高通量篩選法在測定腈水解酶活性中的應用

張淑蓉，劉建萍，梁國娟

（1.重慶醫科大學藥學院，重慶400016；2.重慶市萬州區環境監測站，重慶404020）

腈是一類重要的化合物，它的水解反應被廣泛應用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成［1－2］，在有機合成中占有極其重要的地位。腈水解的方法主要有化學水解法和生物轉化法。腈的化學水解因其需要強酸或強堿、高溫、高壓等反應條件，而且副產物多、產量低、環境污染嚴重，而大大限制了它在工業上的應用。相反，生物轉化法具有條件溫和、環境污染小，并能實現化學選擇性、區域選擇性和對映選擇性等優點。生物轉化法涉及的酶系主要有腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶。腈水解酶可催化腈經一步水解反應生成相應的羧酸［3－6］。目前報道的腈水解酶大都來自微生物［7－9］，雖然微生物種類繁多，但仍然不能滿足日益增長的工業需求，有許多具有高催化活性的腈水解酶沒有被發掘，因此篩選高活性的腈水解酶具有十分重要的現實意義。煙酸，又名尼克酸，俗稱維生素B5，是人體中不可缺少的營養成分［10］。煙酸具有增強細胞新陳代謝、擴張血管、促進人體和動物生長發育的功能［11］，還可作為藥物中間體，合成多種有重要用途的酰胺類和酯類衍生物藥品［12］。據估計，世界每年對煙酸及其衍生物的需求量大約是22 000t［13］。由于腈化學水解法的局限，近些年來，用生物轉化法生產煙酸逐漸引起了人們的興趣。本文通過高通量篩選法篩選出了具有高活性的腈水解酶131，并將其用于催化3－氰基吡啶水解來制備煙酸。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

腈水解酶，尚科生物醫藥上海有限公司；3－氰基吡啶（AR），美國 ACROS公司；乙腈（AR）、丙烯腈（AR）、磷酸鈉（AR）、磷酸氫鈉（AR），上海試一化學試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

高效液相色譜儀（HPLC－2010A）和質譜儀（LCMS－2010），日本Shimadzu公司；核磁共振儀（400 MHz，d6－DMSO為溶劑），美國Varian公司。

1.3 實驗步驟

1.3.1 腈水解酶的高通量篩選 酶的篩選采用尚科生物醫藥（上海）有限公司自制的高通量篩選預制板［14］，腈水解酶篩選板中通常采用100μL的反應體系，其中每孔中的最終反應條件為：10mg/mL底物，10mg/mL酶，10%有機助溶劑（如果底物不溶于水），pH＝8.0。

酶篩選板各孔中加入90μL去離子水，以防止輔酶變質，將10mg底物3－氰基吡啶溶于1mL去離子水中制備成底物母液，再將10μL底物母液和pH 8.0磷酸鈉－磷酸氫鈉緩沖溶液分別加入到酶篩選96孔板各孔中，然后將酶篩選板放置于30oC和速度為160r/min的搖床中反應24h。反應結束后，在酶篩選板各孔中加入0.1mL乙腈滅活，震蕩5～10min，離心10min（4 000r/min），將乙腈水溶液取出放入新的96孔板，直接用高效液相色譜儀和質譜儀（LC－MS）分析。

1.3.2 酶活測定方法 反應體系終組成：1g/L粗酶液，酶的用量可根據實際情況調整，使反應的轉化率達到10% 即可；0.5mL，10mmol/L，pH 8.0的磷酸鈉－磷酸氫鈉緩沖溶液；50mmol/L丙烯腈。反應條件：30℃、每分鐘160轉條件下反應0.5h，加入等體積的乙腈，進樣量為2μL。產物標準曲線為y＝0.061 9x，y為濃度（mmol/L）；x為峰面積（×104）。

酶活定義：在上述反應條件下，每小時生成1μmol產物所需的酶量為一個酶活單位（U）。

1.3.3 酶催化反應的條件 酶催化反應的模型：

酶水解反應體系包括：0.02g/L腈水解酶粗酶，1g/L的底物3－氰基吡啶，0.5mL，10mmol/L，pH 8.0的磷酸鈉－磷酸氫鈉緩沖溶液。在30℃、磁力攪拌條件下，反應一定時間后，加入等體積的乙腈，離心后用高效液相色譜（HPLC）測定反應生成的煙酸。

1.3.4 分析方法 反應液中反應物3－氰基吡啶和產物煙酸的量通過高效液相色譜法（HPLC）來檢測，色譜柱為C18柱 （4.6mm×150mm，5μm），流動相為A相（含0.1%TFA純凈水）和B相（含0.1%TFA乙腈），梯度洗脫程序為0min（90∶10），3.5min（10∶90），4min （10∶90），流速為1.0mL/min，在254nm波長處紫外檢測。底物出峰時間為2.9min，產物出峰時間為2.1min。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2 結果與討論

2.1 腈水解酶131的高通量篩選

運用高通量篩選法，對比研究了尚科生物醫藥（上海）有限公司自制的30種腈水解酶。其酶活測定數據見表1。結果表明，有少量的腈水解酶可以催化3－氰基吡啶直接水解生成煙酸，但反應效率不同，其中腈水解酶131的酶活17.6U/mL，比酶活35.2U/mg，轉化率最高。因此，選用腈水解酶131進行下一步研究。

表1 腈水解酶測活

底物終濃度（mmol/L）酶終濃度（mg/mL）酶活（U/mL）比酶活（U/mg酶粉）NIT－117 50 0.5 0.47 0.93 NIT－118 50 0.5 2.21 4.42 NIT－119 50 0.5 0.47 0.95 NIT－120 50 0.5 3.70 7.40 NIT－121 20 1.0 0.09 0.09 NIT－122 20 1.0 0.11 0.11 NIT－123 10 1.0 0.01 0.01 NIT－124 20 1.0 0.08 0.08 NIT－125 50 0.5 0.16 0.32 NIT－126 50 0.5 2.79 5.57 NIT－127 50 0.5 1.11 2.22 NIT－128 50 0.5 0.23 0.46 NIT－129 50 0.5 2.60 5.19 NIT－130 50 0.5 0.20 0.40 NIT－131 50 0.5 17.6 35.2 NIT－132 20 1.0 0.00 0.00 NIT－133 50 0.5 2.94 5.88 NIT－134 20 1.0 0.00 0.00 NIT－135 10 1.0 0.20 0.20 NIT－136 10 1.0 0.09 0.09 NIT－137 50 0.5 0.42 0.84 NIT－138 50 0.5 1.07 2.14 NIT－139 50 0.5 2.22 4.44 NIT－140 50 0.5 0.06 0.13

2.2 底物濃度對反應速率的影響

主要考察不同的底物濃度對腈水解酶131催化3－氰基吡啶水解反應速率的影響。圖2表明，當底物質量濃度小于8g/L時，反應速率隨底物質量濃度的增加而加快，當底物質量濃度為8～10g/L時，反應速率達到最大，再增大底物濃度，則反應速率變小，可見底物3－氰基吡啶對腈水解酶131有一定的抑制作用。

2.3 產物的分離

反應結束后蒸干反應液中的水，加入乙醇，加熱回流，然后熱過濾。合并濾液，蒸干溶劑后，即得到粗品。加入少量水加熱溶解粗品，然后低溫重結晶，過濾回收晶體，即為產物純品，收率約為85%。

圖2 底物濃度對腈水解酶131催化3－氰基吡啶水解反應的影響

2.4 產物的鑒定

分別用質譜和核磁驗證產物的正確性，分析數據為：ESI－MS m/z：124［M ＋ H］＋給出分子量為123；1HNMRδ/10－6：7.5（s，1H，Ar—H）、8.2（s，1H，Ar—H）、8.7（s，1H，Ar—H）、9.0（s，1H，Ar—H）、13.2（s，1H，COO—H）。

3 結論

應用高通量篩選法篩選出的腈水解酶131的酶活為17.6U/mL，比酶活為35.2U/mg，轉化率最高。在30℃，pH 8.0，底物質量濃度為8～10g/L時，腈水解酶131能直接催化3－氰基吡啶水解生成煙酸，沒有副產物煙酰胺生成，收率約為85%。并用質譜和核磁驗證產物煙酸結構的正確性。反應中使用的酶易于低成本制備，不需要昂貴的設備，也無環境污染問題，反應及后處理過程簡單，易于放大。雖然這只是初步研究結果，轉化過程還有待進一步優化，但足以證明生物催化技術應用于煙酸制備中的可行性，為煙酸綠色工藝的發展提供了新的思路。

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