扁桃斑鳩菊葉不同溶劑提取物的抗氧化性和抑菌性分析

摘 要 以水、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和石油醚等5種不同極性的溶劑對扁桃斑鳩菊葉浸提，分析其提取物的抗氧化性和抑菌活性，篩選針對扁桃斑鳩菊葉中抗氧化及抑菌活性成分提取的適宜溶劑。利用提取物進行DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和FRAP總抗氧化能力試驗，并通過藥敏抑菌圈直徑和抑菌率分析提取物的抑菌性。抗氧化試驗結果表明，乙酸乙酯提取物（E3）對DPPH自由基、ABTS自由基的清除效果和總抗氧化能力最好，清除率IC50值分別為VC的1.44、1.36倍，總抗氧化能力達0.69 mg Trolox·mg-1；抑菌圈直徑和抑菌率測定結果高度一致，二氯甲烷提取物（E4）的抑菌圈直徑最大，為15.51 mm，濃度相同時其抑菌率也最高，IC50值為0.14 mg·mL-1。總體上看，極性小的溶劑提取物的抗氧化性和抑菌活性相對更好，乙酸乙酯和二氯甲烷可分別作為提取扁桃斑鳩菊抗氧化和抑菌活性成分的優選溶劑。

關鍵詞 扁桃斑鳩菊；提取物；抗氧化性；抑菌活性

中圖分類號：QS567.1；TS202.1 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2025.01.003

扁桃斑鳩菊（Vernonia amygdalina Delile）是菊科斑鳩菊屬植物，因原產于南非，故俗稱“南非葉”，又常被稱作“苦茶葉”“苦葉”等[1]，主要分布在非洲熱帶地區和東南亞地區[2]。扁桃斑鳩菊在尼日利亞當地常作為藥食兩用植物[3]，具有抗腫瘤、抗氧化、清熱解毒、消炎、降血壓、降血糖等多種功效[4-9]。隨著“一帶一路”倡議合作持續深化拓展，扁桃斑鳩菊已被引進在我國廣東、福建、海南等亞熱帶或熱帶地區種植，其葉曬干后可制成茶葉飲用。目前，關于扁桃斑鳩菊的研究主要在其化學成分的解析及藥理作用等方面[10-12]，而對其活性部位的篩選研究還少見報道。本研究以水、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和石油醚分別對扁桃斑鳩菊葉進行浸提，提取物經濃縮揮干后，探究其對金黃色葡萄球菌的抑制率和抗氧化活性，確定扁桃斑鳩菊中抗菌和抗氧化活性成分提取的較優溶劑并評價其活性，以期為扁桃斑鳩菊資源的開發提供理論基礎。

1 "材料與方法

1.1 "試驗材料和試劑

材料：扁桃斑鳩菊葉采自海南省定安縣海島散養農場，經凈化、殺青后，于80 ℃下烘干，粉碎過60目篩，備用。

試劑：DPPH自由基清除能力試劑盒、ABTS自由基清除能力試劑盒、總抗氧化能力試劑盒（FRAP法），購自蘇州格銳思生物科技有限公司；無水乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚（60～90 ℃）等化學品均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；LB培養基，購自上海源葉生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CICC10001），購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，由實驗室保存；超純水。

1.2 "儀器設備

DHG電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；UV-1800PC紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；RV 10 digital旋轉蒸發儀（德國IKA）；Heraguard ECO超凈工作臺（賽默飛世爾科技有限公司）；LHS-100CA恒溫恒濕培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；LDZX-75L高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；PRACTUM224-1CN電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；4-20R冷凍高速離心機（上海托莫斯科學儀器有限公司）。

1.3 "試驗方法

1.3.1 "提取

稱取約20 g扁桃斑鳩菊葉粉末，按照1∶10（g·mL-1）的比例分別用水、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚等5種不同極性的溶劑于60 ℃水浴下浸提2次，每次200 W超聲輔助30 min，提取2 h，合并提取液后旋轉蒸發揮干溶劑，所得提取物分別記為E1、E2、E3、E4、E5，于60 ℃下烘干備用。

1.3.2 "體外抗氧化性試驗

1.3.2.1 " "DPPH自由基清除率測定

將5種溶劑的提取物用80%乙醇配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1不同濃度的溶液，參考DPPH試劑盒使用說明，按表1方式配制溶液，混勻，室溫（25 ℃）避光靜置30 min，12 000 rpm，室溫離心5 min，取上清液于517 nm處測定其吸光度；以同梯度濃度的VC作陽性對照。

測定組（或陽性對照組）、空白組和對照組的吸光度分別記為As、Ab、Ac，按照公式（1）計算DPPH自由基清除率。

[DPPH清除率=As?AbAc×100%] "（1）

1.3.2.2 " "ABTS自由基清除率測定

將5種溶劑的提取物用80%乙醇配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1不同濃度的溶液，參考ABTS試劑盒使用說明，按表2方式配制溶液，混勻，室溫（25 ℃）避光靜置6 min，于734 nm處測定其吸光度；以同梯度濃度的VC作陽性對照。

測定組（或陽性對照組）、空白組和對照組的吸光度分別記為As、Ab、Ac，按照公式（2）計算ABTS自由基清除率。

[ABTS清除率=As?AbAc×100%] （2）

1.3.2.3 " "總抗氧化能力測定

①標準曲線繪制

參考FRAP試劑盒使用說明，用80%乙醇將試劑盒中的水溶性維生素E（Trolox）標準品配制成0、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80 μmol·mL-1濃度梯度的標準品溶液，移取75 μL標準液，加入75 μL超純水和850 μL顯色液，混勻，室溫（25 ℃）反應10 min，于590 nm處測定其吸光度；以75 μL的80%乙醇代替標準液作空白。以標準品的濃度為橫坐標，ΔA（ΔA=A測-A空）為縱坐標作標準曲線，如圖1。

②FRAP總抗氧化能力測定

將5種溶劑的提取物用80%乙醇配制成1.0 mg·mL-1的樣品液，參照繪制標準曲線方案，測定吸光度；以75 μL的80%乙醇代替樣品液作空白。總抗氧化能力以1 mg樣品所相當的Trolox的質量（mg）來表示，結合標準曲線，可通過公式（3）用測得吸光度（ΔA）進行計算，式中250.29為Trolox的相對分子量。

總抗氧化能力（mg Trolox·mg-1）=（△A-0.0147）÷2.668 8×250.29×10-3 "（3）

1.3.3 "抑菌試驗

以金黃色葡萄球菌為供試菌種，測定提取物的抑菌性。

1.3.3.1 " "菌懸液的制備

從菌落平板上挑選金黃色葡萄球菌單個菌落，接種于LB液體培養基中，37 ℃、100 rpm·min-1培養24 h。活化后使用PBS緩沖液配制成濃度約為1×105 CFU·mL-1的菌懸液。

1.3.3.2 " "抑菌活性測試

將5種溶劑的提取物用PBS緩沖液均配制成1 mg·mL-1的樣品液；取菌懸液100 μL加到LB固體培養基中，迅速倒平板，待其凝固后進行打孔，然后將100 μL樣品液加到孔中，平板置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，比較抑菌圈的直徑大小。

1.3.3.3 " "抑菌率的測定

將5種溶劑的提取物用PBS緩沖液分別配制成0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg·mL-1的樣品液；于96孔板中每孔加入1.3.3.1中所配制的菌懸液100 μL，再加入100 μL樣品液，以100 μL菌懸液和100 μL PBS緩沖液為對照組，以100 μL培養基和100 μL樣品液為空白組，于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，于600 nm波長處測定其OD600值（表示菌株密度），分別用Ac、As和Ab表示；抑菌率按照公式（4）計算：

[抑菌率=Ac?AsAc?Ab×100%] （4）

1.3.4 "數據處理

以上每個試驗平行測定3次，結果以平均值±標準差表示。通過Excel、SPSS軟件分析處理數據。

2 "結果與分析

2.1 "提取物的抗氧化性

2.1.1 "DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率測定被廣泛用于抗氧化活性的評價[13-15]，5種溶劑的提取物對DPPH自由基的清除率如圖2所示，說明5種提取物對DPPH自由基均有一定的清除能力，提取物濃度與清除率呈量效關系。清除率與提取物濃度的對數回歸方程和IC50值見表3。由圖2和表3可知，5種提取物對DPPH自由基的清除能力為乙酸乙酯提取物（E3）＞乙醇提取物（E2）＞二氯甲烷提取物（E4）＞石油醚提取物（E5）＞水提取物（E1），乙酸乙酯提取物對DPPH自由基的清除能力最好，其IC50值約為VC的1.44倍。

2.1.2 "ABTS自由基清除率

ABTS自由基清除率常作為體外抗氧化活性的評價指標[16-18]，5種溶劑的提取物對ABTS自由基的清除率如圖3所示，5種提取物對ABTS自由基表現出一定的清除能力，兩者之間呈量效關系。清除率與提取物濃度的對數回歸方程和IC50值見表4。由圖3和表4可知，5種提取物對ABTS自由基的清除能力排序為乙酸乙酯提取物（E3）＞二氯甲烷提取物（E4）＞石油醚提取物（E5）＞乙醇提取物（E2）＞水提取物（E1），對ABTS自由基清除能力最好的仍是乙酸乙酯提取物，其IC50值約為VC的1.36倍。

2.1.3 "FRAP總抗氧化能力

FRAP法即測定樣品對鐵離子的還原能力，被普遍作為樣品總抗氧化能力的指標[19-21]。5種溶劑的提取物均有一定的抗氧化能力，其FRAP總抗氧化能力結果如圖4所示，5種提取物的總抗氧化能力順序為乙酸乙酯提取物（E3）＞二氯甲烷提取物（E4）＞乙醇提取物（E2）＞石油醚提取物（E5）＞水提取物（E1），乙酸乙酯提取物與Trolox的抗氧化能力最為接近，達到0.69 mg Trolox·mg-1。

2.2 "提取物的抑菌活性

2.2.1 "抑菌圈直徑

5種提取物抑菌圈直徑的測定結果如表5，抑菌圈直徑越大說明抑菌性越好。參考文獻[22-23]，說明5種提取物均對金黃色葡萄球菌顯示出一定的抑菌活性，其中水提取物（E1）的抑菌圈直徑僅為5.63±0.21 mm，抑菌效果不明顯，而其他提取物的抑菌圈直徑均大于10 mm，抑菌效果較好，其中二氯甲烷提取物（E4）的抑菌效果最佳。

2.2.2 "抑菌率

抑菌率可作為評價樣品抑菌能力的參考指標并被廣泛應用[24-26]，5種提取物的抑菌率測定結果如圖5，抑菌率與濃度呈正相關。抑菌率與提取物濃度的對數回歸方程和IC50值見表6。由圖5和表6可知，氯甲烷提取物（E4）、乙酸乙酯提取物（E3）和石油醚提取物（E5）對金黃色葡萄球菌的抑制能力相對較強，其IC50值分別為0.14、0.17、0.18 mg·mL-1；而乙醇提取物（E2）和水提取物（E1）的抑制能力相對偏弱，其IC50值分別為0.43、0.75 mg·mL-1。

3 "小結

本研究采用水、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和石油醚等5種不同極性的溶劑分別對扁桃斑鳩菊葉進行浸提，對所得提取物進行了體外抗氧化活性和抗菌性試驗。DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和FRAP總抗氧化能力試驗結果表明所得提取物均有一定的抗氧化性，3種試驗結果具有較大的一致性，其中乙酸乙酯提取物（E3）的抗氧化性最佳，水提取物（E1）最差，乙醇提取物（E2）、二氯甲烷提取物（E4）和石油醚提取物（E5）在3種試驗中的結果雖不一致，但差異不大。抑菌圈直徑和抑菌率測定結果高度一致，二氯甲烷提取物（E4）的抑菌能力最強，石油醚提取物（E5）、乙酸乙酯提取物（E3）與其較為接近，但乙醇提取物（E2）和水提取物（E1）的抑菌能力相對偏低。分析不同溶劑提取物的抗氧化性和抑菌性存在差異的原因，可能是相應功能活性成分不同，極性也有所不同，導致在不同極性溶劑中的溶出率不一致；而乙醇提取物（E2）、二氯甲烷提取物（E4）和石油醚提取物（E5）在3種不同抗氧化性試驗中表現出的不一致性，可能是3種試驗的作用機制不同而導致的。總體上看，極性小的溶劑所得提取物的抗氧化性和抑菌性更好，這與Tian等[27]的研究結果相似。研究結果可為后續選擇溶劑對扁桃斑鳩菊葉進行提取并進一步分離純化篩選高效抗氧化及抗菌活性成分提供參考，對扁桃斑鳩菊資源的開發和利用具有積極的指導意義。

參考文獻：

[1] " 王子恒，趙孝俊，陳巡，等.新外來中藥南非葉的文獻研究及中藥藥性探討[J].中國中藥雜志，2023，48（8）：2265-2271.

[2] ADODO A， IWU M M. Healing plants of Nigeria： ethnomedicine and therapeutic applications[M]. Boca Raton， Florida： CRC Press， 2020.

[3] OGWU M C， IKHAJIAGBE B. Vernonia amygdalina Delile （asteraceae）： an overview of the phytochemical constituents， nutritional characteristics， and ethnomedicinal values for sustainability in herbal medicine phytochemistry[M]. Switzerland： Springer Cham， 2024.

[4] " YEDJOU C G， SIMS J N， NJIKI S， et al. Vernonia amygdalina Delile exhibits a potential for the treatment of acute promyelocytic leukemia[J]. Glob J Adv Eng Technol Sci， 2018， 5（8）：1-9.

[5] " ADEYEMI O O， ALABI A S， ADEYEMI O A， et al. Acute gastroenteritis and the usage pattern of antibiotics and traditional herbal medications for its management in a Nigerian community[J]. PloS One， 2021， 16（10）：e0257837.

[6] " 黃敏桃，龐小莉，楊林芳，等.正交試驗法優化南非葉抑菌活性成分提取工藝[J].南方農業，2021，15（34）：84-87，91.

[7] " AMAEZE O U， ADEREMI-WILLIAMS R I， AYO-VAUGHAN M A， et al. Herbal medicine use among Type 2 diabetes mellitus patients in Nigeria： understanding the magnitude and predictors of use[J].International Journal of Clinical Pharmacy，2018，40（3）：580-588.

[8] " UGBOGU E A， EMMANUEL O， DIKE E D，et al.The Phytochemistry， Ethnobotanical， and Pharmacological potentials of the medicinal plant-Vernonia amygdalina L. （bitter Leaf）[J]. Clinical Complementary Medicine and Pharmacology， 2021， 1（1）： 100006.

[9] " GREAT I E， PRINCESS O S， AGATHA N J， et al. Biological and bioactive components of bitter leaf （Vernonia amygdalina leaf）： Insight on health and nutritional benefits. A review[J]. Food Chemistry Advances， 2023， 3：100488.

[10] 趙夢靈.扁桃斑鳩菊化學成分及其生物活性研究[D].南京：南京師范大學，2021.

[11] 劉祥忠，盧茜，何守倫，等.扁桃斑鳩菊中木脂素類化合物的分離與鑒定[J].中國藥物化學雜志， 2020，30（12）：738-744.

[12] 管磬馨，胡文忠，張越，等.Advances in research on active constituents and anticancer effects of South African leaves[C]//中國食品科學技術學會（Chinese Institute of Food Science and Technology）.中國食品科學技術學會第十六屆年會暨第十屆中美食品業高層論壇論文摘要集.武漢：2019.

[13] 秦小桐，曹昱瑩，居瑞軍，等.虎杖根不同溶劑提取物的抗氧化活性研究[J].現代化工，2024，44（4）：128-133.

[14] 許丹丹，徐雅琴，雋行，等.富硒菊芋多糖的提取及其體外抗氧化活性研究[J].中國農學通報，2021，37（30）：121-127.

[15] IONITA P. The chemistry of dpph· free radical and congeners[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2021： 22（4）：1545.

[16] ARAB K， GHANBARZADEH B， AYASEH A，et al. Extraction， purification， physicochemical properties and antioxidant activity of a new polysaccharide from Ocimum album L. seed[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2021，180： 643-653.

[17] 朱玉昌，焦必寧.ABTS法體外測定果蔬類總抗氧化能力的研究進展[J].食品與發酵工業，2005（8）：77-80.

[18] 樊海燕，蔡云飛，楊彭鵬，等.ABTS法和DPPH法測定鎖陽多糖抗氧化活性的適用性[J].光譜學與光譜分析，2023，43（S1）：315-316.

[19] 楊青，寧子琨，曾雁枝，等.啤酒FRAP抗氧化活性評價方法及應用[J].中外酒業，2023（19）：14-25.

[20] 王榮，羅倩，馮怡.DPPH、ABTS和FRAP微量法測定山奈酚的抗氧化能力[J].廣州化工，2021，49（3）：58-59，63.

[21] 惲祥惠，邢麗娜，李云，等.建立基于96孔板檢測的FRAP法和DPPH法及其在橘核抗氧化活性研究中的應用[J].時珍國醫國藥，2014，25（5）：1275-1278.

[22] 魯俊廷.不同中藥及其復方對奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果[J].養殖與飼料，2024，23（6）：16-20.

[23] 劉博洋，朱美齊，李澤宇，等.大興安嶺森林凋落物真菌及其次生代謝物活性研究[J].中國農學通報，2019，35（29）：103-108.

[24] 程夢麗，姜廣路，霍鳳敏，等.夫西地酸對分枝桿菌的體外抑菌效果評價[J].中國防癆雜志，2024，46（4）：461-466.

[25] 陳文丹，白玉瑩，郭成虎，等.黃花蒿精油抑菌、抗氧化及毒理學特性研究[J].食品工業科技，2024，45（7）：44-50.

[26] 劉俊俊，田佳儀，李坤，等.7種中藥提取物體外抑制金黃色葡萄球菌的效果及機制研究[J].畜牧與獸醫，2024，56（6）：130-138.

[27] TIAN F， LI B， JI B P， et al.Antioxidant and antimicrobial activities of consecutive extracts from Galla chinensis：The polarity affects the bioactivities[J].Food Chemistry，2009：113（1）：173-179.

（責任編輯：易 "婧）