RBP47C調控苜蓿生長的分子機理研究

摘要：為闡明RBP47C調控苜蓿（Medicago sativa L.）生長的分子機理，本研究通過檢測分析不同光照時間或不同溫度下其mRNA相對表達量，觀察RBP47C沉默苜蓿植株與對照植株的表型變化，高通量測序分析RBP47C沉默植株與對照植株頂芽轉錄組，篩選二者顯著差異基因，對苜蓿頂芽采用RIP-seq篩選RBP47C可能結合基因，最后通過比對獲得二者共有的基因。結果表明：RBP47C表達受光照時間負調控、受溫度正調控；RBP47C沉默植株在春季生長加快，在夏季生長受到抑制；RBP47C沉默植株總干重增加、葉莖比降低；獲得RBP47C沉默植株與對照植株頂芽中顯著差異基因2629個，得到66個RBP47C結合的可能基因，二者共有基因20個。結論：RBP47C表達同時受光照時間和溫度的調控，且在秋季主要受光照時間負調控；RBP47C沉默植株在適宜條件下加速生長，提高了產量，但其抗逆性變弱、葉莖比降低；得到RBP47C很可能結合的15個基因，RBP47C通過調節這些基因參與的代謝途徑調控苜蓿的生長和抗逆性。

關鍵詞：RBP47C；苜蓿；基因表達調控；生長；抗逆性

中圖分類號：S541" " " " 文獻標識碼：A" " " " 文章編號：1007-0435（2025）02-0401-09

Molecular Mechanism of RBP47C Regulating Alfalfa Growth

DU Hong-qi1， YAN Xiang-zhou1， FENG Chang-song1*， HAN Kang-kang2， LYU Xian-zhao2，

LOU Zhi-guo1， LIU Lei1， LIANG Zhi-yan1

（1.Institute of Animal Husbandry， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou， Henan Province 450002， China；2.Henan Huahuaniu Industrial Group Co.， Ltd.， Zhengzhou， Henan Province 450002， China）

Abstract：In order to clarify the molecular mechanism of RBP47C regulating of alfalfa （Medicago sativa L.） growth， this study analyzed the relative mRNA expression of RBP47C-silenced plants under different day lengths or different temperatures， observed the phenotype changes of RBP47C-silenced" plants， the transcriptome of RBP47C-silenced plants and control plants was analyzed by high-throughput sequencing to screen their significant difference genes， RBP47C protein binding genes were screened by RIP- seq. The results indicate that the expression of RBP47C gene was negatively regulated by light time and positively regulated by temperature. The growth of RBP47C-silenced alfalfa plants were accelerated in spring and inhibited in summer； The dry weight of RBP47C-silenced alfalfa plants increased and the ratio of leaf to stem decreased. A total of 2629 genes with significant difference between the apical buds of RBP47C-silenced alfalfa plants and wild plants were obtained， and 66 possible RBP47C protein-binding genes were obtained by RIPseq. There are 20 common differential genes between the both. The conlusion is that the expression of RBP47C gene is regulated by light time and temperature， and is mainly negatively regulated by light time in autumn. We got 15 genes that are probably RBP47C protein binding genes， and RBP47C protein regulates growth and stress resistance of alfalfa by regulating the metabolic pathways involved in these genes. The growth of RBP47C-silenced alfalfa plants was accelerated and the yield was increased under suitable conditions， but their stress resistance was weaker， the ratio of leaf to stem was decreased and the quality was slightly poorer.

Key words：RBP47C；Alfalfa；Regulation of gene expression；Growth；Stress resistance

RNA結合蛋白（RNA binding protein，RBP）與具有順式調節功能的RNA的非翻譯區相互作用，形成控制RNA命運的動態核糖核蛋白復合物，調控RNA的合成、編輯、加工（包括旋蓋、剪接和聚腺苷水解）、轉運和定位、儲存、翻譯、周轉以及細胞質中的整體RNA代謝［1-2］。有研究表明：紫花苜蓿MsRBP可能在紫花苜蓿逆境脅迫調控中發揮重要作用［3］。多聚腺苷酸結合蛋白（Polyadenylate-binding proteins，PABs）是高度保守RBP，它們特異性的結合mRNA 3′端聚腺嘌呤尾巴，參與基因翻譯的起始、多聚腺苷酸（poly A）縮短［4］，參與決定細胞核中mRNA 3′端poly（A）的長度［5-6］。RBP47（Polyadenylate-binding protein 47）屬于核蛋白中的PABs 家族蛋白，在不同的器官中是組成性表達，含有三個RNA結合結構域（RNA binding dormain，RBD）型RNA結合結構域和富含谷氨酰胺的N-末端，RBP47的兩個RBD型RNA結合結構域對于RBP47與RNA的相互作用是必需的，它們與poly（A）+RNA有關［7-8］，RBP47C屬于RBP47家族蛋白。PABs可影響植物的表型和環境抗性，過表達PABs的植物具有強的環境抗性和高的種子生產力［9-10］，RBP47C 在秋眠苜蓿頂芽中特異高表達，RBP47C 高表達促進了苜蓿（Medicago sativa L.）的秋眠，RBP47C 低表達加快了苜蓿的生長［11］，但它的作用機理還不清楚。

本研究擬通過檢測分析不同日照長度或不同溫度下RBP47C mRNA相對表達量，觀察RBP47C沉默植株與對照植株的表型變化，應用轉錄組測序和RIP-seq篩選RBP47C結合基因來研究它在苜蓿生長和抗逆性中的作用機理，也為苜蓿分子育種提供功能基因和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 不同苜蓿品種在不同光照時間、不同溫度下RBP47C mRNA相對表達量的分析

‘Maverick’（秋眠級為1級）和 ‘CUF101’（秋眠級為9級）是紫花苜蓿秋眠性的標準品種，由北京林業大學盧欣石教授惠贈。‘Maverick’和 ‘CUF101’各自均設三組，每組各三株植株，在溫度為24℃、光照強度為3000 Lux，但光照時間分別為8 h，12 h和16 h的條件下培養；兩品種苜蓿另設三組，每組各三株植株，在光照強度為3000 Lux、光照時間為16 h的條件下培養，但溫度分別為16℃，24℃和32℃。每個處理均是刈割后開始處理，處理14 d后取各自的葉片并儲存于-80℃冰箱待用。根據RBP47C和GAPDH內參基因序列，應用Primer5.0軟件設計它們的引物（RBP47C-S為CACAACATTACGCGCCGCCTC，RBP47C-A為TCCATAACCCTCTGAAATACC；GAPDH-S為TGGGA-AGCACATTACAGCAG，GAPDH-A為CATCAGCATTGACACCAACC），提取樣品總RNA并調至同一濃度，按照反轉錄試劑盒操作步驟對其反轉錄，采用熒光定量和2-ΔΔCt公式檢測計算各樣品中RBP47C mRNA相對表達量，用平均值±標準差表示，并應用SPSS軟件One-way ANOVA，LSD方法分析不同處理間的差異顯著性。

1.2 ‘伏納爾’與RBP47C沉默伏納爾頂芽的轉錄組分析

RBP47C沉默‘伏納爾’植株［10］與對照‘伏納爾’植株返青后生長45天分別采取5株苜蓿頂芽，放于液氮中，取出后儲存于-80℃冰箱待用。提取總RNA，建立測序文庫，應用Illumina Hiseq?對所取頂芽樣品進行轉錄組測序分析。應用FastQC，Trimmomatic軟件對原始數據質量評估、質量剪切得到相對準確的有效數據。使用HISAT2軟件比對樣本有效數據到紫花苜蓿參考基因組（https：//figshare.com/articles/genome_fasta_sequence_and_annotation_files/12327602）上，統計Mapping信息。采用RSeQC，Qualimap，DESeq2軟件對比對結果分別進行冗余序列分析、插入片段分布和均一性分布檢查、基因組結構、基因表達差異分布等分析和可視化，以q Valuelt;0.05且差異倍數|FoldChange|gt;2作為標準選取差異基因。

1.3 測量田間RBP47C沉默‘伏納爾’和‘伏納爾’苜蓿植株株高、莖重和葉重

在2020年春季4月22日和夏季5月20日，‘伏納爾’與RBP47C沉默‘伏納爾’苜蓿植株［10］初花期時隨機選取15株，應用鋼尺測每株高、中、低枝條高度取平均值作為該苜蓿株高。刈割后將莖葉分離后收集，晾曬，烘干，使用電子秤對每株莖和葉分別稱重，獲得莖和葉重量，將每株莖重和葉重相加得到每株干重，將每株葉重與莖重相比得到每株的葉莖比，應用SPSS19.0（IBM Corp.， USA）軟件采用One-way ANOVA和LSD方法分析‘伏納爾’與RBP47C沉默‘伏納爾’苜蓿植株株高、兩茬干重總和和平均葉莖比的差異顯著性，并應用GraphPad prism 5 （GraphPad Software，Inc.，USA）軟件對各數據制作柱狀圖。

1.4 RNA 免疫共沉淀-測序（RNA Immunoprecipi-tation Sequence， RIP-seq）和序列數據分析

1.4.1 RIP文庫制備及測序 在2020年秋季10月12日上午10時左右取秋眠型苜?！甅averick’頂芽并液氮凍存，委托SeqHealth（武漢，中國）對該頂芽進行RIP試驗。通過組織裂解器研磨凍干的苜蓿頂芽，研磨后的粉末用細胞裂解緩沖液處理，10%裂解樣品保存命名為“input”，80%的與 anti-RBP47C antibody（Abmart公司定制）進行免疫沉淀反應，命名為“IP”，10%與兔IgG （Cell Signaling Technology）作為陰性對照孵育，命名為“IgG”。使用TRIzol試劑（Invitrogen， Invitrogen， cat）提取input和IP的RNA。采用kc - digitalTM stranded mRNA library Prep Kit for Illumina?構建富集200～500 bps RNA測序文庫，并進行定量最終在DNBSEQ-T7sequencer （MGI technology Co.，Ltd.）上測序。

1.4.2 RIP-Seq分析 使用Trimmomatic（0.36版本）對原始測序數據進行過濾得到clean reads，根據unique multiple index（UMI）序列對clean reads進行聚類和多次序列比對得到一個一致序列，使用STAR軟件（版本2.5.3a）使用默認參數將所得到的一致序列與紫花苜蓿參考基因組（https：//figshare.com/articles/genome_fasta_sequence_and_annotation_ files/12327602）進行比對。使用RSeQC（Version 2.6）、exomePeak（Version 3.8）、bedtools（Version 2.25.0）軟件分別對序列進行分布分析、峰值調用和注釋，使用deepTools（version2.4.1）進行峰分布分析，采用fisher檢驗，用python腳本對差異結合峰進行鑒定，利用Homer（Version 4.10）識別峰區富集的序列基序，以logFCgt;1且P lt;0.05作為標準選取差異基因，在差異基因中選取3′poly A端含有大于等于連續5個A的基因作為RBP47C結合的候選基因，并采用KOBAS軟件（Version 2.1.1）做GO分析和KEGG富集分析。同時，用候選RBP47C結合的基因注釋號在轉錄組選出的差異基因中查找得到二者共有的基因。

2 結果與分析

2.1 不同光照時間或不同溫度下苜蓿頂芽中RBP47C mRNA相對表達量

兩品種苜蓿受光周期和溫度的調控規律一致；隨著光照時間延長，苜蓿頂芽中RBP47C mRNA的含量逐漸減少；隨著溫度的升高，苜蓿頂芽中RBP47C mRNA的含量呈增加趨勢（圖1）。

2.2 田間RBP47C沉默‘伏納爾’和‘伏納爾’苜蓿植株的株高、干重與葉莖比

2.2.1 春夏季‘伏納爾’與RBP47C沉默‘伏納爾’苜蓿植株株高 在春季RBP47C沉默‘伏納爾’苜蓿植株的株高極顯著高于對照‘伏納爾’的株高（Plt;0.01）（圖2），但是在夏季RBP47C沉默‘伏納爾’苜蓿植株的株高顯著低于對照‘伏納爾’的株高（Plt;0.05）（圖2）。

2.2.2 ‘伏納爾’與RBP47C沉默‘伏納爾’苜蓿植株干重與葉莖比 RBP47C沉默‘伏納爾’苜蓿植株的干重極顯著高于對照‘伏納爾’的干重（Plt;0.01）（圖3），但是RBP47C沉默‘伏納爾’苜蓿植株的葉莖比顯著低于‘伏納爾’的葉莖比（Plt;0.05）（圖3）。

2.3 RBP47C沉默植株與對照植株轉錄組測序分析結果

通過轉錄組測序和生物信息學分析，本研究共獲得q Valuelt;0.05且差異倍數|FoldChange|gt;2顯著差異基因2629個，1727個下調基因，902個上調基因，差異基因顯著富集的GO條目158個，差異基因顯著富集的KO條目44個，上調的28個、下調的16個，差異基因顯著富集的KOG 6個。

2.4 RIP-seq分析結果

RIP-seq分析篩選出實驗組和對照組之間顯著差異的基因66個（表1），通過KEGG通路富集分析發現這些基因主要富集在煙酸代謝（VB3代謝）、氨基酸合成、氨基酸代謝、脂肪酸代謝、生物素代謝、核糖體合成、RNA轉運和降解、mRNA監視通路、色氨酸代謝、激素信號轉導、丁酸甲酯新陳代謝、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、丙酮酸代謝，胰高血糖素信號通路，糖酵解/糖異生等途徑（表1）。

與轉錄組聯合分析顯示，二者共有的差異基因共20個，主要富集在磷酸化傳感器激酶活性、水解酶活性、轉運體活性、煙堿-核苷酸二磷酸化酶（羧化）活性、煙堿-磷酸核糖基轉移酶活性、草酸-輔酶A連接酶活性、α- l -阿拉伯糖核苷酶活性、ATP結合、RNA- DNA雜交核糖核酸酶活性、核酸結合、核糖體大亞基結合、RNA結合等分子功能。這些基因位于外質體、葉綠體間質、胞漿連絲、膜的組成部分以及線粒體中。它們參與草酸分解代謝過程、對細胞分裂素的反應、種皮發育、對真菌的防御反應、對鎘離子的反應、種子萌發的正調控、mRNA加工、l-阿拉伯糖代謝過程、核糖體從細胞核輸出大亞基、煙酸核苷酸回收以及NAD生物合成過程等生物過程。其中有5個共有基因參與PPAR信號通路、煙酸和煙酰胺代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、植物激素信號轉導、真核生物核糖體生物發生，RNA轉運等代謝途徑（表1）。

3 討論

3.1 RBP47C 基因表達的調控

由于RBP47C表達受光照時間和溫度調控規律相反，且RBP47C表達受光照時間負調控、溫度正調控（圖1），因此，在秋季光照時間縮短會增加RBP47C表達、溫度降低會減少其表達。而事實是從春季到秋季，‘Maverick’苜蓿頂芽RBP47C mRNA在秋季顯著特異高表達［11］，因此推測在秋季，秋眠性苜蓿頂芽中RBP47C表達主要受光照時間調控，說明不同季節不同秋眠型苜蓿RBP47C表達的主要調控因子不同。

3.2 RBP47C蛋白參與調節苜蓿的生長和抗性

PABs可影響植物的表型和環境抗性，過表達PABs的植物具有較強抗逆性［9-10］。本研究的結果表明，在春季RBP47C沉默苜蓿植株的株高極顯著高于對照，而在炎熱、病蟲害高發的夏季，RBP47C沉默植株生長受到抑制（圖2），說明在適宜的環境條件下RBP47C沉默植株生長速度快，在不利的環境下RBP47C沉默植株的抗逆性差，不利于苜蓿的生長，而且RBP47C沉默植株總體上的干重增加，但其葉莖比低于對照植株（圖3），因此，RBP47C沉默后有益于提高苜蓿產量，但同時其質量有所下降。Li等研究表明酵母Pab1p在煙草中過表達可顯著抑制植株的生長［10］，RBP47C過表達可抑制苜蓿植株的生長［11］。這些結果說明PABs在影響植物生長方面有一定的共性。

3.3 RBP47C蛋白結合的基因

雖然RIP得到的66個基因都有可能是RBP47C結合的基因，但是與“沉默植株與對照植株顯著差異基因”共有的20個基因更可能是RBP47C真正結合的基因。由于RBP結合基因的另一個重要的作用是保護結合的基因，因此，在20個共有基因中沉默RBP47C植株相對表達量相對于對照植株低的15個基因才最可能是RBP47C真正結合的基因。

通過本研究GO，KEGG分析結果和Uniprot數據庫中該15個基因的功能注釋以及查閱文獻得到：煙酸磷酸核糖轉移酶2（MS.gene047612）是煙酸和煙酰胺代謝（ko00760）途徑的關鍵酶，該酶的增加有利于NAD+的產生，促進三羧酸循環和呼吸作用；草酸-輔酶A連接酶（MS.gene60078）參與乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝（ko00630）途徑，最終合成甲酸鹽。研究表明，甲酸鹽保護光合機制免受光抑制，從而減少光抑制條件下對光系統的氧化損傷［12］，對水稻植株生長有促進作用［13］；細胞分裂素受體組氨酸激酶（MS.gene66267）具有磷酸接力傳感器激酶活性，參與植物激素信號轉導途徑（ko04075），在眾多參加細胞分裂素信號傳導的轉錄因子中起主要作用。比如在介導的細胞分裂素信號傳導是SSPP誘導延緩葉片衰老所必需的［14］；羧酸酯酶1（MS.gene20413）在植物激素活性調控中發揮重要作用，使植物能夠應對外界環境變化。它參與病原菌侵染后的過敏反應，直接水解植物病原菌細胞壁中的酯類物質抑制病原菌的生長發育，并在合成和水解抗病信號分子的過程中起到重要作用［15］。無義介導的mRNA衰變蛋白（MS.gene21925）參與核糖體生物合成（ko03008）和 RNA轉運（ko03013），作為真核細胞中重要RNA監控機制，識別并降解開放閱讀框中含有提前終止密碼子的mRNA，以避免因截短的蛋白產物積累對細胞造成毒害，還調控正常生理基因的表達［16］；解毒蛋白35（MS.gene006248）參與類黃酮代謝的多種藥及毒素外排轉運體，也是正常生殖發育所必需的，影響植物的類黃酮水平、根系生長、種子發育和萌發以及花粉發育和釋放的改變［17］，與對照型相比，增強生長和提早開花［18］。從所舉蛋白的功能上看，它們都具有促進苜蓿生長發育的功能，然而從轉錄組結果看它們在沉默植株中的mRNA相對含量較對照植株顯著減少，而沉默后的植株生長加快，因此推測這些基因在蛋白水平上含量增加了。這兩個結果看似是矛盾的，但前人研究已經證明，PABs扮演著一個雙面“間諜”的角色。一方面，它在物理上保護轉錄本的3′端免受非特異性的降解［19］；另一方面，它又是poly（A）尾巴脫腺苷所必需的［20］，由于Poly A尾巴及其相關蛋白（比如PABs）在胞質中介導mRNA降解的同時保護細胞核中的mRNA不受酶的破壞。因此，沉默RBP47C后，RBP47C mRNA和蛋白含量下降導致在細胞核中的RBP47C 結合的基因mRNA沒有了RBP47C的保護而被降解，最終導致這些基因總mRNA 減少，然而在細胞質中的mRNA由于減少或沒有RBP47C介導導致其降解緩慢或不被降解，最終導致其蛋白含量增加，最終促進沉默植株的生長。

4 結論

RBP47C受光照時間負調控，受溫度正調控，在秋季主要受光照時間的調控。本研究得到RBP47C很可能的15個結合基因，并通過調節這些基因參與的代謝途徑調控了苜蓿的生長和抗逆性。RBP47C沉默苜蓿植株在適宜條件下生長加速，產量提高，但其抗逆性變弱和葉莖比降低。

初步推測RBP47C調控苜蓿生長的分子機理：自然環境（光照時間、溫度）的變化調控RBP47C表達，RBP47C通過調節其結合基因（煙酸磷酸核糖轉移酶2、草酸-輔酶A連接酶、細胞分裂素受體組氨酸激酶、羧酸酯酶1、RNA識別基序、無義介導的mRNA衰變蛋白、解毒蛋白35、α-阿拉伯糖醛酸苷酶、多泛素11亞型X1等）mRNA在細胞核中的降解和細胞質核糖體中的翻譯，從而影響它們參與的代謝途徑合成的代謝產物含量來調控苜蓿的生長和抗逆性。

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（責任編輯" 閔芝智）