外泌體調節復發性流產小鼠子宮內膜細胞上皮間充質轉化的作用機制研究

【摘要】 背景 復發性流產（RSA）是常見的生殖障礙性疾病，在胚胎植入過程中，子宮內膜發生上皮間充質轉化（EMT），RSA的發生與該過程減弱密切相關。子宮內膜來源外泌體及其攜帶的miRNA參與細胞間通訊，影響細胞EMT，與RSA關系密切，但具體作用機制尚不明確。目的 本研究聚焦于外泌體在細胞EMT中的功能，通過實驗驗證子宮內膜來源外泌體及其分泌的miRNA-221對RSA小鼠子宮內膜細胞EMT的調控作用。方法 2021年10月—2022年5月，選取SPF級、健康8周齡雌性小鼠24只，隨機選取12只作為正常對照組，剩余12只小鼠制作RSA模型，造模結束后雌雄合籠，妊娠第4日處死雌性小鼠，分離和培養子宮內膜上皮細胞并收集外泌體，通過透射電鏡和免疫印跡法（WB）進行外泌體鑒定；通過CCK-8、Transwell和流式細胞術檢測外泌體干預前后兩組細胞增殖、侵襲、遷移能力；細胞EMT相關蛋白［E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、基質金屬蛋白酶7（MMP-7）、MMP-9］及外泌體標志蛋白（CD63、CD81、TSG101）的表達；外泌體處理后的細胞EMT標志蛋白（CD24- APC、CD44- FITC）的表達；轉染miRNA-221模擬物和抑制物分析外泌體源性miRNA-221對小鼠子宮內膜上皮細胞EMT的作用，并通過WB和雙熒光素酶報告基因檢測進行分析。結果 RSA組小鼠的子宮內膜上皮細胞具有異常的EMT，小鼠子宮內膜上皮細胞能夠分泌外泌體。添加外泌體的RSA組細胞增殖率、遷移能力、侵襲能力、CD44+/CD24+表達水平高于細胞上清液RSA組（Plt;0.05）。與細胞上清液RSA組相比，添加外泌體的RSA組細胞的EMT標志蛋白E-cadherin水平降低，間質樣標志蛋白N-cadherin和Vimentin以及基質標志蛋白MMP-7、MMP-9蛋白水平升高（Plt;0.05）。RSA組miRNA-221表達水平低于正常對照組（Plt;0.05）。與對照隨機miRNA相比，miRNA-221模擬物激活了PI3K-AKT通路、NF-κB通路和p38通路（Plt;0.05）。與對照隨機miRNA相比，miRNA-221模擬物降低了PTEN mRNA的表達水平（Plt;0.05），而miRNA-221抑制劑轉染則增加了PTEN mRNA的表達水平（Plt;0.05）。結論 子宮內膜來源外泌體miRNA-221可通過負向調控Pten基因，激活PI3K-AKT通路，促進子宮內膜上皮細胞EMT，影響RSA妊娠結局。

【關鍵詞】 復發性流產；上皮間充質轉化；外泌體；miRNA-221；Pten基因；PI3K-AKT通路

【中圖分類號】 R 714.21 【文獻標識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0768

Exosomes Regulate Epithelial Mesenchymal Transition of Endometrial Cells in Mice with Recurrent Spontaneous Abortion

LI Mengyuan，LI Guanshan，HAN Qian，LI Siyao，ZHENG Shuchang，XIN Mingwei，YIN Xiaodan，WANG Jingshang，WU Ying，HE Junqin*

Department of Traditional Chinese Medicine，Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital，Capital Medical University，Beijing Maternal and Child Health Care Hospital，Beijing 100026，China

*Corresponding author：HE Junqin，Professor/Doctoral supervisor；E-mail：hejunqin@ccmu.edu.cn

【Abstract】 Background Recurrent spontaneous abortion（RSA） is a common reproductive disorder closely linked with the weakened epithelial-mesenchymal transition（EMT） in the endometrium during embryo implantation. Endometrium-derived exosomes and miRNAs they transport are linked with RSA via the involvement in cellular communication and EMT，although the specific mechanisms have not yet fully revealed. Objective Focusing on the function of exosomes in EMT，this study aims to validate the regulatory role of endometrium-derived exosomes and miRNA-221 they transport in EMT of endometrial cells in RSA mice. Methods From October 2021 to May 2022，a total of 24 eight-week-old female mice in the specific pathogen-free（SPF） level were randomly assigned into the control group（n=12） and RSA group（n=12） for modeling. After RSA modeling，male and female mice were housed together. On the 4th day of pregnancy，female mice were sacrificed for isolating endometrial epithelial cells. They were cultured for extracting exosomes，which were identified by transmission electron microscopy and Western blotting. Cell proliferation，invasion，and migration abilities were evaluated using CCK-8 assay，Transwell assay，and fluorescence-activated cell sorting（FACS） before and after exosome interventions. Expression levels of EMT-related genes［E-cadherin，N-cadherin，Vimentin，matrix metalloproteinase 7（MMP-7），matrix metalloproteinase 9（MMP-9）］ and exosome marker proteins［CD63，CD81，tumor susceptibility gene 101（TSG101）］ were measured. Expression levels of EMT marker proteins（CD24-APC，CD44- FITC） in exosome-treated cells were analyzed. Transfection of miRNA-221 mimics and inhibitors was performed to analyze the effects of exosome-derived miRNA-221 on EMT of endometrial epithelial cells in RSA mice. Relevant analyses were conducted using Western blot and dual-luciferase reporter assay. Results Abnormal EMT was observed in the endometrial epithelial cells of mice in RSA group，and the mouse endometrial epithelial cells were able to secrete exosomes. The proliferation rate，migration ability，invasion ability，and CD44+/CD24+ ratio of cells in the RSA group treated with exosomes were significantly higher than those measured in cell supernatant of RSA group without exosome intervention（Plt;0.05）. Compared with those in the cell supernatant of RSA group，induction of exosomes significantly downregulated EMT marker protein E-cadherin，but upregulated stromal marker proteins N-cadherin and Vimentin，as well as matrix marker proteins MMP-7 and MMP-9（Plt;0.05）. The expression level of miRNA-221 in the RSA group was significantly lower than that of the control group（Plt;0.05）. Compared with those transfected with miRNA negative control，transfection of miRNA-221 mimic significantly activated the phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）-AKT pathway，nuclear factor-kappa B（NF-κB）pathway，and p38 pathway（Plt;0.05），but downregulated mRNA level of PTEN（Plt;0.05）. Transfection of miRNA-221 inhibitor significantly upregulated mRNA level of PTEN（Plt;0.05）. Conclusion Endometrium-derived exosomal miRNA-221 negatively regulates the PTEN gene，activates the PI3K-AKT pathway，promotes EMT in endometrial epithelial cells，and influences the pregnant outcome of RSA mice.

【Key words】 Recurrent spontaneous abortion；Epithelial-mesenchymal transition；Exosomes；miRNA-221；PTEN gene；PI3K-AKT pathway

復發性流產（RSA）是指與同一性伴侶連續發生2次及以上的自然流產，發病率為1%～5%［1］。RSA病因復雜多樣，不明原因RSA占50%～70%［2］。不論何種原因，胚胎植入過程是關鍵因素之一。胚胎植入是胚胎和子宮內膜相互作用和識別的過程。優質的胚胎和良好的子宮內膜容受性對于胚胎著床至關重要，胚胎和內膜之間的協調是著床的關鍵。胚胎植入過程中子宮內膜滋養層細胞會發生與腫瘤的侵襲轉移類似的上皮轉化行為即上皮間充質轉化（EMT），這一特有的分化過程若出現異常，將導致胚胎植入失敗、發育中止，甚至出現多次妊娠丟失，最終形成RSA［3-4］。

外泌體是由多種細胞分泌的直徑介于30～100 nm的均一膜囊泡。外泌體中含有可溶性蛋白質、脂質、miRNA和LncRNA，參與細胞內信號轉導和各種代謝。外泌體還可以作為癌癥、神經退行性疾病和腎臟疾病的診斷標志物，具有較高的臨床診斷價值［4-5］。外泌體能夠向受體細胞傳遞信息并影響受體細胞的功能［6］。外泌體miRNA的轉移對目標基因具有重要的調節作用，并被用作受體細胞的臨床生物標志物［7］。近期研究報道外泌體與生殖系統密切相關，并可以從輸卵管、卵泡液、子宮液、前列腺、附睪和精液中分離得到。外泌體通過攜帶的內容參與細胞間的交流，對精子-卵子成熟、受精、著床和胚胎發育的各個方面產生重要影響［8］。然而，關于外泌體在生殖過程中的通路和機制尚不清楚。

人子宮內膜上皮細胞分泌外泌體，類似于內膜受激素調節并隨月經周期發生周期性變化［9］。在胚胎著床過程中，外泌體維持母體-胎兒界面的免疫微環境平衡，并促進胚胎著床。有研究表明，子宮內膜細胞EMT過程異常是胚胎著床失敗的原因之一［10-11］。課題組前期臨床研究發現RSA患者子宮內膜細胞EMT過程出現異常，進而導致胚胎著床失敗［11］。動物實驗發現小鼠子宮內膜上皮細胞能夠分泌外泌體，外泌體參與EMT過程。外泌體包含多種與EMT密切相關的miRNA，其中以miRNA-221為主。但是外泌體及miRNA-221在介導細胞EMT這一過程中的具體作用機制尚不明確，本研究旨在探尋外泌體來源miRNA-221調控小鼠子宮內膜EMT過程干擾胚胎著床的作用機制，以期為RSA的臨床診斷和治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 研究時間：2021年10月—2022年5月。

1.1.2 實驗動物：健康SPF級8周齡的雌性CBA/J小鼠24只、8周齡雄性DBA/2J小鼠6只、雄性BALB/c小鼠6只，購自北京維通麗華實驗動物技術有限公司，許可證號〔（京）2021-0006〕。所有小鼠在首都醫科大學附屬北京婦產醫院標準動物房飼養（SPF級），12 h光照，12 h黑暗，自由攝食飲水，適應性飼養1周后，雌性CBA/J小鼠與雄性BALB/c小鼠交配被用作正常對照組，雌性CBA/J小鼠與雄性DBA/2J小鼠交配建立RSA模型，每組各12只。造模結束后各組小鼠每晚18：00按雌雄2∶1合籠，每天早晨8：00觀察陰道栓及引導圖片觀察精蟲，發現陰道栓或精蟲者為妊娠第1日。本研究獲得首都醫科大學附屬北京婦產醫院倫理委員會批準（IRB00006761-2019062）。

1.1.3 實驗儀器設備：冷凍離心機（Fresco21）、酶標儀（Varioskan LUX）、超微量分光光度計（NanoDrop 2000），均購自Thermo（美國）；電泳槽（1655132）、電泳儀（1654102），均購自Bio-RAD（美國）；水平脫色搖床（其林貝爾，型號：TS-2）；熒光定量PCR儀［ABI Step One Plus（美國），型號：4376592］；倒置熒光顯微鏡［Leica（德國），型號：DMi8］；120 kV透射電鏡［Hitachi（日本），型號：HT7800］；NovoCyte流式細胞儀［ACEA（美國），型號：2010046］；渦旋振蕩儀（其林貝爾，型號：QL-902）；Centrifuge［Eppendorf（德國），型號：5415D］。

1.1.4 實驗試劑：DMEM/F-12（11320033）、0.25%胰酶（25200-114）、Trizol reagent（15596026）均購自Life Technologies（美國）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（C10010500BT）、DPBS溶液（14190250）、胎牛血清（10099141）、膠原酶Ⅱ（17101015）、OPTI MEM（31985070）均購自Gibco（美國）；轉化生長因子β（TGF-β）（34-8342-82），購自Thermo（美國）；蛋白酶抑制劑（11697498001），購自Roche（瑞士）；CCK-8試劑盒（C0038），購自碧云天生物；ExoRNeasy Serum/Plasma Kit（77044）、ExoRNeasy Midi and Maxi Kits（77064）購自Qiagen（德國）；PKH67（MIDI67），購自Sigma（美國）；Reverse Transcription System（A2790），購自Promega（美國）；MiDETECTA Track miRNA qRT-PCR start kit（C10712-1）、miDETECT A Track Mus-miR Primer，購自廣州銳博；無核酶水（P1193），購自Promega（美國）；Anti-CD63 antibody（ab217345）、Anti-CD81 antibody（ab109201）、Anti-TSG101 antibody（ab125011）、Anti-GAPDH antibody（ab8245），購自Abcam（英國）；Anti-Snail1 antibody（3879）、Anti-E-cadherin antibody（14472）、Anti-N-cadherin antibody（13116）、Anti-Vimentin antibody（5741），購自CST（美國）；TGF-β1（MA1-21595），購自Thermo Fisher Scientific（美國）；Goat anti-Mouse-HRP antibody（CW0102M）、Goat anti-Rabbit-HRP antibody（CW0103M），購自北京康為；CD44 Monoclonal Antibody-FITC（11-0441-86）、CD24 Monoclonal Antibody-APC（17-0247-42），購自eBioscience（美國）；NC膜，0.45 μm孔徑（HF13502XSS）、ECL（WBKLS0500），購自Millipore（美國）；miR-221模擬物和miR-221抑制劑購自Thermo Fischer Scientific（美國）（檢測ID：MC10337、MH10337）。甲醇（10014118）國藥；BSA（0332）、Acrylamide（0341）、Bis-Acrylamide（0172）、APS（0486）、Tween-20（0777），購自Amresco（美國）；UltraPureTM TEMED（15524010）購自Invitrogen（美國）；PowerUpTM SYBR? Green Master Mix（A25742）、SYBR Green（4309155），購自ABI（美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠子宮內膜上皮細胞分離、培養：將妊娠第4天的雌性CBA/J小鼠在無菌條件下斷頭處死后取子宮，將子宮縱向剪為2～3 mm小塊，加0.25%胰酶，在4 ℃和室溫條件各消化1 h；加入含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F-12培養基中和胰酶。將組織以室溫

1 000 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，收集細胞懸液。然后加入0.5%膠原酶Ⅱ溶液在37 ℃消化30 min。消化后的細胞懸液經過200目和400目細胞篩進行篩選，細胞用PBS洗滌2次。最后，將細胞以2×105/孔的密度接種于DMEM/F-12培養基中培養；并通過流式細胞術鑒定細胞特性。

1.2.2 細胞增殖實驗：將初級培養的小鼠子宮內膜上皮細胞培養到對數生長期，用0.25%胰蛋白酶消化，并分散到6孔板中培養16～18 h。根據5 μL/mL的比例向細胞上清液中添加純化的外泌體，未經純化的細胞上清液用作對照，TGF-β1（10 ng/mL）用作陽性對照。在添加外泌體后的24、48、72 h和96 h收集細胞，進行CCK-8實驗。

1.2.3 細胞劃痕實驗：將小鼠子宮內膜上皮細胞置于6孔板，細胞密度為1×106/孔。在細胞培養18～24 h細胞鋪滿板底后，用200 μL的槍頭垂直于孔板作細胞劃痕。吸去細胞培養液，用PBS洗板3次。通過加入含有2% FBS的培養基繼續培養細胞，并在不同時間點拍照記錄細胞遷移情況，根據照片收集數據并進行結果分析。

1.2.4 細胞侵襲實驗：在培養皿中放置小室，上室預涂基質膠，向上室加入300 μL無血清培養基。經胰酶消化并用DPBS洗滌2次后，小鼠子宮內膜上皮細胞用無血清培養基重懸，并加入每個Transwell小室。然后，將Transwell小室插入含有10% FBS完全培養基的24孔板的下室中，常規孵育。48 h后收集上室，用0.1%結晶紫室溫下染色10 min后拍照計數。

1.2.5 流式細胞術：通過流式細胞術測定上皮特異性細胞表面標記物CD24和CD44的表達。將細胞收集并用100 μL的DPBS懸浮。向細胞中加入CD44- FITC和CD24- APC抗體，室溫避光下染色15 min。將細胞以

1 000 r/min離心5 min，去除未結合的抗體，隨后用DPBS洗滌3次，用100 μL的DPBS重新懸浮樣本，并用流式檢測CD44和CD24的表達。

1.2.6 小鼠子宮內膜上皮細胞來源外泌體分離與純化：收集培養的小鼠子宮內膜上皮細胞上清液，300×g離心10 min，將上清液轉移至新管中，再以2 000×g離心10 min。然后，將上清液以10 000×g離心30 min。將上清液轉移到超速離心管中，并以100 000×g離心90 min。最后，用100 μL DPBS溶解沉淀物，獲得外泌體。

1.2.7 電鏡下的外泌體檢測：純化的外泌體室溫下用戊二醛固定10 min，然后用冷卻的PBS洗滌3次。然后，加入2%的硝酸鉛固定于4 ℃ 2 h。使用冷卻的PBS洗滌3次，然后用50%、70%、80%和90%梯度乙醇分別脫水20 min。樣品隨后用丙酮脫水2次，并用冷卻的PBS洗滌3次。最后，用醋酸鉛染色10 min，用透射電鏡觀察外泌體。

1.2.8 外泌體細胞染色追蹤：將經消毒的玻璃片放入12孔板中，并加入小鼠子宮內膜上皮細胞培養18 h。使用PHK 76染色試劑盒染色DPBS-外泌體，具體步驟如下：將1 mL稀釋液C和4 μL PKH67混合，并在室溫下靜置5 min，然后添加2 mL BSA終止染色，并使用外泌體血清/血漿提取試劑盒重新提取外泌體。將標記的外泌體加入細胞培養基中，室溫下孵育10 min，細胞培養上清液用作對照。將標記的外泌體和細胞上清液對照加入小鼠子宮內膜上皮細胞中孵育30 min。細胞用冷卻的DPBS洗滌3次，然后用DAPI進行核染色，并用指甲油封口，用熒光顯微鏡拍攝。

1.2.9 熒光定量PCR：收集小鼠子宮內膜上皮細胞培養上清液，并進行外泌體純化。使用外泌體RNA分離及純化劑提取純化的外泌體RNA。逆轉錄提取的RNA，并使用熒光定量PCR測量外泌體RNA中不同miRNA的表達（miRNA引物由廣州銳博合成）。使用Trizol方法提取總細胞RNA，并按說明進行逆轉錄，利用SYBR Green法進行熒光定量PCR測量基因表達。

1.2.10 miRNA轉染RSA小鼠子宮上皮細胞：將小鼠子宮上皮細胞用少量的OPTI MEM培養基洗滌，然后向每個6 cm培養皿中加入1 mL的OPTI MEM培養基。接著，將5 μL的miRNA-221和對照的隨機miRNA分別加入到250 μL的OPTI MEM培養基中，并將6 μL/樣品的Lipofecta mine RNAi MAX加入到另一個250 μL/樣品的OPTI MEM培養基管中。將試管放置在室溫下靜置5 min，然后再在室溫下混合30 min。將混合物加入指示的細胞培養皿中孵育6 h。更換為完全培養基，在37 ℃、5% CO2孵化箱中孵育。轉染后48 h收集細胞，進行熒光定量和免疫印跡法（Western blotting，WB）實驗。

1.2.11 WB檢測miRNA-221轉染后RSA細胞EMT標志蛋白及相關通路蛋白：使用100 μL和1 mL RIPA緩沖液裂解外泌體和細胞樣品，冰上放置15 min后以

12 000 r/min離心15 min。離心后，上清液用BCA試劑盒進行蛋白質定量。將蛋白質濃度調整至接近的濃度，加入5×還原樣品緩沖液，最終樣品濃度為1 mg/mL，在裝載前煮沸10 min進行變性。然后，加載樣品到12%凝膠中進行電泳。蛋白質被轉移到PVDF膜上，并在室溫下用5% BSA-TBST在室溫脫色搖床上緩慢搖晃40 min進行封閉。經過3次TBST洗滌后，膜在4 ℃過夜與不同的一抗抗體孵育。此外，在用TBST洗滌后，膜在室溫下與指示的HRP標記的二抗孵育1 h。按說明使用ECL使蛋白質顯影、定影。

1.2.12 雙熒光素酶報告基因檢測：將293T細胞經0.25%胰酶消化后，以大約2×105的細胞密度均勻分散于6孔板中，孵育18 h。然后，細胞與miRNA-221 mimic、miRNA-221 inhibitor或對照隨機miRNA以及pGL3-Pten 3' UTR-WT或pGL3-Pten 3' UTR-Mut共同轉染48 h。然后，將細胞收集并懸浮于96孔板中。使用Du-al-Glo Luciferase Assay System按照說明書進行熒光檢測。向每孔加入70 μL的螢火蟲熒光素酶底物，室溫下避光反應20 min，以獲取熒光素熒光值。然后，在加入底物后，收集內參的熒光值。計算樣本螢火蟲熒光值與內參熒光值的比值，作為每個樣品的最終值，然后比較不同樣品間熒光值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 27.0及GraphPad Prism 9.5統計學軟件進行數據分析。計量數據以（x-±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RSA小鼠子宮內膜上皮細胞顯示異常的EMT

CCK-8檢測發現，與正常對照組相比，RSA組第2～4天細胞增殖能力降低，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表1。細胞劃痕實驗顯示，RSA組細胞的遷移能力低于正常對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表1、圖1A。細胞侵襲實驗顯示，RSA組細胞的侵襲能力低于正常對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見圖1B。流式檢測發現，RSA組EMT標志蛋白陽性率（CD44+/CD24+）低于正常對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表1、圖1C。WB檢測發現，與正常對照組相比，RSA組細胞的EMT標志性蛋白：E-cadherin表達水平增加，N-cadherin、Vimentin表達水平降低，差異均有統計學意義（Plt;0.05），見表1、圖1D；RSA組細胞黏附蛋白基質金屬蛋白酶（MMP）-7、MMP-9表達水平低于正常對照組，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。

2.2 小鼠子宮內膜上皮細胞能夠分泌外泌體

收集原代培養的小鼠子宮內膜上皮細胞上清液進行外泌體分離，并通過透射電鏡觀察外泌體（圖2A）。WB檢測到外泌體標記蛋白CD63、CD81和TSG101表達（圖2B）。外泌體經PKH87熒光標記后，加入培養基中可觀察到明亮的綠色熒光（圖2C）。

2.3 子宮內膜上皮細胞外泌體可誘導EMT

將外泌體添加到RSA原代培養的小鼠子宮內膜上皮細胞中，并使用CCK-8檢測細胞增殖。結果顯示，添加外泌體的RSA組細胞增殖率高于細胞上清液RSA組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表2。細胞劃痕實驗結果顯示，添加外泌體的RSA組細胞遷移能力高于細胞上清液RSA組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見圖3A、表2。細胞侵襲實驗結果顯示，添加外泌體的RSA組細胞侵襲能力高于細胞上清液RSA組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見圖3B、表2。使用CD24和CD44抗體標記細胞，通過流式檢測到EMT表面標志物的表達（圖3C），結果顯示，添加外泌體的RSA組CD44+/CD24+表達水平高于細胞上清液RSA組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表2。通過WB檢測其他EMT標志蛋白，結果顯示，與細胞上清液RSA組相比，添加外泌體的RSA組細胞的EMT標志蛋白E-cadherin水平降低，間質樣標志蛋白N-cadherin和Vimentin以及基質標志蛋白MMP-7、MMP-9蛋白水平升高，差異均有統計學意義（Plt;0.05），見圖3D、表2。

2.4 來自小鼠子宮內上皮細胞的外泌體含有各種miRNA

對正常對照組和RSA組收集到的子宮內上皮細胞上清液進行外泌體分離、純化和膜蛋白特異性鑒定。結果顯示，兩組樣品的外泌體中均檢測到CD63和CD81蛋白的表達，未檢測到內參蛋白GAPDH的表達，見圖4。然后，將純化的外泌體進行RNA提取、反轉錄和熒光定量PCR檢測miRNA。結果顯示，兩組外泌體中均可檢測到多種miRNA，RSA組miRNA-221、miRNA-720、miRNA-34a表達水平均低于正常對照組，miRNA-133a、miRNA-158-5P、miRNA-365、miRNA-215表達水平均高于對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表3。

2.5 子宮內上皮細胞外泌體miRNA-221誘導EMT

為進一步研究miRNA-221在小鼠子宮內上皮細胞EMT過程中的功能，合成miRNA-221模擬物（miR-221 mimic）、miRNA-221抑制劑（miR-221 inhibi）和對照隨機miRNA（Scrambled miR）。將miRNA轉染至RSA小鼠子宮內上皮細胞后檢測其對細胞EMT的影響。利用CCK-8檢測細胞增殖能力，結果表明，與對照隨機miRNA轉染相比，miRNA-221模擬物轉染的細胞增殖能力增強，而miRNA-221抑制劑轉染的細胞增殖能力減弱，差異均有統計學意義（Plt;0.05），見表4。細胞劃痕實驗和轉移實驗結果顯示，與對照隨機miRNA相比，miRNA-221模擬物能夠促進小鼠子宮內上皮細胞的遷移和入侵能力，而miRNA-221抑制劑則能夠抑制細胞遷移和侵襲能力，差異均有統計學意義（Plt;0.05），見圖5A、5B和表4。為進一步驗證miRNA-221對細胞EMT表型的影響，將轉染miRNA的細胞收集并用CD24和CD44抗體標記，通過流式檢測細胞表面兩種蛋白的變化，結果顯示，與隨機miRNA相比，miRNA-221轉染增加CD24和CD44的表達，而miRNA-221抑制劑則降低了CD24和CD44的表達，差異均有統計學意義（Plt;0.05），見圖5C、表4。

2.6 miRNA-221通過靶向Pten基因負調控PI3K-AKT通路誘導細胞EMT

為進一步研究miRNA-221在小鼠子宮內上皮細胞中誘導EMT的信號通路，將miRNA-221模擬物、miRNA-221抑制劑和對照隨機miRNA轉染至RSA組收集的子宮內上皮細胞。與對照隨機miRNA相比，miRNA-221模擬物降低了RSA組中E-cadherin的水平，上調了N-cadherin、Vimentin的水平，同時MMP- 7和MMP-9蛋白水平也增加，差異均有統計學意義（Plt;0.05）；miRNA-221抑制劑產生了相反的調控作用，差異均有統計學意義（Plt;0.05），見圖6A、表5。

本研究還檢測了不同信號通路的活化情況，與對照隨機miRNA相比，miRNA-221模擬物激活了PI3K-AKT通路、NF-κB通路和p38通路（Plt;0.05）；而三組IL-6通路和EGFR通路比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05），見圖6A、6B和表5。

本研究選擇了PI3K-AKT通路進行下一步的研究。為進一步驗證miRNA-221模擬物對PI3K-AKT通路的激活，使用通路特異性抑制劑對細胞進行處理，并顯示PF-04691502能夠抑制miRNA-221模擬物對EMT蛋白表達的調節作用，細胞侵襲結果也證明PF-04691502能夠抑制miRNA-221模擬物介導的細胞侵襲，見圖6C、6D和表6、7。

為研究miRNA-221如何影響PI3K-AKT通路，通過Target Scan網站（https：//www.targetscan.org/）預測miRNA-221的靶基因，并確定PTEN作為一個重要的PI3K-AKT通路負調控因子，是miRNA-221的預測靶基因。在轉染miRNA-221模擬物、miRNA-221抑制劑和隨機miRNA后，通過熒光定量PCR檢測PTEN的表達，結果顯示miRNA-221模擬物降低了PTEN mRNA的表達水平，而miRNA-221抑制劑轉染則增加了其表達水平（表5）。預測miRNA-221與3'UTR區域的結合位點（圖6E），利用雙熒光素酶報告基因實驗進行驗證，結果顯示，miRNA-221模擬物降低了Pten-WT-Luc熒光素強度，對突變基因型沒有顯著影響，見表8。

3 討論

在胚胎植入過程中，受激素和細胞因子的影響，子宮內膜上皮細胞顯示出一系列分子變化，如EMT，進一步為妊娠的啟動創造了有利的環境。然而，增加的外泌體的分子生物學功能以及與RSA的關系尚待確定。本研究發現與正常妊娠的小鼠相比，RSA小鼠子宮內膜上皮細胞EMT過程減弱。此外，含有miRNA-221的外泌體通過負調控Pten基因激活PI3K-AKT通路，進一步促進RSA組子宮內膜上皮細胞EMT的發生。

EMT的特征包括細胞間黏附的喪失，頂基底極性的下調，細胞骨架的重組以及MMPs的表達［12-13］。EMT已經被廣泛證明是腫瘤細胞侵襲和轉移的關鍵步驟，并與患者預后不良呈正相關［14-15］。然而，這些特征在侵襲性癌細胞和胚胎植入過程中的侵襲性胚胎細胞行為之間是相似的。已經有研究表明，在胚胎植入過程中，子宮內膜上皮細胞經歷EMT過程，使其具有間充質特征，并由于細胞極性的喪失，在植入窗口期更容易接受胚胎［16］。植入窗口期內EMT過程的激活失敗可能是胚胎植入失敗和流產的原因之一。EMT的特征是E-cadherin的表達低下，細胞骨架重構為紡錘狀形態，而間充質細胞標志物N-cadherin和vimentin的表達升高［17］。因此，E-cadherin的缺失被認為是EMT過程的標志性事件。體內研究顯示，子宮內膜上皮細胞的EMT在胚胎植入的第5天發生，且僅在有已植入胚胎的情況下發生［18］。

多項研究表明，外泌體在胚胎植入過程中起著重要作用。在囊胚著床前階段，可以在子宮液中檢測到高水平的外泌體，這些外泌體參與細胞黏附和凋亡［19］。來源于滋養層細胞的外泌體衍生的miRNAs也在人類囊胚的培養液和活檢的滋養層細胞中被鑒定。這些miRNAs的靶基因被預測參與細胞生長和增殖［7］。此外，據預測，內膜外泌體衍生的miRNAs可能通過多個信號通路靶向參與內膜容受性和胚胎植入的基因，包括血管內皮生長因子、腫瘤壞死因子α、JAK-STAT通路等，這些通路是蛻膜化和植入的調節因子［20］。胚胎外泌體是否富含這些miRNAs目前還不十分清楚。研究表明，來自子宮內膜上皮細胞的含miRNA的外泌體可能被囊胚的滋養層細胞或子宮內膜上皮細胞內吸，從而介導子宮內膜與胚胎的相互作用，并影響胚胎植入［21］。LI等［22］發現，內膜上皮可以通過外泌體的幫助調節胚胎基因表達。研究人員還對來自16名女性不同內膜狀態（增生和分泌期）的內膜分泌物中的外泌體miRNA進行了測序，發現miRNA-30d在分泌期，特別是著床期，與其他時期相比顯著增高。多項研究表明，孕婦的子宮內膜可以通過相關的外泌體miRNAs調節與囊胚前期胚胎相關的基因表達，從而促進胚胎著床。由于外泌體富含miRNAs，可以推測胚胎外泌體會選擇性地調控內膜上皮的轉錄組，并指引著床。多種miRNAs，如miRNA-429、miRNA-30a-3P和miRNA-126a-3P，已被證明可以調節內膜上皮細胞的EMT過程，從而影響胚胎受精［23］。在一項miRNA譜的研究中，ECC1細胞包含219個miRNA基因的轉錄本，而所示的外泌體包含227個轉錄本，并且外泌體含有13個在細胞中未檢測到的獨特的miRNA轉錄本［24］。源自內膜的外泌體miRNAs通過調節滋養層中EMT的功能促進胚胎著床。進一步研究表明，miRNA-1290在外泌體中富集，并通過靶向LHX6促進IL-6和IL-8的表達，進一步影響子宮內膜上皮細胞的遷移；滋養層細胞HTR8/SVneo產生的外泌體miRNA-1290也可以促進子宮內膜上皮細胞HEC-1-A的EMT過程［25］。在這項研究中，從小鼠內膜上皮細胞分泌的外泌體能夠誘導EMT。通過熒光定量PCR檢測正常對照組和RSA組的外泌體，發現多個miRNA的水平在兩組樣本中有顯著差異，如miRNA-221、miRNA-133a、miRNA-158-5P、miRNA-23a、miRNA-720、miRNA-27b、miRNA-365、miRNA-215、miRNA-34a，本研究最終選擇了與細胞EMT相關的miRNA-221進行進一步研究，本研究結果顯示，來自小鼠子宮內膜上皮細胞的外泌體miRNA-221誘導了小鼠子宮內膜上皮細胞的EMT，促進了細胞的遷移和侵襲能力。相反，抑制miRNA-221會抑制EMT、細胞遷移和侵襲能力，表明miRNA-221是影響內膜EMT過程的重要因素。

來自間充質干細胞的外泌體通過激活胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）和p38 MAPK通路來促進血管生成［26］。類似地，黑色素瘤源自的外泌體將受體酪氨酸激酶MET轉移給骨髓干細胞，使其能夠支持腫瘤血管生成、侵襲和轉移［27］。如何針對或利用這樣的外泌體在胚胎植入和RSA中仍然未知，需要進一步研究。在預測的靶基因中，本研究著重研究了腫瘤抑制基因PTEN，其通過去磷酸化PIP3抑制PI3K活性，從而負向調節AKT通路的活性。PI3K-AKT通路被廣泛證明在癌細胞中介導EMT，可能通過直接作用于與EMT相關的轉錄因子來實現。作為一個堿基螺旋環轉錄因子，Twist可以強烈誘導EMT，而活化的Akt會上調Twist1的磷酸化表達［26］。Slug和Snail均屬于相同的轉錄因子家族，具有鋅指結構。Slug和Snail可以通過結合E-cadherin啟動子的E-box上游來誘導EMT，并抑制E-cadherin基因的表達［28］。PI3K-AKT的活化可以通過促進糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）的泛素化而降低Snail的降解。WEI等［29］發現PI3K/Akt的活化導致GSK-33β的降解，并導致Slug的表達，最終導致EMT的誘導。本研究的WB結果顯示，miRNA-221模擬物可以增加P-p38、P-Akt的表達水平，表明PI3K-AKT被活化。雙熒光酶報告基因實驗證明，PTEN作為PI3K-AKT抑制基因是miRNA-221的靶基因。

綜上，來源于內膜上皮細胞的外泌體攜帶的miRNA-221通過負向調節Pten基因激活了PI3K-AKT通路，從而促進了EMT的發生，這個過程可以影響妊娠結局，這一發現為RSA的機制和改善妊娠結局提供了新的思路。

作者貢獻：李夢元負責提出研究思路，設計研究方案及論文起草；李冠杉負責實驗；韓倩、李思瑤及鄭舒暢負責數據的收集與整理；辛明蔚、王景尚、武穎負責繪圖與展示；尹曉丹進行論文修訂；何軍琴負責最終版本修訂，對論文負責。

本文無利益沖突。

李夢元https：//orcid.org/0000-0003-0089-8423

何軍琴https：//orcid.org/0000-0002-3223-7710

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（收稿日期：2023-10-10；修回日期：2024-03-30）

（本文編輯：賈萌萌）