大西洋鮭傳染性胰腺壞死病病毒VP2蛋白和VP3蛋白重組腺病毒載體的構建及其表達

摘 要：

傳染性胰腺壞死?。╥nfectious pancreatic necrosis，IPN）是由傳染性胰腺壞死病病毒（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）引起的一種主要危害鮭科魚類的傳染病。為克隆傳染性胰腺壞死病病毒（IPNV）VP2基因和VP3基因，并構建其重組腺病毒載體，利用PCR方法分別擴增出IPNV VP2基因和VP3基因，通過多基因片段同源重組技術將IPNV VP2基因和VP3基因克隆到pAd-Track-CMV載體，經過線性化后與pAd-easy-1載體在BJ5183菌體內進行同源重組，構建出重組腺病毒質粒；通過PCR及Not Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，再經Pac Ⅰ線性化后用于轉染293T細胞，獲得重組腺病毒；通過綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達監控重組腺病毒的復制情況，用Western-blotting法分別檢測IPNV VP2蛋白和VP3蛋白的表達，并測定重組病毒滴度。結果顯示，分別克隆出IPNV VP2和VP3基因，基因總長度為2 211 bp，構建出目的基因重組腺病毒載體，該病毒在293T細胞中分別表達出蛋白分子質量約為54 kD和26 kD的產物，滴度為1.0×109 個/mL TCID50。結果表明，已成功獲得IPNV VP2基因和VP3基因重組腺病毒，該病毒在293T細胞中滴度較高，能夠穩定表達。傳染性胰腺壞死病病毒VP2蛋白和VP3蛋白重組腺病毒載體的成功構建可為大西洋鮭傳染性胰腺壞死病活載體疫苗的研制提供參考。

關鍵詞：大西洋鮭；傳染性胰腺壞死??；VP2基因；VP3基因；腺病毒載體

傳染性胰腺壞死?。╥nfectious pancreatic necrosis，IPN）是由傳染性胰腺壞死病病毒（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）引起的一種主要危害鮭科魚類的傳染?。?-2］。該病常見于多種水生動物中，由于極高的死亡率，嚴重威脅著許多海洋魚類、淡水魚類和軟體動物等多種水生動物［3-4］。IPN在美國、歐洲、亞洲、澳大利亞和南非等多個國家和地區的鮭科魚類養殖場先后被報道，給世界各國的鮭科魚類養殖業造成了巨大的經濟損失［5-8］。IPNV是一種無包膜的雙鏈RNA病毒，隸屬于水生動物雙RNA病毒屬［1，9］。該病毒分為A段和B段，其中A段編碼VP2、VP3、VP4和VP5這4種蛋白；B段編碼1種RNA聚合酶蛋白（VP1）。其中VP2和VP3兩種蛋白是IPNV的主要結構蛋白［1-2］。VP2蛋白和VP3蛋白含有病毒的大部分中和表位，與病毒的毒力相關。這些表位可以誘導機體產生抗IPNV中和抗體［1，2，9-11］。

近年來，對重組腺病毒載體的研究越來越受到人們關注。由于重組腺病毒具有滴度高、轉染效率高和不會將外源基因組整合到宿主基因組中的優點，因而該病毒載體被廣泛用于多種基因的表達和多種病原體疫苗的基因傳遞［12-16］。重組腺病毒能夠有效地將外源基因轉移到多種細胞系中，并且可以刺激宿主機體對目的基因產生強有效和持續的特異性體液和細胞免疫反應［12，17］。同時，重組腺病毒能夠感染多種硬骨魚細胞系［18］。另外，口蹄疫病毒2A肽（foot-and-mouth disease virus 2A peptide，F2A）蛋白長度較短、能夠高效率切割位于F2A肽上游和下游的基因，從而被廣泛用于單個質粒同時進行多個病原基因的表達［19-21］。

本研究分別擴增出IPNV VP2基因和VP3基因，以重組腺病毒作為基因傳遞載體，利用具有高切割效率的F2A肽，構建出能夠同時表達IPNV VP2蛋白和VP3蛋白的重組腺病毒載體并獲得重組腺病毒，旨在為傳染性胰腺壞死病重組腺病毒疫苗的研發提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 載體、細菌菌株和主要試劑

pAd-Track-CMV載體、pAd-easy-1載體、BJ5183感受態細胞、DH5α感受態細胞和DH10B感受態細胞，均購自上海秋爽生物科技有限公司。

多基因片段同源重組克隆試劑盒、RNA提取試劑盒、GXL DNA聚合酶和限制性核酸內切酶，均購自NEB（北京）生物技術有限公司；RNA反轉錄試劑盒，購自德國羅氏公司（Roche）；細胞高糖培養基（D-MEM）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），均購自美國Gibco公司；DNA Marker，購自上海百賽生物科技有限公司；小鼠抗IPNV，購自美國CD公司；脂質體（LipofectamineTM）3000，購自美國英杰生物科技有限公司。其他化學試劑，購自美國Sigma生物科技有限公司。

1.1.2 陽性病毒樣品與細胞系

IPNV陽性病料（腎臟、脾臟等組織）采集于青海省尖扎縣某大西洋鮭養殖基地。人胚腎細胞系（293T）由中國水產科學研究院東海水產研究所提供。

1.1.3 主要儀器和設備

PCR擴增儀、核酸電泳系統、紫外凝膠成像系統，均購自北京六一儀器有限公司；蛋白電泳系統、轉膜系統，均購自美國伯樂儀器有限公司；組織破碎儀，購自德國Eppendorf公司；低溫離心機、CO2恒溫培養箱，均購自賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.2 IPNV VP2基因、F2A基因和IPNV VP3基因開放閱讀框（open reading frame，ORF）的擴增

選用GenBank上已經公開發表的IPNV VP2和VP3基因序列（登錄號：KF279643.1），應用DNA Star分別設計出特異性引物。IPNV VP2基因正向擴增引物增加了pAd-Track-CMV載體同源臂和Not Ⅰ酶切位點：5′-ATCTCTAGACCATGGCAGCTGCGCCGGCGATGAACACAAACAAGGCAACC-3′，反向擴增引物：5′-GTTGGTCTTGGTGAGATCTCC-3′；IPNV VP3基因正向擴增引物：5′-ATGGACGAGGAACTGCAACGCCT-3′，反向擴增引物增加了pAd-Track-CMV載體同源臂和Hind Ⅲ酶切位點：5′-CTAGCCTATAGAATAGATCAAGCTTCACCTCAGCGTTGTCTCCG-3′；從GenBank獲得的F2A基因序列（登錄號：AJ251473.1）由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。F2A肽基因克隆正向擴增引物：5′-AGATCTCACCAAGACCAACAACTTTGACCTGTTAAAGT-3′，反向擴增引物：5′-GTTCCTCGTCCATGGTTGGACTCAACGTCTCCCGC-3′。

按照RNA提取試劑盒說明書提取IPNV總RNA。使用羅氏反轉錄試劑盒以提取的RNA為模板合成cDNA。反應總體系為20 μL，包括1.0 μg總RNA，1.0 μL Oligo（dT）18引物，0.5 μL反轉錄酶，4.0 μL酶緩沖液，1.0 μL蛋白酶抑制劑，2.0 μL脫氧核苷酸，加DEPC水使體系為20 μL；反應條件為：65 ℃反應10 min，55 ℃反應30 min，85 ℃反應5 min。

以合成的cDNA為模板進行基因擴增，即10×PrimeSTAR GXL緩沖液5.0 μL、dNTP混合物4.0 μL、GXL DNA聚合酶1.0 μL、cDNA 4.0 μL，正、反向引物各（10 μmol/L）1.5 μL，加DEPC水使體系為50 μL。反應條件：95 ℃反應3 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸4 min，共31次循環；72 ℃反應10 min。將8.0 μL的PCR產物加到1.5%核酸電泳中進行驗證。分別克隆出IPNV VP2基因、F2A基因和IPNV VP3基因的陽性產物后，送至武漢金開瑞生物工程有限公司進行測序，將測序結果拼接并與目的序列進行比對分析。

1.3 目的基因（IPNV VP2基因、F2A基因和IPNV VP3基因）和pAd-Track-CMV載體的同源重組

將5 ng IPNV VP2基因PCR產物、30 ng F2A基因PCR產物、5 ng IPNV VP3基因PCR產物、20 ng線性化pAd-Track-CMV載體、1 μL快速融合酶及2 μL 10×酶緩沖液加入到反應體系，并加ddH2O使總體系為20 μL。反應條件：37 ℃孵育30 min；孵育結束后馬上將同源重組產物轉化至DH5α感受態細胞，涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養基平板，置于37 ℃培養箱中培養16～20 h，挑取較小菌落培養后利用PCR篩選陽性。PCR鑒定正向引物：5′-ATGAACACAAACAAGGCAACC-3′，反向引物：5′-CACCTCAGCGTTGTCTCCG-3′。對陽性產物大量培養后提取質粒并用Not Ⅰ和Hind Ⅲ進行酶切鑒定，篩選為陽性的質粒進行測序。將測序結果用BLAST分析，以鑒定PCR產物與目的序列之間的氨基酸是否存在差異。同時設置pAd-Track-CMV空載體作為陰性對照。

1.4 pAd-Track-CMV載體與pAd-Easy-1載體的重組連接

將pAd-Easy-1載體轉化到BJ5183感受態細胞中，挑取陽性BJ5183細菌做成電轉化感受態細胞，置于液氮中保存待用。

將“1.3”中所述連接成功的重組質粒用Pme I酶切使之線性化，按照PCR Clean-up試劑盒說明書純化酶切產物。將10 μL純化產物電轉化至40 μL電感受態BJ5183細胞中，電擊條件：電壓2 500 V，電阻200 Ω，電容25 μF，電擊時長5 ms。電擊后，將重組混合物涂布于含有100 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養16～20 h，挑選較小的菌落培養后進行PCR鑒定，PCR產物用0.8%的核酸電泳進行檢測，對陽性產物大量培養后提取質粒并用PacⅠ進行酶切鑒定。同時將pAd-Track-CMV空載體和pAd-Easy-1載體的重組空質粒作為陰性對照。

使用與上述電擊相同的條件，將篩選的陽性質粒電轉到DH10B感受態細胞中。挑取菌落培養后提取質粒并用PacⅠ進行酶切鑒定，陽性酶切產物回收后用于下一步轉染。

1.5 重組腺病毒質粒轉染293T細胞

轉染前24 h，將293T細胞以1.0×107 個/mL接種于25 cm2細胞瓶中培養。待細胞貼壁率為瓶底面積的60%～80%時可用于轉染。用2 mL的D-MEM將待轉染細胞洗滌2～3次，加入2 mL空白的D-MEM，于37 ℃孵育30 min。吸取30 μL LipofectamineTM3000加到900 μL D-MEM中，制成細胞培養液A；將4 μg線性化重組腺病毒質粒加入培養液A中，于37 ℃下孵育20 min；將孵育好的混合培養液加入到細胞中，于37 ℃孵育4 h；之后棄去培養液，補加10 mL含有10%FBS的D-MEM培養基，置于培養箱繼續培養。培養2 d后，通過觀察綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）來檢測轉染結果。當細胞上表達出最強的GFP時，小心棄去5 mL上層細胞培養液，收集剩余的培養液進行病毒傳代［22］。

1.6 抗原蛋白的Western-blotting檢測

收集感染293T細胞的病毒液并用RIPA裂解緩沖液裂解5 min，收集裂解后的蛋白樣品之后，用超聲波進行破碎處理（40 W作用3 s，間隔3 s，重復20次），在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，吸取上清液加入6× Loading Buffer，95 ℃作用10 min。將制備的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳條件：電壓80 V電泳1 h，之后將電壓調至120 V直至結束。以β-actin作為對照組，參考蛋白分子質量標準切下凝膠，將待測蛋白樣品轉移到PVDF膜上，反應條件：電流200 mA電泳2 h。結束后，將膜置于配制的50 g/L牛血清白蛋白中封閉1 h，用PBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。將封閉好的膜與1∶1 000稀釋的鼠抗IPNV一抗孵育1 h，用PBST緩沖液洗滌3次，每次10 min；之后將該膜與1∶2 000稀釋的羊抗鼠二抗孵育2 h，用PBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。最后加入配制的顯影劑，檢測膜的化學發光反應［23］。

1.7 病毒滴度的測定

將繁殖10代后收集的病毒液用D-MEM從10-1連續稀釋到10-11。稀釋好的病毒分別接種于含有293T細胞的96孔板內。每個稀釋度接種100 μL，相同稀釋度重復8個孔。接種24 h后，通過每天觀察每個孔的GFP和細胞病變效應（cytopathic effect， CPE）來確定病毒的病變情況。將記錄的每孔CPE情況使用Reed-Muench方法計算得到重組病毒的滴度［22-23］。

2 結果

2.1 IPNV VP2基因和VP3基因的克隆結果

IPNV VP2基因和VP3基因的重組腺病毒構建結果見圖1。PCR產物利用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，得到了總長度為2 211 bp的基因片段，與預期的目的基因片段長度一致。

2.2 重組質粒分析

經PCR鑒定，目的基因產物（VP2基因、F2A基因和VP3基因）的擴增長度為2 211 bp，見圖1-（a）。通過Not Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后得到2 211 bp和9 200 bp兩個片段，見圖1-（b），與預期結果相符。結果表明，利用多基因片段同源重組技術成功構建了pAd-Track-CMV重組質粒。

2.3 同源重組的鑒定

pAd-Track-CMV載體和pAd-Easy-1載體同源重組質粒的構建結果利用PCR和PacⅠ酶切來驗證，鑒定結果見圖1（c）。PCR產物的長度為2 211 bp。經PacⅠ酶切，能夠得到大約33.7 kb和4.5 kb的兩條清晰條帶。結果表明，利用同源重組技術已成功構建重組腺病毒質粒。

2.4 抗原蛋白的檢測

將重組腺病毒轉染到293T細胞中，通過Western-blotting方法檢測VP2蛋白和VP3蛋白的表達情況。相較于對照組，重組腺病毒分別檢測出分子量約為54 kD和26 kD的兩條蛋白條帶（見圖2）。結果表明，在收獲的重組腺病毒中能夠表達出VP2蛋白和VP3蛋白。

2.5 病毒滴度的測定

轉染重組腺病毒后，36 h后逐漸能夠觀察到細胞中的GFP，待70%～80％的細胞上出現GFP和CPE時（見圖3），收獲此時的病毒液反復凍融2～3次用于傳代。

重組腺病毒傳至10代后，接種于293T細胞上，36 h之內便可出現穩定的CPE。根據Read-Muench方法計算，重組腺病毒滴度為1.0×109個/mL TCID50。

3 討論

鮭科魚類是深遠海養殖的重要品種，目前已經在“深藍1號”全潛式深海漁場等項目中養殖成功。在此背景下，積極開展魚病防治技術研究，有利于深遠海養殖業的可持續發展［24-26］。

傳染性胰腺壞死?。↖PN）主要以感染鮭科魚類幼魚為主，能夠引起極高的死亡率，近年來，已給全球多個國家的鮭鱒魚類養殖業造成了重大的經濟損失［27-29］。IPN于1986年在中國東北地區被報道［23］。由于缺乏強有力的防控措施，該病的暴發頻繁，目前已遍布于中國青海、甘肅及遼寧等多個省，成為威脅中國現代化鮭科魚類養殖業最為嚴重的傳染?。郏?3］。

疫苗接種是有效控制傳染病大規模暴發的最佳方法之一［23］。目前多個國家和地區的研究人員已經研發出多種用于防控IPN的疫苗，如亞單位疫苗、滅活疫苗、減毒疫苗和DNA疫苗等［5，9-11，15］，其中一種IPN口服酵母疫苗在荷蘭獲得生產許可并被商業化應用到鮭科魚類養殖業中。盡管研究人員已經研制出多種用于防控IPN的候選疫苗，但此類疫苗在保護虹鱒等鮭科魚類免受IPNV感染時均表現出較差的免疫反應［11］。因此，在鮭科魚類養殖過程中，IPN的暴發仍然是一個嚴峻的問題，亟需開發出保護效果更佳、使用更為便利的疫苗用于防控IPN。本研究將IPNV VP2基因和VP3基因共同構建到腺病毒載體上，利用具有自切割功能的F2A肽蛋白，使得重組腺病毒載體可以同時表達出IPNV VP2蛋白和VP3蛋白，為下一步研發出傳染性胰腺壞死病活載體疫苗提供了前期的理論依據。

重組腺病毒具有極高的轉染效率，該病毒載體能夠在機體內外高效率地轉染外源基因，從而誘導機體產生有效的黏膜免疫和T細胞免疫反應［30-31］。由于轉錄活性形式的活化T細胞的有效免疫反應，使得重組腺病毒載體在機體內表現出持久性的免疫應答反應［32］。相比于傳統疫苗，重組腺病毒的安全性、長期持久的免疫應答和較強的免疫原性使其成為用于疫苗開發的理想基因轉移載體［33-35］。在多種動物機體內，腺病毒載體可以誘導比腸外免疫更有效的黏膜免疫反應［30-31］。另外，腺病毒能夠感染EPC、CHSE-214等在內的多種硬骨魚細胞系。本課題組之前以重組腺病毒作為載體，成功研發出傳染性造血器官壞死病的活體疫苗，并采用浸泡的免疫方式對虹鱒進行免疫，結果表明，相比于對照組虹鱒，免疫組虹鱒的免疫反應和血清中的抗體水平顯著升高，接種組虹鱒受到傳染性造血器官壞死病感染時的相對生存率（relative percentage survival，RPS）為92%［22］，這為重組腺病毒應用于硬骨魚類多種疫病活載體疫苗的研制提供了參考。此外，F2A肽的側翼蛋白長度比較短，在其上游和下游的基因之間具有較高的切割效率［19］。因此，具有切割功能的F2A肽通常被用于表達兩種及兩種以上靶蛋白的理想選擇。

本研究采用多基因片段同源重組技術，能夠在短時間將IPNV VP2基因和VP3基因精確連接至pAd-Track-CMV載體，從根本上避免了傳統選用T載體進行連接操作的復雜性，大大提高了目的基因和載體的連接效率。分別克隆了IPNV VP2基因和VP3基因，以腺病毒作為基因表達載體，利用具有高切割效率的F2A肽，通過在293T細胞中的轉染以獲得高滴度重組腺病毒，構建出可同時表達IPNV VP2蛋白和VP3蛋白的重組腺病毒載體。本研究中F2A肽的應用使得腺病毒載體能夠同時表達出IPNV VP2蛋白和VP3蛋白，為研制出針對IPNV的活載體疫苗提供了可能。此外，傳統DNA疫苗需要進行肌肉注射，在大西洋鮭等鮭科魚類養殖產業化中難以推廣，本研究利用重組腺病毒載體能夠誘導機體產生有效的黏膜免疫和T細胞免疫反應，在機體內表現出持久性的免疫應答，為虹鱒等鮭科魚類采用浸泡免疫方式進行疫苗接種提供了可操作性，使得重組腺病毒載體有望應用于防控虹鱒等鮭科魚類免受IPNV等病毒的感染。

綜上所述，本研究分別克隆出IPNV VP2基因和VP3基因，將F2A肽連接到IPNV VP2基因和VP3基因之間，通過在293T細胞中的轉染以獲得高滴度重組腺病毒，構建出能夠同時表達IPNV VP2蛋白和VP3蛋白的重組腺病毒載體，為鮭科魚類傳染性胰腺壞死病活載體疫苗的研制提供了理論基礎。

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Construction and expression of recombinant adenovirus vector against

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LI Shouhu， QIN Chuang， LI Xincang， SHI Jiangao

（East China Sea Fisheries Research Institute，

Chinese Academy of Fishery Sciences， Shanghai 200090， China）

Abstract： Infectious pancreatic necrosis （IPN） was an infectious disease caused by infectious pancreatic necrosis virus （IPNV）， which mainly affected salmonids.To clone the infectious pancreatic necrosis virus （IPNV） VP2 gene and VP3 gene， constructed their recombinant adenovirus vector. In this study， the IPNV VP2 gene andVP3 gene were amplified and inserted into the pAd-Track-CMV vector by PCR and multi-gene fragment homologous recombination technology. After linearization， the recombinant plasmids were recombined with the pAd-easy-1 vector in E. coli BJ5183 to construct a recombinant adenovirus plasmid， which was identified by PCR and digestion with NotⅠand HindⅢ ， and then transfected into 293T cells to obtain the recombinant adenovirus after linearizing with PacⅠ. The viral replication was monitored using the expression of green fluorescent protein （GFP）. The expression of VP2 protein and VP3 protein were confirmed by the Western-blotting method， and the recombinant viral titer was detected. The results indicated that the IPNV VP2 gene and VP3 gene were cloned with a length of 2 211 bp， and the recombinant adenovirus vectors for the target genes were constructed. The virus could express a molecular mass of about 54 kD and 26 kD in 293T cells， respectively， with a titer of 1.0×109 cell/mL TCID50. The findings revealed that the recombinant adenovirus with the IPNV VP2 gene and VP3 gene was successfully obtained， and the virus had a high titer in 293T cells and could be expressed stably. The successful construction of recombinant adenovirus vectors with VP2 and VP3 proteins of IPNV could provide a reference for the development of the vaccine and better prevention of IPNV in Atlantic salmon.

Key words： Atlantic salmon; infectious pancreatic necrosis; VP2 gene; VP3 gene; adenovirus vector