā)酵的衛(wèi)生程度，還能使酒體在發(fā)酵過程中吸附有益成分，進(jìn)一步強(qiáng)化了酒的層次感和復(fù)雜程度。

3.3 發(fā)酵過程中酸的產(chǎn)生機(jī)制

在小曲白酒的發(fā)酵過程中，酸的形成是左右酒體風(fēng)味的關(guān)鍵要素。在發(fā)酵期間，酵母在把糖分轉(zhuǎn)變?yōu)榫凭珪r(shí)也會(huì)產(chǎn)出一定數(shù)量的有機(jī)酸，如乳酸、醋酸等。這些酸不僅能夠?qū)频乃岫扔枰哉{(diào)節(jié)，使酒體更為均衡，而且還能增進(jìn)酒的香氣，令其在口感方面越發(fā)豐富多樣。酸的生成機(jī)制主要受到發(fā)酵條件的左右，涵蓋了溫度、pH值以及酵母的種類等。處于適宜的溫度區(qū)間內(nèi)，酵母的活性能夠得到充分激發(fā)，糖的發(fā)酵效率也會(huì)隨之提升，進(jìn)而促使酸的生成增多。舉例來講，有研究顯示當(dāng)發(fā)酵溫度把控在25℃-30℃時(shí)，有機(jī)酸的生成顯著增加，在這種溫度狀況下，酵母的代謝活動(dòng)頗為活躍，能夠有效轉(zhuǎn)化糖分并產(chǎn)出大量的乳酸。

4.實(shí)驗(yàn)材料與方法

4.1 研究樣本的選擇

在此次研究里針對(duì)云南小曲清香型白酒樣本的選取，遵循了一系列嚴(yán)苛的標(biāo)準(zhǔn)，以此保障樣本具備代表性與可靠性。其一，我們保證樣本出自擁有正規(guī)資質(zhì)的生產(chǎn)廠家，以此確保其生產(chǎn)工藝的規(guī)范性與穩(wěn)定性，如從知名的白酒生產(chǎn)企業(yè)中挑揀樣本，囊括了各異的品牌與系列。其二，我們著重選擇運(yùn)用水封發(fā)酵工藝的白酒樣本，用以強(qiáng)化研究對(duì)象的針對(duì)性。樣本的酒精度范疇包含高度酒（40%vol-69%vol）及低度酒（25%vol-39%vol），這有益于全方位知曉不同酒精度之下的產(chǎn)酸特性差別。

4.2 發(fā)酵過程的監(jiān)測(cè)與采樣

在云南小曲清香型白酒的水封發(fā)酵流程里，借由測(cè)定發(fā)酵進(jìn)程中的溫度變動(dòng)來知曉發(fā)酵情況。我們運(yùn)用高精準(zhǔn)度的溫度計(jì)，定時(shí)測(cè)量發(fā)酵容器內(nèi)多個(gè)位置的溫度，然后將所得數(shù)值取均值，并將其作為發(fā)酵溫度的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。在發(fā)酵的初始階段，微生物的活動(dòng)慢慢變得活躍，溫度也會(huì)隨之逐步上升。如果溫度過高或過低，都有可能對(duì)發(fā)酵的正常開展及酸的生成造成影響。

酸堿度的改變同樣屬于關(guān)鍵的監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一，我們通過pH計(jì)定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的pH值，伴隨發(fā)酵的推進(jìn)，乳酸菌等微生物在代謝時(shí)產(chǎn)生的有機(jī)酸持續(xù)積聚，致使發(fā)酵液的pH值逐步降低。在發(fā)酵剛開始時(shí)發(fā)酵液的pH值或許在6.0上下，隨著發(fā)酵的持續(xù)，pH值能夠下降到4.0甚至更低。與此同時(shí)，我們對(duì)酒精含量的變動(dòng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，采用酒精計(jì)或者氣相色譜之類的辦法，測(cè)量發(fā)酵液中的酒精含量。監(jiān)測(cè)酒精含量變動(dòng)，能夠更有效地理解發(fā)酵過程中酸的產(chǎn)生原理。

4.3 高通量測(cè)序的實(shí)施步驟

就液態(tài)發(fā)酵樣本而言，借助離心之類的手段來除去雜質(zhì)，進(jìn)而獲取微生物細(xì)胞或者核酸物質(zhì)；對(duì)于固態(tài)發(fā)酵樣本，則需要采取研磨、破碎等舉措使其達(dá)到均勻的狀態(tài)。在提取核酸的過程中，要嚴(yán)格把控操作環(huán)境的無菌狀況，運(yùn)用高品質(zhì)的核酸提取試劑盒，以此保障提取得到的核酸具備高純度與完整性。完成提取之后，通過微量核酸定量?jī)x、分光光度計(jì)等相關(guān)設(shè)備來檢測(cè)核酸的濃度、純度及完整性，從而確保符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的核酸樣本能夠用于后續(xù)的分析。

文庫構(gòu)建屬于高通量測(cè)序的關(guān)鍵步驟，起初對(duì)提取的核酸進(jìn)行片段化處置，保證片段大小契合后續(xù)操作；緊接著展開末端修復(fù)以及連接測(cè)序接頭的工作，利于核酸片段和測(cè)序平臺(tái)相結(jié)合；最終借助PCR擴(kuò)增，大量增加核酸，得到充足的模板以供測(cè)序運(yùn)用。在進(jìn)行高通量測(cè)序時(shí)，需要依照樣本的特點(diǎn)設(shè)定恰當(dāng)?shù)膮?shù)。比如，按照樣本的繁雜性及微生物群落的多元性，挑揀適宜的測(cè)序深度和讀長(zhǎng)，從而獲取高品質(zhì)的數(shù)據(jù)。與此同時(shí)，在測(cè)序進(jìn)程中，維持環(huán)境的干凈和穩(wěn)定，定時(shí)對(duì)測(cè)序儀進(jìn)行維護(hù)與校準(zhǔn)，以確保其性能處于最優(yōu)狀態(tài)。

4.4 數(shù)據(jù)分析方法

借助質(zhì)量控制類工具（例如FastQC）對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行查驗(yàn)，辨識(shí)低質(zhì)量的讀取內(nèi)容并予以過濾。隨后運(yùn)用工具（諸如Trimmomatic）除掉測(cè)序接頭序列，以保障數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)性與純凈度。按需實(shí)施低復(fù)雜度序列的過濾操作，用以降低分析過程中的噪聲增進(jìn)分析的準(zhǔn)確性。

在比對(duì)環(huán)節(jié)中，選取工具（如Bowtie、BWA）將經(jīng)過預(yù)先處理的測(cè)序數(shù)據(jù)和參考基因組或者轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比對(duì)，從而明確每個(gè)測(cè)序讀取在參考基因組上所處的位置。針對(duì)未能與參考基因組比對(duì)成功的樣本，則運(yùn)用組裝軟件（如SOAPdenovo、Velvet）實(shí)施組裝獲取連續(xù)片段（Contigs）。完成組裝后，通過物種鑒定軟件（如QIIME、Mothur）進(jìn)行微生物物種的判定，依照序列的相似性，把讀取分配至不同的分類單元。就多樣性分析來說，核算微生物群落的多樣性指數(shù)（如Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)），評(píng)定其豐富程度和均勻程度。另外，通過主坐標(biāo)分析（PCoA）等方式，將微生物群落的結(jié)構(gòu)差異予以可視化呈現(xiàn)。最后進(jìn)行差異表達(dá)分析，用以辨別在不同發(fā)酵條件下出現(xiàn)顯著變化的微生物和基因，從而為后續(xù)的研究提供線索。

5.結(jié)果與討論

5.1 水封發(fā)酵下微生物群落的變化

經(jīng)由高通量測(cè)序技術(shù)的解析，我們可以發(fā)現(xiàn)云南小曲清香型白酒水封發(fā)酵進(jìn)程里的微生物群落歷經(jīng)了顯著的變動(dòng)。在發(fā)酵初始階段，厚壁菌門與變形菌門屬于主要的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門，前者的乳酸菌逐步于后期處于主導(dǎo)地位。乳酸菌的代謝行為造就了大量乳酸，由此顯著提升了發(fā)酵體系的酸度，進(jìn)而對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的形成造成影響。舉例來講，在發(fā)酵起始的前兩天，乳桿菌屬的相對(duì)豐度較為平穩(wěn)，不過在發(fā)酵第三天往后迅猛增長(zhǎng)，一直到第五天抵達(dá)峰值，這顯示出乳桿菌在該過程里發(fā)揮了關(guān)鍵作用。確切來說，立克次體菌屬在發(fā)酵初期所占的比例較高，然而，伴隨發(fā)酵的推進(jìn)，其相對(duì)豐度持續(xù)降低，這表明其在低氧、高酸及高酒精的環(huán)境中生存的能力存在局限，與之相反的是，乳酸菌類的增多使其變成發(fā)酵體系里的優(yōu)勢(shì)群體。

5.2 酸產(chǎn)量的定量分析

對(duì)酸產(chǎn)量的定量測(cè)定表明，云南小曲清香型白酒于發(fā)酵進(jìn)程中的酸產(chǎn)量呈現(xiàn)出顯著的階段性變動(dòng)。在發(fā)酵起始階段酸的產(chǎn)出量較少，關(guān)鍵在于微生物群落尚未充分構(gòu)建產(chǎn)酸微生物的數(shù)量及代謝活性處于低位。伴隨發(fā)酵的深入，酸的產(chǎn)量逐步增加，進(jìn)入相對(duì)平穩(wěn)的時(shí)期，這和乳酸菌的繁衍及其代謝活動(dòng)的強(qiáng)化緊密相連。

在發(fā)酵的末期，酸的產(chǎn)量或許會(huì)產(chǎn)生起伏，這和眾多因素有關(guān)。其一，隨著酒精濃度的提高，部分產(chǎn)酸微生物的活性或許會(huì)遭受抑制；其二，其他微生物的代謝活動(dòng)也可能對(duì)酸的生成造成影響。其三，溫度與配糟比例的改變對(duì)酸的產(chǎn)量作用明顯。研究指出，最優(yōu)的發(fā)酵溫度處于20℃-30℃范圍內(nèi)，此時(shí)酸的生成較為穩(wěn)固。處于高溫或者低溫的環(huán)境時(shí)，酵母的活性與代謝效率會(huì)大幅降低，致使酸的產(chǎn)量降低。優(yōu)化發(fā)酵溫度和周期，能夠切實(shí)提升酸的產(chǎn)量，為白酒的質(zhì)量把控提供強(qiáng)勁的支撐。

5.3 不同發(fā)酵條件對(duì)酸產(chǎn)特性的影響

不同的發(fā)酵條件對(duì)酸的產(chǎn)量具有顯著影響，溫度和配糟比例屬于其中的關(guān)鍵要素。研究顯示，一旦發(fā)酵溫度超出38℃，酒曲微生物的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，甚至可能導(dǎo)致酸的產(chǎn)量下降。舉例來講，如果發(fā)酵初期溫度上升至41℃，或許會(huì)造成酵母菌提前衰亡，對(duì)產(chǎn)酸和出酒率產(chǎn)生影響；反之，在溫度恰當(dāng)?shù)臓顩r下，微生物的代謝活動(dòng)得以增強(qiáng)，酸的生成量明顯提高。

研究里常規(guī)的配糟質(zhì)量是酸度1.10-1.18，水分67%，稻殼含量12%，淀粉含量5%-5.1%。如果配糟質(zhì)量不平穩(wěn)，如酸度過高或者水分含量過大，就會(huì)直接干擾發(fā)酵的正常開展，進(jìn)而導(dǎo)致酸的生成匱乏。

5.4 結(jié)果的比較與討論

經(jīng)過對(duì)上述成果的全面剖析，我們能夠確切地洞察到微生物群落變動(dòng)跟酸產(chǎn)量的關(guān)聯(lián)，還有不同發(fā)酵狀況對(duì)其造成的作用。這些成果顯示微生物群落的動(dòng)態(tài)改變，不僅左右著發(fā)酵進(jìn)程中酸的生成，也對(duì)最終的風(fēng)味特質(zhì)產(chǎn)生了影響。特別是在發(fā)酵期間乳酸菌的快速增多，以及相對(duì)豐度的改變，直接與酸的產(chǎn)量起伏相對(duì)應(yīng)。與此同時(shí)，發(fā)酵條件的改進(jìn)為增進(jìn)云南小曲清香型白酒的質(zhì)量提供了科學(xué)根據(jù)。溫度的恰當(dāng)把控及配糟的合理運(yùn)用，不僅能夠推動(dòng)微生物的繁衍，還能最大限度地增加酸的產(chǎn)量，進(jìn)而完善釀造流程，最終增強(qiáng)產(chǎn)品的口感和風(fēng)味。

作者簡(jiǎn)介

趙剛（1985.09-），男，漢族，云南楚雄人，大專，國家一級(jí)品酒師，釀酒師；研究方向：云南小曲清香型白酒微生物發(fā)酵、生產(chǎn)技術(shù)，酒體設(shè)計(jì)等。

龐春雄（1988.11-），男，漢族，云南昆明人，大專；研究方向：白酒生產(chǎn)釀造。

龐浩（1984.09-），男，漢族，云南昆明人，高中；研究方向：白酒生產(chǎn)釀造。

付樹良（1982.03-），男，漢族，云南昌寧人，大專；輕紡工程、釀酒工程工程師；研究方向：發(fā)酵工程。