一株羊源A型產氣莢膜梭菌的分子生物學診斷

摘 要：為查明河南省鄧州市某羊場病死羊病因，盡快控制病情，采集病羊肝臟、肺臟和脾臟等器官組織樣本進行細菌16S rDNA PCR擴增測序，并利用MEGA7.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，PCR鑒定毒素基因分型。結果表明，在病料中分離鑒定出一株分離菌；對該分離菌株進行16S rDNA基因擴增，得到1 400 bp陽性條帶，與產氣莢膜梭菌核苷酸同源性均在99.6%以上，進行核苷酸同源性比對，與產氣莢膜梭菌參考菌株相似性在99.6%以上，表明為產氣莢膜梭菌；PCR毒素基因分型得到324 bp陽性條帶，符合α毒素基因特征，證實其為A型產氣莢膜梭菌，命名為DENGZHOU202409；構建遺傳進化樹進行分析，發(fā)現DENGZHOU202409菌株與上海人源218002-301、印度豹源ATCC 13124處于同一小分支，親緣關系較近。綜上所述，DENGZHOU202409分離菌株為此次羊群感染致病的病原菌，為A型產氣莢膜梭菌。

關鍵詞：羊；產氣莢膜梭菌；16S rDNA；毒素分型

中圖分類號：S826；S855.3 文獻標志碼：B 文章編號：1674-7909（2025）1-104-4

DOI：10.19345/j.cnki.xckj.1674-7909.2025.01.018

0 引言

產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）是一種革蘭氏陽性、厭氧性芽孢桿菌，廣泛分布于土壤、水體和腐爛植物殘體等環(huán)境中，也存在于人類和動物的胃腸道中。作為機會性病原菌，該菌能夠在免疫力下降的宿主腸道內迅速增殖并產生20多種毒素［1］，可導致宿主食物中毒、氣性壞疽、腸毒血癥及多器官組織損傷，出現不同病理特征［2］，會給畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康帶來嚴重危害。

2024年9月初，河南省鄧州市某養(yǎng)羊場部分羊陸續(xù)出現食欲下降、便血、腹瀉和腹部膨脹的癥狀；病羊發(fā)病突然，肌注氨芐西林注射液后未明顯好轉，陸續(xù)出現死亡（發(fā)病到死亡的時間為1～2 d）；共發(fā)病6只，死亡4只。為盡快查明病因，控制病情，采用細菌培養(yǎng)、16S rDNA核酸PCR擴增、測序比對和毒素基因分型等技術手段，從病死羊組織器官中分離鑒定出1個菌株。

1 材料與方法

1.1 病料采集和試驗動物

無菌采集病死羊肺臟、脾臟、肝臟和腸道內容物等樣本，將其分別裝入不同采樣袋，記錄編號、樣本名稱和日期等必要信息，并立即送實驗室進行病原學檢測。

1.2 主要試劑和儀器

TSN瓊脂、綿羊血平板，均購自杭州微生物試劑有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；16S rDNA Bacterial Identification PCR kit試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒、質粒小提取試劑盒（Ver.4.0）、PGM-T產物克隆試劑盒（VT302-02）、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、2×Taq PCR MasterMix及DL 1500 DNA Marker，購自天根生化科技（北京）有限公司；凝膠成像儀（TGel Plus）、梯度PCR儀（OSE-GP-03/05），購自天根生化科技（北京）有限公司；生物顯微鏡（CX23），購自上海倍萊德儀器有限公司；電泳儀（DYCZ-24FN），購自北京六一生物科技有限公司。

1.3 引物設計

參考王斌等［3］、劉增祿等［4］和司南等［5］學者研究方法，利用Primer Premier 5. 0軟件設計7對產氣莢膜梭菌毒素基因分型引物，委托華大基因有限公司合成。引物信息見表１。

1.4 細菌分離培養(yǎng)

將病料分別接種于綿羊血平板和TSN瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，挑取單個菌落制作涂片，進行革蘭氏染色，并鏡檢。同時，挑取單個菌落多次在TSN瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種增菌，觀察細菌在培養(yǎng)基上的表型特征。

1.5 細菌16S rDNA PCR檢測和遺傳進化分析

利用細菌DNA提取試劑盒提取分離菌株DNA，以此為模板，采用16S rDNA Bacterial Identification PCR kit試劑盒提供的引物（F：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′，R：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′）進行PCR擴展菌種鑒定。反應體系：2×Taq PCR MasterMix 25μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板50～100 ng，補足16S-free H2O至總體積50 μL。反應程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30ｓ，55 ℃ 30ｓ，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存，PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。將擴增得到的陽性DNA片段與pGM-T Easy載體進行16 ℃過夜連接反應，將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中；轉化后，將細胞復蘇并涂布于含有氨芐抗性的LB平板上；將涂布好的平板倒置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。觀察平板上長出的菌落，選擇邊緣清晰、單獨生長的白色菌落，用無菌牙簽或接種環(huán)挑取單菌落，并轉移到新的含有氨芐抗性的LB平板上進行放大培養(yǎng)。將培養(yǎng)過的菌液進行離心處理，棄上清液，留細菌沉淀；然后按照質粒小提試劑盒說明書操作提取質粒，將經PCR鑒定正確的陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。在NCBI數據庫中選擇參考菌株（見表2），采用 MEGA7. 0 軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.6 細菌毒素基因分型PCR檢測

利用產氣莢膜梭菌7對毒素基因分型引物，分別對分離菌株PCR檢測攜帶毒素基因情況，以判定分離菌株毒素類型。PCR反應體系同1.5章節(jié)中表述，反應程序除退火溫度（各引物退火溫度見表1）外，其余程序不變。反應結束后，4 ℃保存，PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。陽性產物膠回收、純化，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，并將測序結果進行BLAST核苷酸同源性比對。

2 結果分析

2.1 細菌分離培養(yǎng)

細菌37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，在TSN培養(yǎng)基上形成黑色菌落（如圖1A）、在綿羊血培養(yǎng)基上形成雙層溶血環(huán)（如圖1B）。鏡檢可見，細菌外觀為短粗桿狀，單個或成對排列，革蘭氏染色陽性（如圖1C）。此次從肝臟、腸系膜、脾臟和腎臟病料中共分離4株表型一致的細菌，命名為DENGZHOU202409。

2.2 細菌16S rDNA基因PCR檢測和遺傳進化分析

DENGZHOU202409菌株16S rDNA基因PCR檢測結果發(fā)現，在1 400 bp處產生一條明亮清晰條帶（見圖2），符合預期目的條帶。序列BLAST比對結果顯示，DENGZHOU202409菌株與產氣莢膜梭菌核苷酸同源性均在99.6%以上，表明為產氣莢膜梭菌。核苷酸同源性比對，DENGZHOU202409菌株與參考株相似性均為99.6%。通過構建遺傳進化樹（見圖3）分析，發(fā)現DENGZHOU202409菌株與上海人源218002-301、印度豹源ATCC 13124處于同一小分支，親緣關系較近，與西藏牦牛源BG01、華東兔源SD14-02、云南奶山羊源KM-1、韓國驢源KSJ-28和北京人源1005-15098親緣關系較遠。

2.3 細菌毒素基因分型

利用產氣莢膜梭菌特異性毒素基因引物PCR擴增分離菌株，電泳檢測發(fā)現該菌株產生大小為324 bp的條帶（見圖4），初步判斷為編碼α毒素基因（clostridium perfringens alpga，CPA），未檢出其他6種毒素基因片段。測序BLAST比對可知，與CPA基因核苷酸同源性為99.9%，證實分離菌株為攜帶α毒素的A型產氣莢膜梭菌。

3 討論

感染A型產氣莢膜梭菌的反芻動物死亡率為70%～100%［6］。A型產氣莢膜梭菌會產生幾種毒素，包括腸毒素和β2［7］。關于反芻動物A型腸道感染的發(fā)病機制，一般認為大多數臨床癥狀和病變是由CPA的影響造成的［8］。CPA是氣性壞疽的主要致病因，位于染色體上，高度保守，因此存在于所有產氣莢膜梭菌菌株中。α毒素是一種磷脂酶C鞘磷脂酶（卵磷脂酶），它與細胞膜結合并導致脂質雙層的破壞。這種毒素具有溶血和損害皮膚作用。α毒素水解卵磷脂產生二酰基甘油，從而刺激真核細胞磷脂酶和花生四烯酸級聯反應［9-10］。這個過程可能會導致血管通透性、血小板聚集和血管收縮的改變。

4 結論

利用分子生物學方法對河南省鄧州市某羊場病羊進行病原學檢測，證實A型產氣莢膜梭菌是病羊的致病因子，可為今后產氣莢膜梭菌流行病學研究和防控提供臨床資料參考。

參考文獻：

［1］候照峰，馮茜茜，李貝貝，等.鵝源產氣莢膜梭菌的分離鑒定及藥敏試驗［J］.中國家禽，2022，44（5）：32-37.

［2］范學政，李文平，秦玉明，等.產氣莢膜梭菌及其公共衛(wèi)生危害［J］.中國獸藥雜志，2021，55（9）：57-64.

［3］王斌，張娜，馮航，等.朱鹮產氣莢膜梭菌的分離鑒定和致病性［J］.中國獸醫(yī)學報，2021，41（9）：1770-1773，1784.

［4］劉增祿，赫鳴睿，周金玲，等.牛產氣莢膜梭菌分離株毒素基因的檢測與分析［J］.黑龍江八一農墾大學學報，2019，31（4）：21-27.

［5］司南，祝令偉，景潔，等.遷徙候鳥產氣莢膜梭菌的分離鑒定與特性分析［J］.中國獸醫(yī)學報，2020，40（1）：129-134.

［6］ZHU L，ZHOU W，WANG T，et al.Isolation of Clostridium perfringens type A from wild bharals （Pseudois nayaur） following sudden death in Tibet， China［J］.Anaerobe， 2017， 44：20.

［7］徐吉榮，趙翠，樊麗，等.山東省羊源產氣莢膜梭菌耐藥性及分子遺傳進化特征分析［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2024，46（6）：593-600.

［8］楊夷平，李海利，楊帆，等.產氣莢膜梭菌α毒素熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用［J］.中國動物檢疫，2023，40（11）：95-99.

［9］LU W G，SUN H L，XU Z M，et al.Diagnostic and therapeutic strategy for Clostridium perfringens infection in postpartum dairy cows：a report of 14 cases［J］.Journal of Applied Animal Research，2022，50（1）：350-354.

［10］MIYASHIRO S，NASSAR A F C，Del F C，et al.Clostridium perfringens types A and D associated with enterotoxemia in an 18-month-old goat［J］.Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases，2007，13（4）：885-893.

Molecular Biological Diagnosis of a Strain of Sheep-derived

Clostridium" Perfringens Type A

WANG Kui

Dengzhou Animal Disease Prevention and Control Center， Dengzhou 474150， China

Abstract： In order to determine the cause of dead sheep in a sheep farm in Dengzhou City and control the spread of the disease as soon as possible， the samples of liver， lung， spleen and other organs and tissues of the diseased sheep were collected for bacterial 16S rDNA PCR amplification and sequencing. The phylogenetic tree was constructed using MEGA7.0 software， and the toxin genotyping was identified by PCR. The results showed that a strain of isolated bacteria was isolated and identified in the diseased material. The 16S rDNA gene of the isolated strain was amplified to obtain a 1 400 bp positive band， and the nucleotide sequence homology with Clostridium perfringens was more than 99.6%. The nucleotide homology was compared with the reference strain of Clostridium perfringens， and the similarity was more than 99.6%， indicating that it was Clostridium perfringens. A 324 bp positive band was obtained by PCR toxin genotyping， which was consistent with the characteristics of alpha toxin gene. It was confirmed to be Clostridium perfringens type A and named DENGZHOU202409. By constructing a genetic phylogenetic tree analysis， DENGZHOU202409 strain was in the same small branch with Shanghai human source 218002-301 and Indian leopard source ATCC 13124， and the genetic relationship was close. In summary， the isolated strain of DENGZHOU202409 was the pathogenic bacteria of this sheep infection. This experiment provided a clinical reference data for the diagnosis and treatment of Clostridium perfringens.

Key words： sheep; Clostridium perfringens; 16S rDNA; toxin typing

（欄目編輯：姜春艷）

作者簡介：王奎（1988—），男，碩士，助理獸醫(yī)師，研究方向：動物疫病防控。