HLTF調控AngⅡ誘導的心臟成纖維細胞的作用及機制研究

【摘要】目的 "探究解旋酶樣轉錄因子（HLTF）對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導的心臟成纖維細胞（CF）中纖維化功能和表型影響及作用機制。方法 "分離培養原代小鼠CF，用濃度為1 μmol/L的AngⅡ處理CF，分為正常組和AngⅡ組。同時分別用腺病毒轉染下調或上調HLTF的表達，將細胞進一步分為下調對照＋AngⅡ組和下調HLTF＋AngⅡ組及上調對照＋AngⅡ組和上調HLTF＋AngⅡ組。采用CCK-8法和細胞劃痕檢測細胞的增殖和遷移能力。RNA測序篩選相關差異基因。免疫印記檢測HLTF、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和R-spondin1（Rspo1）蛋白水平。實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測膠原蛋白Ⅰ（COL1A1）mRNA水平。免疫熒光染色檢測α-SMA水平。結果 "AngⅡ誘導CF后HLTF蛋白及COL1A1 mRNA水平升高，CF增殖及遷移能力增加，且免疫熒光染色顯示α-SMA表達增強（P＜0.05）。下調HLTF＋AngⅡ組與下調對照組比，CF中HLTF、α-SMA蛋白及COL1A1 mRNA均降低，CF增殖及遷移能力減弱（P＜0.05）。相反上調HLTF進一步促進AngⅡ誘導CF中HLTF、α-SMA蛋白及COL1A1 mRNA表達，促進CF的增殖和遷移能力（P＜0.05）。此外，RNA測序顯示在下調HLTF后差異基因中Rspo1改變最顯著。同時免疫印記結果表明，AngⅡ誘導的CF中HLTF下調或上調，Rspo1蛋白水平相應降低或升高。結論""下調HLTF可緩解AngⅡ誘導的CF纖維化功能和表型轉換，且可能通過下調Rspo1改善心臟纖維化。

【關鍵詞】解旋酶樣轉錄因子；心臟成纖維細胞；血管緊張素Ⅱ；心臟纖維化

【DOI】10.16806/j.cnki.Ⅰissn.1004-3934.2025.02.000

【Abstract】Objective "To investigate the effect and mechanisms of helicase-like transcription factor （HLTF） on fibrosis"function and phenotype in angiotensin Ⅱ （AngⅡ）-induced cardiac fibroblasts （CF）. Methods "Primary mouse CFs were isolated and cultured，and"treated with"1 μmol/L AngⅡ. Cells were divided into normal group and AngⅡ"group. Additionally，adenoviral transfection was used to modulate HLTF expression，resulting in additional groups： downregulation control+AngⅡ group，HLTF downregulation+AngⅡ group，upregulation control+AngⅡ"group and HLTF upregulation+AngⅡ"group."Cell proliferation and migration were assessed using the CCK-8 assay and wound healing assay. RNA sequencing identified differentially expressed genes. Western blot was used to analyze the protein levels of HLTF，α-smooth muscle actin （α-SMA）"and R-spondin1（Rspo1）."Quantitative real-time PCR assessed mRNA levels of collagen"typeⅠ（COL1A1）. Immunofluorescence staining was used to assess"α-SMA expression. Results""AngⅡ"stimulation increased HLTF protein and COL1A1 mRNA levels，enhanced CF proliferation and migration，and elevated α-SMA expression as shown by immunofluorescence staining（P＜0.05）."Compared with the control group，the HLTF downregulation+AngⅡ group showed reduced levels of HLTF，α-SMA protein，and COL1A1 mRNA，as well as decreased CF proliferation and migration （P＜0.05）."Conversely，HLTF upregulation promoted"AngⅡ-induced HLTF，α-SMA protein，and COL1A1 mRNA expression，further enhancing CF proliferation and migration （P＜0.05）.RNA sequencing revealed that Rspo1 was the most significantly altered gene after HLTF downregulation."Western blot confirmed that HLTF downregulation or upregulation correspondingly decreased or increased Rspo1 protein levels in AngⅡ-treated CFs."Conclusion HLTF downregulation can alleviate AngⅡ-induced fibrosis"function and phenotype transformation"in CF，potentially"by suppressing Rspo1，thereby improving cardiac fibrosis.

心臟纖維化是對應激或損傷的病理反應，幾乎發生在心肌梗死、肥厚型心肌病、擴張型心肌病和糖尿病心肌病等所有類型的心臟疾病中[1]。心臟纖維化可以增加左心室的僵硬度，破壞心臟傳導，損害心臟收縮和舒張功能。纖維化的存在與心血管死亡率和全因死亡率獨立相關[2]。心臟成纖維細胞（cardiac fibroblast，CF）是纖維化過程的主要參與者。在初始損傷和促纖維化刺激下，靜止的CF被激活并隨后分化為肌成纖維細胞（myofibroblast，myoFbs），表達α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），表現出增加的增殖和分泌特性，促進細胞外基質和膠原的沉積，導致心室壁僵硬，心臟功能進行性損害，最終進展為不可逆的心力衰竭[3]。盡管抗血管緊張素藥物、醛固酮拮抗劑等已用于心臟纖維化重構的治療，但目前心臟纖維化疾病仍缺乏基于循證醫學證據的有效治療方法。

解旋酶樣轉錄因子（helicase-like transcription factor，HLTF）是轉換/蔗糖非發酵（switch/sucrose non-fermenting，SWI/SNF）家族成員之一，具有三磷酸腺苷依賴性解旋酶活性，參與染色質重塑、DNA損傷修復和基因轉錄的調控過程[4]。此外，HLTF還在泛素-蛋白酶體途徑中發揮重要作用[5]。在腫瘤研究領域，HLTF因其在抑制腫瘤發生和維護基因組穩定性方面而受到關注[6]。已有研究[7]表明HLTF參與新生小鼠心臟中膠原蛋白的生物生成。但HLTF在心臟纖維化中的作用尚不清楚。本研究旨在探討HLTF在心臟纖維化中的作用并探究其潛在機制。

1 "材料與方法

1.1 "主要試劑與儀器

0.2%膠原酶Ⅱ（德國BioFroxx公司，2275MG100）；胰蛋白酶（中國碧云天生物技術有限公司，C0201）；胎牛血清（美國Gibco公司，10099-141）；DMEM/F-12細胞培養基（美國HyClone公司，SH30023.01）；CCK-8試劑盒（日本同仁，CK04）；SYBR Green Master Mix試劑盒（諾唯贊生物科技有限公司，Q111-02）；血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）（美國MCE公司，HY-13948）;HLTF抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，14286-1-AP）；α-SMA（美國Affinity公司，AF1032）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（杭州賢至生物有限公司，AB-P-R 001）；R-spondin1（Rspo1）抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，25348-1-ap）。

1.2 "原代CF的分離與培養

1～3 d齡的SPF級C57BL/6J小鼠購于三峽大學動物實驗中心（實驗動物生產許可證：SCXK（鄂）2022-0012），經武漢大學人民醫院動物倫理委員會批準（WDRM動（福）第20240802E號）。0.1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉乳鼠，75%乙醇中浸泡消毒，迅速取出心臟并用冰Hanks溶液反復沖洗。將心室組織切成約1 mm3的碎片，0.125%胰蛋白酶4 ℃過夜后，0.2%膠原酶Ⅱ多次消化后加入含10%胎牛血清的DMEM/F-12完全培養液終止消化。1 200 r/min離心10 min后加入培養液重懸并接種于培養瓶中。1 h后去除非貼壁細胞，加入含有10%胎牛血清的培養液重新培養。24 h后，當成纖維細胞達到80%融合時，胰蛋白酶消化細胞并傳代，取第3～5代細胞用于實驗。

1.3 "心臟纖維化細胞模型構建

在細胞貼壁生長為60%～70%時，加入含AngⅡ（1"μmol/L）的細胞完全培養基繼續在37 ℃下95%空氣和5% CO2培養箱中培育24 h。

1.4 "腺病毒轉染

HLTF下調的短發夾RNA腺病毒（Ad-shHLTF）及其對照病毒（Ad-shRNA）和HLTF上調病毒（Ad-HLTF）及其對照病毒（Ad-con）由上海吉凱基因公司構建。當CF為50%～60%融合時，以病毒感染復數為50的Ad-shHLTF或Ad-shRNA分別轉染細胞4 h。隨后，棄去含有腺病毒的上清，加入完全培養基繼續培養24 h。Ad-HLTF或Ad-con同上述方法轉染CF。免疫印跡法檢測HLTF的表達，確定病毒是否轉染成功。

1.5 "細胞分組

分離培養原代小鼠CF后，根據是否加入1 μmol/L的AngⅡ刺激，分為正常組和AngⅡ組。根據是否下調HLTF表達，分為下調對照＋AngⅡ組（Ad-shRNA＋AngⅡ組）和下調HLTF＋AngⅡ組（Ad-shHLTF＋AngⅡ組）。另外根據是否上調HLTF表達，分為上調對照＋AngⅡ組（Ad-con＋AngⅡ組）和上調HLTF＋AngⅡ組（Ad-HLTF＋AngⅡ組）。

1.6 "細胞增殖和遷移檢測

通過CCK-8試劑盒評估不同組CF的增殖能力。將細胞以2×103/孔接種于96孔板中繼續培養12 h貼壁，根據不同分組病毒轉染24 h后加入AngⅡ繼續處理24 h，每孔加入10μL CCK-8試劑后37 ℃培養箱孵育3 h，隨后利用酶標儀檢測450 nm的光密度（optical density，OD）值。

細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養基培養于6孔板中，當細胞密度為70%～80%時，用無菌槍頭在孔板劃痕定位并拍照，根據需要加入含1"μmol/L"AngⅡ及1%胎牛血清的DMEM/F-12培養基培養細胞24 h后，在同一位置拍照以作對比，每組采集6個視野，Image J軟件分析統計劃痕面積。細胞遷移率＝（0 h劃痕面積－24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積。

1.7 "細胞免疫熒光染色

細胞種于6孔培養板培養至密度為50%～60%時，根據實驗分組、目的給予相應處理（病毒轉染、AngⅡ）后，棄原培養基，磷酸鹽緩沖液漂洗3次，甲醛固定和Triton X-100通透后，用α-SMA（1∶200）的一抗孵育4 ℃過夜，隨后二抗孵育2 h，磷酸鹽緩沖液漂洗后DAPI染核，熒光顯微鏡隨機采集每個樣本的熒光圖像。運用Image J軟件分析各組細胞平均熒光強度。

1.8 "實時熒光定量聚合酶鏈式反應

TRIzol試劑提取細胞中的總RNA，并用分光光度計檢測吸光度比值（A260/A280），計算RNA濃度，隨后根據試劑盒說明將mRNA逆轉成cDNA。使用SYBR Green qPCR Master Mix體系進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）。以GAPDH作為內參。最后采用2-ΔΔCt方法分析數據。膠原蛋白Ⅰ（COL1A1）、GAPDH引物序列如下：COL1A1正向5’-GACCCTAACCAAGGCTGCAA-3’，反向5’-GACATTAGGCGCAGGAAGGT-3’，GAPDH正向5’-GAGAGTGTTTCCTCGTCCCGTA-3’，反向5’-CCTCACCCCATTTGATGTTAGT-3’。

1.9 "免疫印記檢測

使用RIPA裂解緩沖液裂解CF提取蛋白。取適量蛋白原液用二喹啉甲酸法進行蛋白定量。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白分離，用電轉化法將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h后轉移至一抗中4 ℃搖床過夜。加入相應的二抗室溫孵育1 h后，使用增強化學發光試劑將目的條帶顯影，通過Image J軟件對蛋白灰度值進行分析。以GAPDH作為內參。

1.10 "統計學分析

所有數據均采用GraphPad Prism（版本8.2.1）和SPSS 19.0進行非配對t檢驗或單因素方差分析。計量數據采用均數±標準差（±s）表示，以P＜0.05判定為差異具有統計學意義。

2 "結果

2.1 "AngⅡ誘導CF中HLTF表達上調并且伴隨細胞功能紊亂

與正常組相比，AngⅡ處理顯著提高了CF中HLTF蛋白表達水平，具有統計學意義。此外COL1A1"mRNA表達明顯升高（P＜0.05）（圖1A～C）。CCK-8結果顯示，AngⅡ組CF的增殖能力顯著增強（P＜0.05）（圖1D），并且劃痕試驗進一步驗證了AngⅡ組CF遷移能力的增強（P＜0.05）（圖1E～F）。免疫熒光染色也顯示AngⅡ組中α-SMA表達明顯，提示CF向myoFbs表型轉化（圖1G～H）。

2.3""上調HLTF促進AngⅡ誘導的CF的功能紊亂

同時筆者研究了HLTF上調對CF纖維化功能影響。Western blot結果顯示，與Ad-con＋AngⅡ組相比，Ad-HLTF＋AngⅡ組中HLTF、α-SMA蛋白表達升高，差異有顯著性（P＜0.05）（圖3A～C）。同時COL1A1 mRNA也顯著增加（P＜0.05）（圖3D）。CCK-8結果表明，Ad-HLTF＋AngⅡ組CF增殖能力增強（P＜0.05）（圖3E），并且劃痕試驗驗證了HLTF上調后AngⅡ誘導的CF遷移能力增強（P＜0.05）（圖3F～G）。免疫熒光染色也證明Ad-HLTF＋AngⅡ組中α-SMA表達升高，提示其向myoFbs表型轉化進一步加強（圖3H～I）。

3 "討論

心臟纖維化是幾乎所有心臟疾病進展中的重要病理過程，導致心臟室壁僵硬和功能下降，從而加劇心力衰竭及不良結局[8]。在纖維化過程中，CF通過增殖和分化為myoFbs，促進膠原蛋白等細胞外基質的沉積[3，9]。多種細胞因子，如轉化生長因子-β、AngⅡ、血小板衍生生長因子等是導致心臟纖維化的關鍵驅動力[10]。盡管對纖維化機制已有較深入研究，但目前仍缺乏有效的特異性治療藥物，這需要進一步探索纖維化的關鍵調控因素[11]。

HLTF屬于SWI/SNF家族，作為染色質重塑和泛素化途徑的調控因子，在調節細胞DNA修復、復制和轉錄等過程中具有重要作用[4]。既往有研究[12]表明，HLTF作為一種腫瘤抑制基因，在多種癌癥如結腸癌、胃癌、食管癌和肺癌中往往通過甲基化而表達下調。Liu等[13]發現，轉化生長因子-β刺激結直腸癌細胞系時，HLTF及Smad相關蛋白表達增加，提示HLTF可能通過TGF-β-Smad信號通路調控細胞遷移與侵襲。此外，HLTF在肝細胞癌中的上調通過激活ERK/MAPK信號通路，增強了癌細胞的增殖和轉移能力[14]。在心臟領域，Helmer等[7]的研究顯示，沉默新生小鼠中的HLTF導致心肌間質和血管周圍膠原纖維網絡混亂，改變了心肌組織結構，表明HLTF可能在心臟組織的結構和功能維持中扮演關鍵角色。然而，關于HLTF在心臟纖維化中的作用尚未有系統的研究。本研究首次系統性地探討了HLTF在AngⅡ誘導的CF纖維化中的作用。結果顯示，AngⅡ處理顯著增加了CF中HLTF、COL1A1和α-SMA的表達，促進了細胞的增殖、遷移及其向myoFbs的表型轉化。進一步的實驗表明，下調HLTF可降低AngⅡ誘導的CF增殖、遷移及膠原沉積，從而緩解纖維化；相反，上調HLTF則促進了這些纖維化特征的增強。這些都證實HLTF是調控心臟纖維化的關鍵分子。

為探究HLTF調控纖維化機制，筆者通過RNA測序篩選出Ad-shRNA＋AngⅡ組和Ad-shHLTF＋AngⅡ組差異基因，其中Rspo1表達最為突出，且與HLTF水平正相關，提示Rspo1是HLTF調控的潛在靶分子。Western blot實驗進一步證實了Rspo1的表達隨HLTF的改變而變化。Rspo1是一種重要的分泌性蛋白，在調控Wnt/β-catenin信號通路中發揮關鍵作用，通過與受體結合，增強Wnt信號通路及促進β-catenin的穩定和核內積累，從而調控下游基因的表達[15-16]。在腎臟和肝臟纖維化研究[17-19]中，Rspo1已被證明通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進膠原沉積和纖維化進程。而Wnt/β-catenin信號通路的激活在心臟纖維化中的作用同樣至關重要[20]。小鼠主動脈縮窄模型顯示，Wnt/β-catenin信號通路的激活促進了CF的增殖和細胞外基質的沉積，而抑制β-catenin可減少Cola1、Col3a1和Postn等纖維化標志物的表達，顯著改善心臟功能，并減少間質纖維化[21]。Nayakanti等[22]發現抑制Wnt信號可通過下調FOSL1和FOSL2的轉錄活性減輕心臟纖維化和肥大，從而改善心臟功能。

綜上所述，本研究證實了下調HLTF可緩解AngⅡ誘導的CF纖維化功能和表型轉換，且可能通過下調Rspo1調節Wnt/β-catenin信號通路改善心臟纖維化。這一發現為理解成纖維細胞在心臟纖維化及心臟重構中的作用機制提供了新的視角，并為治療心臟纖維化提供了新的研究思路。然而，本研究也存在一定的局限性，HLTF與Rspo1之間的具體機制研究尚不夠深入。未來的研究可能需要采用免疫共沉淀、下拉實驗等方法來明確二者之間的相互關系。

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收稿日期：2024-09-02