梵凈山區域內黑茶中冠突散囊菌的分離和利用

摘 要 采用貴州銅仁黑茶中冠突散囊菌為實驗菌株，用3種不同的培養基對冠突散囊菌進行培養觀察，并記錄其生長情況，得出該菌在40%蔗糖蛋白胨培養基中培養最佳。后選取單株優勢菌轉入40%蔗糖蛋白胨的液體培養基中純化培養7 d，得到球菌后打碎和營養液混勻并分為6個不同濃度梯度接種入黑茶散茶中進行發花培養15 d，烘干后得到成茶，以不接種的黑茶為對照。檢測接種后黑茶中的茶多酚含量，并進行感官評審，發現發花處理不會降解黑茶本身茶多酚，其中CKA6組的感官品質最佳，具有明顯的陳香、金花香，滋味陳醇帶韻，明顯優于對照組。說明金花菌改善黑茶品質具有良好的應用前景，可以進行下一步發花條件優化等研究。

關鍵詞 黑茶；冠突散囊菌；發花；資源利用；貴州省梵凈山

中圖分類號：S571.1 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2025.01.002

我國茶文化源遠流長，根據制作工藝和發酵程度，茶葉可分為綠茶、白茶、黃茶、青茶、紅茶和黑茶6種類型[1]。茶是世界三大飲料之一[2]，貴州作為我國重要的茶葉生產大省，氣候宜人、土地優渥、生態良好，非常適合茶葉的種植和生產，安順、遵義、六盤水、畢節等地都是重要的茶葉種植基地[3]。近年來，隨著規模化農業種植越來越受重視，貴州省茶葉種植面積和規模進一步擴大，為當地經濟發展做出了重要貢獻，也為中國茶葉產業的發展注入了活力。

近年來，關于茶葉生產過程中產生的真菌的研究很多。周海燕等認為，茶葉種植和生產過程中會涉及到一些潛在的有害微生物及真菌毒素污染，需加強茶葉中真菌及真菌毒素污染狀況與防控研究[4]；張建坤等對云南景邁和芒景古茶園的茶葉樣品進行內生真菌平板接種，依據形態學特征挑選30個分離物進行rDNA基因測序后發現，其中鬼傘菌最多，其次是多節孢菌、炭團菌和輪層炭菌[5]；管飄萍等對湖南安化金花茯磚茶、天福普洱、天福茗茶、天福南糯山熟餅、天福白茶、安吉普洱茶、祁門紅茶和金茯茶等8種發酵茶葉通過真菌分離、純化、測序，得到擬莖點霉菌、變色栓菌、枝狀枝孢菌等23種有益真菌菌株[6]；周凌云等對貴州省湄潭縣感染斑點茶樹葉片進行病原鑒定，利用ITS序列進行PCR擴增和測序，并進行GenBank同源性比對，首次發現了茶葉上的鐮刀菌屬[7]；商瑞等對云南產區腎茶葉枯病樣本進行真菌rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4擴增及同源性分析，發現鐮刀菌是導致腎茶葉枯病的病原[8]。劉詩詩從桂香18號茶樹的根、莖、葉中共分離出24株內生真菌，并從其中分離出一種具有較強廣譜抑菌性的鐮刀菌屬菌株[9]。綜上可以看出，我國學者已經針對茶葉開展了大量的菌株分離鑒定理論和實踐研究，基本理清茶葉生長過程中真菌的助長和疾病誘發作用，掌握茶葉存貯霉變過程中不良霉菌及其代謝產物的危害，建立起茶葉天然品質與內在菌種之間的關系。由于我國茶葉種類繁多，各地區受種植環境、地理條件、制作工藝、保存方式等多因素影響，茶葉中含有的真菌類型各不相同，為此，仍有必要進一步針對特殊的經濟型茶葉，如黑茶來提高茶葉產品經濟價值。

黑茶是中國特有的茶類，對胃腸道具有溫和的保健作用，且口感味濃香陳，滋味醇厚，受到越來越多的消費者認可和喜愛[10-11]。黑茶的這些特征與其加工過程中產生的冠突散囊菌密不可分。黃群等通過研究冠突散囊菌發酵液中的酶類在模擬腸液、胃液中的作用，發現冠突散囊菌發酵液對a-淀粉酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的活性都有激活作用，而對脂肪起到抑制作用，表明冠突散囊菌發酵液可起到降脂、減肥、調節新陳代謝的作用[12]。在鄧放明的實驗研究中，通過分析冠突散囊菌胞外多糖的相對分子質量，判斷其具有抗腫瘤活性[13]。但是冠突散囊菌液體發酵提取物的成分相當復雜，例如胞外多糖，它不但具有抗腫瘤活性，而且具有降血脂、抗氧化的功效。在冠突散囊菌液體發酵過程中，因菌體的生長作用，會分泌一定的胞外多糖。真菌多糖是一種非常好的免疫調節劑，能有效激活免疫細胞，參與宿主的特異性和非特異性免疫，從而調節機體免疫功能。Honda等的研究證實，來自真菌多糖的抗腫瘤活性與其相對分子質量的大小有關，只有當分子質量大于 1.6×104時才具有抗腫瘤活性，但對于某些功效的特定成分還需要進一步深入研究[14]。這些研究表明，黑茶中冠突散囊菌的液體發酵技術及其利用仍需深入研究和探討，相關研究都為這一領域的進一步發展提供了重要參考。Charillon等研究發現，兒茶素及其氧化物具有抗氧化、預防心血管疾病、引發腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤轉化等防癌抗癌功效及抗突變、抗輻射、抗菌抗病毒等多種藥理作用[15]。在鄧放明的研究中提到了一種綠原酸物質[13]。綠原酸是一種有成效的酚型抗氧化劑，抗氧化能力優于部分常見抗氧化劑。綜上可知，有關冠突散囊菌的研究取得了一些進展，但大多都是研究其應用方面，有關冠突散囊菌的生理功能及其與茶品質的關系研究較少，該菌培養方面的研究也還很欠缺，同時還存在一些分歧，需深入研究，為未來冠突散囊菌發展提供新方向。

1 "材料與方法

1.1 "材料

黑茶（銅仁市松桃錦茶業有限公司，帶金花）; 試劑：甲醇水溶液、福林酚試劑、碳酸鈉（Na2CO3）溶液、沒食子酸工作液。馬鈴薯，瓊脂、葡萄糖、胰蛋白棟、酵母膏、蛋白胨、氯化鈉、蔗糖。

1.2 "儀器設備

ZK-CJ-2D型超凈工作臺（北京中科起源科技有限公司）；立式壓力滅菌器100HD；雙功能水浴鍋恒溫震蕩器SHZ92B；79-1磁力攪拌器。臺式低速離心機TDZ4-WS型；電熱恒溫水浴鍋HHSG型；可見分光光度計V1200型；電子天平BSM120.4型。

1.3 "培養基制作

1.3.1 "PDA培養基

將馬鈴薯切成玉米粒大小后，放入鍋中加入蒸餾水煮沸，用4層紗布過濾，在濾液中加入20 g葡萄糖再次加熱攪拌混勻，超純水定容至1 000 mL后，在120 ℃下滅菌20 min，然后在超凈工作臺內分裝至培養皿備用。

1.3.2 "LB培養基

稱取胰蛋白胨8 g，酵母膏糖16 g，瓊脂15 g，然后加入超純水在鍋中慢火煮至沸騰，超純水定容至1 000 mL，分裝入5 00 mL錐形瓶，在120 ℃滅菌20 min，然后在超凈工作臺內分裝至培養皿備用。

1.3.3 "40%蔗糖蛋白胨培養基

稱取蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蔗糖40 g，瓊脂20 g，然后加入超純水在鍋中慢火煮至沸騰，超純水定容至1 000 mL，分裝入500 mL錐形瓶，在120 ℃下滅菌20 min，然后在超凈工作臺內分裝至培養皿備用。

1.4 "發花黑茶制作

1.4.1 "液體發酵

選擇分離純化后長勢比較好的菌株，在超凈工作臺中用接種鏟移取菌株外圍一小塊至對應的液體培養基中（液體培養基和純化培養所用的培養基為同一種），放到轉速為144 r·min-1、溫度為23 ℃的震蕩培養箱中7 d，培養出球菌。

1.4.2 "母種制作

用純水將黑茶散茶（未帶金花）打濕至濕潤狀態，取250 g裝入240 mL組培瓶中至緊實后在120 ℃下滅菌20 min， 放置室溫完全冷卻后備用。

1.4.3 "接種發花

本實驗共設7個處理。用磁力攪拌器將液體發酵所得球菌打碎，使球菌和營養液混勻，備用。取滅菌后的黑毛茶7組，每組250 g，再向每組分別添加5、10、15、20、25、30 mL球菌混合液，以不添加液體菌株（0 mL）為對照組（CK），然后放室溫靜置培養15 d。

1.4.4 "烘干

將發花后的茶葉在80 ℃茶葉烘干機中烘120 min至足干后收集密封保存備用，得到成茶樣品編號見表1。

1.5 "茶多酚含量檢測

參照國標GB/T 8313—2008，對發花黑茶樣品進行茶多酚檢測。

1.6 "感官評審

參照國標GB/T 23776—2009 ，圍繞外形、湯色、香氣、滋味、葉底等5項因子對發花黑茶樣品進行茶樣感官評審。

2 "結果與分析

2.1 "冠突散囊菌在不同培養基的生長形狀

冠突散囊菌在3種培養基中的生長形狀見圖1，圖片均為冠突散囊菌在23 ℃的培養箱中培養7 d時所拍。冠突散囊菌在LB培養基和PDA培養基的形狀均近似圓形，飽滿，在40%蔗糖蛋白胨培養基中是不規則圓形，說明培養基中的營養條件不均衡，需優化其培養條件，但在40%蔗糖蛋白胨培養基中培養的冠突散囊菌總體積要大于其余兩種培養基中生長的菌株，推測該培養基更適宜茶葉中的菌株生長。

2.2 "冠突散囊菌在不同培養基中的生長速度

將3種培養基中培養的冠突散囊菌均放在23 ℃的培養箱中培養10 d，每隔2 d測量1次冠突散囊菌的生長速度并“十”字畫線測量其直徑，平均生長速度結果見表2。開始時，冠突散囊菌在LB培養基中的生長由快到慢且較平緩，接種后2 d很快適應環境，至第6天后生長緩慢，至第10天達到飽和生長。冠突散囊菌在PDA中的生長則不穩定，第1天到第4天，生長平穩 ，第6天時生長較慢，第8天后持續生長。冠突散囊菌在40%蔗糖蛋白胨培養基中接種后快速生長，在第4天時生長速度最快，可知，在這個時間段吸收養分最佳。

冠突散囊菌在40%蔗糖蛋白胨培養基中的平均生長速率為0.72 cm，在3種培養基中是最快的，而在LB培養基的平均生長速率為0.56 cm，為最慢。

2.3 "茶多酚含量

不同發花處理黑茶樣品的茶多酚含量如表3所示。未添加液體菌株的CK組茶多酚含量最高，平均含量為0.51%±0.07%，而添加冠突散囊菌液體菌株20 mL和30 mL的黑茶中茶多酚含量最低，分別為0.39%±0.07%和0.41%±0.08%。經差異顯著性分析，6個茶樣的茶多酚含量與對照組的差異均不顯著，并未過多降解茶葉中的茶多酚。在黑茶生產過程中，隨著冠突散囊菌與黑毛茶共同發酵的程度增加，所得茶葉產品的茶多酚含量則會越低。從表3可以看出，隨著液體菌株的投入量增加，發花黑茶的發酵程度隨之增加。當投入量為20 mL（即0.08 mL·g-1）時，發酵程度趨于穩定，可能此時液體菌株與黑毛茶已飽和，茶多酚含量也最低。

2.4 "感官評審結果

經過發花處理的樣品都具有顯金花的外形特征，故實驗組的外形都高于CK組；湯色都具有明亮的特點，實驗組的湯色為橙黃，與CK組杏黃特點不同，說明金花菌本身的顏色對茶湯湯色也有影響。其中CKA4和CKA6是添加較多金花菌的處理，具有明顯金花香，不具有令人不悅的氣味，說明金花菌可以適當提升黑茶香氣品質，改善香型（見表3）。其中CKA6的茶樣外形油潤，金花遍布，滋味口感較好，總體得分85分，品質最佳，推測這與發花條件下培養的茶樣金花含量最高有關系，表明利用金花菌發酵技術改進黑茶加工工藝具有良好前景。

3 小結

從銅仁本地黑茶（帶金花）中提取分離到冠突散囊菌，將其純化接種于不同的培養基。經觀察得知，冠突散囊菌在LB培養基和PDA培養基中的形狀為近圓形，在40%蔗糖蛋白胨培養基中是不規則圓形。說明培養基中的營養條件不均衡，需優化其培養條件，但在40%蔗糖蛋白胨培養基中培養的冠突散囊菌總體積要大于其余2種培養基中培養的，且數據分析得出冠突散囊菌在40%蔗糖蛋白胨培養基中培養，生長平均速度最高，這可能是因為冠突散囊菌最適宜在此培養基中生長。為尋找穩定且優勢的冠突散囊菌培養條件，未來可對40%蔗糖蛋白胨培養基配方的比例進行優化實驗。經茶多酚檢測結果得知，當添加冠突散囊菌液體菌株15 mL時，黑茶的茶多酚含量最高；而當添加量為20、30 mL時，茶多酚含量低。差異顯著性分析結果顯示，6個茶樣的茶多酚含量與對照組的差異均不顯著，說明發花處理不會降解黑茶本身的茶多酚含量。經感官評審得出，在250 g黑茶中加入30 mL冠突散囊菌液體菌株，感官評審效果最好，得分最高，也可說明，加入冠突散囊菌適量會改善黑茶品質。金花菌改善黑茶品質具有良好的應用前景，可以進行下一步開發利用、發花條件優化等研究。

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（責任編輯：敬廷桃）