基于線粒體COI基因的江蘇湖泊鳙群體遺傳多樣性分析

摘 要：為掌握江蘇湖泊鳙群體的遺傳資源狀況，利用COⅠ基因序列研究了6個湖泊（太湖、滆湖、長蕩湖、高郵湖、洪澤湖和駱馬湖）鳙群體的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，在分析的630 bp COⅠ基因片段中，堿基A+T含量（55.3%）高于C+G含量（44.7%）。223條COⅠ序列檢測出14個變異位點，定義9個單倍型，6個群體的單倍型多樣性為0.494～0.665，核苷酸多樣性為0.000 9～0.001 9，總體單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.576和0.001 2，具有高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特點，表明6個湖泊鳙群體遺傳多樣性較低。分子方差分析結(jié)果顯示，遺傳變異主要來自于群體內(nèi)（99.39%），總遺傳分化指數(shù)為0.006 1，群體間遺傳分化指數(shù)為-0.022 8～0.044 5，遺傳距離為0.001 2～0.002 7，表明群體間沒有明顯的遺傳分化。單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖顯示，單倍型在6個群體中混雜分布，未形成特定的湖泊分支。中性檢驗和歧點分布分析表明，整個鳙群體經(jīng)歷過顯著的種群擴張。結(jié)果表明，江蘇湖泊鳙群體的遺傳多樣性較低，遺傳結(jié)構(gòu)趨于同質(zhì)化，需要采取措施提高鳙的遺傳多樣性。

關(guān)鍵詞：鳙；COⅠ基因；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)；增殖放流

鳙（Aristichthys nobilis）俗稱花鰱、胖頭魚，隸屬于鯉形目（Cypriniformes）、鯉科（Cyprinidae）、鳙屬（Aristichthys），廣泛分布于全國各大江河及其附屬湖泊［1］。鳙是我國“四大家魚”之一，具有生長速度快、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟價值高、養(yǎng)殖技術(shù)成熟等優(yōu)勢，已成為我國重要的大宗淡水養(yǎng)殖魚類。鳙為濾食性魚類，主要攝食浮游動物，在修復(fù)水體環(huán)境及維持水域生態(tài)系統(tǒng)平衡穩(wěn)定中具有重要作用［2-4］。鳙屬于江湖洄游型魚類，不能在湖泊中繁殖，加之江湖阻隔、環(huán)境污染、過度捕撈等不利因素的影響，湖泊鳙天然資源嚴重衰退，個體低齡化、小型化現(xiàn)象嚴重［1，5-8］。為增加湖泊鳙資源量及修復(fù)湖泊生態(tài)環(huán)境，多年來我國開展了大規(guī)模的增殖放流活動，這對于恢復(fù)湖泊鳙資源量起到了重要作用，同時也可能會對湖泊鳙的種質(zhì)資源遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響［9-11］。為了避免人工放流群體對野生群體的負面影響，應(yīng)在放流之前評估野生群體的遺傳特征［12］。

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，也是生物適應(yīng)環(huán)境的基礎(chǔ)和物種進化的動力，掌握生物的遺傳多樣性對于科學(xué)保護和合理利用生物資源具有重要指導(dǎo)作用。線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是研究物種群體遺傳多樣性常用的分子標記，具有結(jié)構(gòu)簡單、母系遺傳、不易發(fā)生基因重組且進化速度快等諸多特點［13］。其中，細胞色素氧化酶Ⅰ亞基（cytochrome oxidase subunit Ⅰ，COⅠ）基因的結(jié)構(gòu)和功能較為清楚，進化速率較快，且有通用引物便于擴增和測序，因此被廣泛應(yīng)用于水生動物尤其是魚類的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究［14-16］。

長江中下游區(qū)域是我國湖泊集中分布區(qū)，也是我國規(guī)劃的內(nèi)陸6個主要水生生物增殖放流區(qū)域之一。鳙在長江中下游區(qū)域的放流數(shù)量居第2位，其功能定位主要為漁民增收及生物凈化［9］。本研究擬采用COⅠ基因序列作為分子標記，探究增殖放流對江蘇省6個湖泊（太湖、滆湖、長蕩湖、高郵湖、洪澤湖和駱馬湖）鳙群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的影響，以期為科學(xué)保護和合理利用鳙種質(zhì)資源及規(guī)范人工放流提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本采集和處理

2020—2022年在長江流域的太湖、滆湖和長蕩湖及淮河流域的高郵湖、洪澤湖和駱馬湖開展?jié)O業(yè)資源監(jiān)測，共采集鳙樣本223尾，現(xiàn)場進行種類鑒定及生物學(xué)測量，采樣水域及各群體樣本數(shù)量見表1。采集樣本后，剪取鳙的尾鰭組織，放入2 mL離心管，加入無水乙醇保存于4 ℃冰箱。

1.2 基因組提取、PCR擴增和測序

使用DNA試劑盒（TaKaRa公司）提取鳙的基因組DNA，將DNA溶于ddH2O，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，保存于-20 ℃冰箱備用。

通過引物FishF1（5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′）和FishR1（5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′）擴增COⅠ基因序列［17］。PCR反應(yīng)體系共50 μL，其中包括：2×Premix TaqTM 25 μL（TaKaRa Taq 1.25 U/25 μL、0.2 mmol/L dNTP、1.5 mmol/L Mg2+）、上下游引物各2 μL（10 μmol/L）、DNA模板2 μL和ddH2O 19 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，55 ℃復(fù)性40 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

通過BioEdit 7.0.9.0軟件［18］讀取序列，并對序列進行編輯和校對。使用CLUSTAL X2.0軟件［19］進行多重比對和排序，獲取長度一致性序列。通過DanSP 5.0軟件［20］計算群體的單倍型數(shù)量、單倍型多樣性（haplotype diversity，Hd）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，Pi）、變異位點（variable sites）、單一信息位點（singleton sites）、簡約信息位點（parsimony-informative sites）等。采用MEGA 7.0.26軟件［21］統(tǒng)計序列的堿基組成，計算群體間的遺傳距離。以鰱為外類群，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)樹中節(jié)點的自舉置信水平應(yīng)用自引導(dǎo)估計（循環(huán)次數(shù)為1 000次）。采用Network 4.5.1軟件［22］構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖，檢測各個單倍型間的進化關(guān)系。使用Arlequin 3.5軟件［23］進行分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA），檢測遺傳變異來源，計算群體間遺傳分化指數(shù)（Fst）。通過Tajima’s D、Fu’s Fs中性檢驗和錯配分布分析推測鳙群體的歷史動態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 COⅠ序列變異及遺傳多樣性

本研究獲得了223尾鳙的線粒體COⅠ基因序列，其長度為630 bp，序列中無堿基的插入和缺失。223條COⅠ序列的平均堿基組成為A（26.6%），T（28.7%），C（27.2%），G（17.5%）。A+T的含量（55.3%）高于C+G的含量（44.7%），堿基組成表現(xiàn)出明顯的偏倚。在223條序列中，共有14個變異位點，占總位點數(shù)的2.22%，其中單突變位點有9個，簡約信息位點有5個。

6個鳙群體的單倍型多樣性（Hd）為0.494～0.665，核苷酸多樣性（Pi）為0.000 9～0.001 9，其中太湖群體的遺傳多樣性最高，長蕩湖群體的遺傳多樣性最低。6個群體的總體單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.576和0.001 2，呈現(xiàn)出高Hd和低Pi模式（見表1）。

2.2 群體單倍型組成及系統(tǒng)發(fā)育

6個鳙群體定義9個單倍型（Hap 1～Hap 9），其中單倍型Hap 1、Hap 2和Hap 7為6個群體的共享單倍型，個體數(shù)量有206個；單倍型Hap 3、Hap 4和Hap 6為部分群體所共享，個體數(shù)量有14個；單倍型Hap 5、Hap 8和Hap 9為太湖群體所獨享，個體數(shù)量有3個（見表2）。

單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，單倍型Hap 1～Hap 8聚為一支，單倍型Hap 9聚為一支，單倍型隨機分布在6個群體中，并未形成相應(yīng)的地理分支（見圖1）。單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖呈星型（見圖2），也沒有形成特定的地理譜系結(jié)構(gòu)，進一步支持了單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果。單倍型Hap 2位于中心位置，且個體數(shù)量最多，推測為祖先單倍型。

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)

分子方差結(jié)果顯示，6個群體中，群體內(nèi)的遺傳變異占總體變異的99.39%，群體間的遺傳變異為0.61%，6個群體間遺傳分化指數(shù)為0.006 1（Fstlt;0.05），表明群體間的遺傳變異主要來自群體內(nèi)個體間（見表3）。

兩兩群體間的遺傳分化指數(shù)為-0.022 8～0.044 5（Fstlt;0.05），遺傳距離為0.001 2～0.002 7（見表4），表明群體間親緣關(guān)系較近，沒有產(chǎn)生明顯的遺傳分化。

2.4 群體歷史動態(tài)

中性檢驗結(jié)果顯示，太湖、長蕩湖、洪澤湖和駱馬湖的Tajima’s D值和Fu’s Fs值均為負值，只有太湖群體的統(tǒng)計檢驗具有顯著性差異，其他群體的統(tǒng)計檢驗沒有顯著性差異（見表5）。滆湖和高郵湖群體的Tajima’s D值和Fu’s Fs值為正值，統(tǒng)計檢驗也沒有顯著性差異。整個鳙群體的Tajima’s D值和Fu’s Fs值為負值，統(tǒng)計檢驗具有顯著性差異，且歧點分布曲線呈明顯的單峰型（見圖3），表明整個鳙群體經(jīng)歷過種群擴張。

3 討論

3.1 鳙群體的遺傳多樣性

單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（Pi）是評價物種遺傳多樣性的兩個重要指標，其數(shù)值越大，表明群體遺傳變異越豐富［24］。核苷酸多樣性考慮了各種單倍型在群體中所占的比例，更能精確反映群體的多態(tài)程度［25］。本研究基于COⅠ序列分析了江蘇6個湖泊鳙群體的遺傳多樣性，得出單倍型多樣性為0.494～0.665，核苷酸多樣性為0.000 9～0.001 9，總體單倍型和核苷酸多樣性分別為0.576和0.001 2。根據(jù)Grant等［26］提出的單倍型多樣性和核苷酸多樣性大小標準，太湖、滆湖、高郵湖和洪澤湖群體屬于高Hd和低Pi模式，長蕩湖和駱馬湖群體屬于低Hd和低Pi模式，6個群體的核苷酸多樣性均明顯小于0.005，表明鳙群體的遺傳多樣性較低。與鳙相似，湖泊水庫鰱的遺傳多樣性也較低［12，27-28］，這是因為湖庫中的鰱、鳙不能自然繁殖，其資源量主要來源于人工放流群體，由于放流群體的親本數(shù)量有限及人工選擇作用，更容易發(fā)生瓶頸效應(yīng)和近交衰退，造成一些稀有等位基因的丟失，進而導(dǎo)致放流群體的遺傳多樣性普遍低于野生群體［29-30］。比較而言，長江鳙群體的遺傳多樣性比較豐富［10，31-32］，可通過灌江納苗及江湖連通，將長江鳙種質(zhì)資源補充到湖泊中，提高湖泊鳙群體的遺傳多樣性。

3.2 鳙群體的遺傳結(jié)構(gòu)

通常采用遺傳分化指數(shù)判定群體間的遺傳差異大小。Wright［33］認為，F(xiàn)st值在0～0.05表示群體分化較弱，在0.05～0.15表示群體中等分化，在0.15～0.25表示群體分化較大，F(xiàn)st值大于0.25表示群體分化極大。本研究顯示，鳙群體間的Fst為-0.022 8～0.044 5，均小于0.05，表明群體間沒有產(chǎn)生明顯的遺傳分化。分子方差分析表明，大部分的遺傳變異來自于群體內(nèi)個體間，僅有0.61%的遺傳變異源于群體間。群體間的遺傳距離為0.001 2～0.002 7，明顯低于地理群體間分化閾值［34］。群體擁有多個共享單倍型，且共享單倍型的個體數(shù)量占據(jù)絕對優(yōu)勢（92.4%），均說明6個群體間親緣關(guān)系較近，遺傳結(jié)構(gòu)趨于同質(zhì)化。這種遺傳結(jié)構(gòu)模式可能受以下因素的影響：（1）增殖放流。湖泊鳙增殖放流的苗種主要來源于省內(nèi)的原良種場，通過微衛(wèi)星分子標記檢測發(fā)現(xiàn)，鳙親本沒有明顯的遺傳分化［35］，所以放流群體的遺傳變異較小。（2）江淮下游河網(wǎng)密布，鳙群體間直接或間接相連通，有利于群體間基因交流［36］。（3）鳙的運動能力和適應(yīng)能力強，活動范圍廣，群體間地理位置較近，沒有地理隔離。根據(jù)鳙群體的遺傳結(jié)構(gòu)特征，可以將6個湖泊鳙群體視為一個遺傳單元進行管理。

3.3 湖泊鳙的資源管理和保護措施

本研究通過線粒體COⅠ基因序列，獲得了6個湖泊鳙群體的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果顯示，鳙群體的遺傳多樣性較低，其中太湖、滆湖、高郵湖和洪澤湖群體的遺傳多樣性相對較高，而長蕩湖和駱馬湖群體的遺傳多樣性相對較低。6個鳙群體間遺傳變異較小，沒有產(chǎn)生遺傳分化，應(yīng)將6個群體視為一個進化單元進行管理。增殖放流是影響湖泊鳙群體遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的重要因素。

根據(jù)研究結(jié)果，建議采取以下措施保護和恢復(fù)湖泊鳙的種質(zhì)資源遺傳多樣性：（1）強化漁政管理，禁止非法捕撈，落實涉漁工程生態(tài)補償措施，開展生態(tài)環(huán)境治理、修復(fù)。（2）加強增殖放流監(jiān)督管理，科學(xué)規(guī)范開展增殖放流，提高放流苗種的成活率。開展親本和苗種遺傳多樣性檢測，增加親本數(shù)量和種質(zhì)更新速度，提升放流苗種的遺傳多樣性。（3）通過灌江納苗或江湖連通等方式，將遺傳多樣性較為豐富的長江鳙種質(zhì)資源補充到湖泊中，增加湖泊鳙群體的資源量及遺傳多樣性。

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Genetic diversity analysis of Aristichthys nobilis populations from

freshwater lakes in Jiangsu province based on mitochondrial DNA" COⅠ gene

LI Daming1， LIU Yanshan1， TANG Shengkai1， ZHANG Zeng1，

WANG Chaoqun1， MU Huan2， WANG Hua3

（1. Freshwater Fisheries Research Institute of Jiangsu Province，

Key Laboratory of Fisheries Resources in Inland Waters of Jiangsu Province，

Nanjing 210017，China;

2. Hongze Lake Fisheries Administration Committee Office of Jiangsu Province，Huaian 223300，China;

3. Fisheries Management Commission of Ge Lake of Jiangsu Province，Changzhou 213100，China）

Abstract： To understand the genetic status of Aristichthys nobilis populations from freshwater lakes in Jiangsu province of China，the genetic diversity and genetic structure of A. nobilis from six freshwater lakes（Tai Lake，Ge Lake，Changdang Lake，Gaoyou Lake，Hongze Lake and Luoma Lake） were analyzed based on" COⅠ gene sequences.The results showed that in the analyzed 630 bp" COⅠ gene fragment，the A+T base composition（55.3%） was higher than the G+C combination（44.7%）.A total of 14 variable sites were detected and 9 haplotypes were defined from 223" COⅠ sequences.The haplotype diversity of the six populations ranged from 0.494 to 0.665，and nucleotide diversity varied 0.000 9 to 0.001 9. The total haplotype diversity（Hd） and nucleotide diversity（Pi） was 0. 576 and 0. 001 2，respectively，indicating high haplotype diversity and low nucleotide diversity pattern，demonstrating low genetic diversity. Analysis of molecular variance（AMOVA） showed that genetic variations mainly occurred within the populations（99.39%），the total genetic differentiation index（Fst） was 0.006 1.The pairwise Fst ranged from -0.022 8 to 0.044 5，and the genetic distance among populations varied from 0.001 2 to 0.002 7，indicating no significant genetic differentiation among populations.The haplotype neighbor-joining phylogenetic tree and network structure diagram both showed that the haplotypes were randomly distributed in six populations，without forming a specific geographic clade.Both neutral tests and mismatch distribution analysis indicate that A. nobilis had experienced significant population expansion.The study showed that the genetic diversity of A. nobilis populations from freshwater lakes in Jiangsu province was relatively low，and their genetic structure tended to be homogenized.So，more measures should be taken to improve the genetic diversity of A. nobilis.

Key words： Aristichthys nobilis; COⅠ gene; genetic diversity; genetic structure; stock enhancement