基于CRISPR/Cas9技術的SS18-SSX1陽性細胞模型的構建與驗證

摘要：目的 利用CRISPR/Cas9技術構建并驗證SS18-SSX1+-HEK293T細胞模型。方法 靶向SS18和SSX1分別設計sgRNA，構建Lentivirus-CRISPR v2-SS18-gRNA-SSX1-gRNA-EGFP一體化慢病毒載體，通過慢病毒轉染和熒光流式分選技術篩選轉入載體的HEK293T多克隆細胞，在多克隆細胞的基礎上挑選SS18-SSX1陽性的單克隆細胞株，通過RT-PCR、Sanger測序和Western Blot驗證SS18-SSX1+-HEK293T單克隆細胞系構建成功。結果 成功構建了Lentivirus-CRISPR v2-SS18-gRNA-SSX1-gRNA-EGFP慢病毒載體；通過RT-PCR、Sanger測序和WB實驗在178個HEK293T單克隆細胞中成功篩選并驗證出1株SS18-SSX1陽性的單克隆細胞系。結論 利用CRISPR/Cas9技術成功構建SS18-SSX1融合基因陽性的HEK293T細胞系。

關鍵詞：CRISPR/Cas9；滑膜肉瘤；SS18-SSX1；HEK293T細胞

中圖分類號：中圖分類號R738文獻標志碼：A文獻標識碼

DOI：10.13880/j.cnki.65-1174/n.2024.22.035

文章編號：1007-7383（2025）01-0008-08

Construction and validation of SS18-SSX1 fusion gene positive cell model based on CRISPR/Cas9 technology

TIAN" Jiao1，ZHANG" Qianru1，WANG" Ning1，SHI" Qi2，LI" Ya2，ZHANG" Kunlan1，LI" Feng^1，2*

（1 Department of Pathology and Key Laboratory for Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases， School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000， China; 2 Department of Pathology and Medical Research Center， Beijing Chaoyang Hospital， Capital Medical University，Beijing 100020， China）

Abstract： "Objective The construction and validation of a cell model utilising the CRISPR/Cas9 technology was conducted for the SS18-SSX1+-HEK293T cell line. Methods Lentivirus-CRISPR v2-SS18-gRNA-SSX1-gRNA-EGFP lentiviral vectors were constructed by designing single guide RNAs （sgRNAs） targeting SS18 and SSX1， respectively. The HEK293T poly The transfected cells were screened by lentiviral transfection and fluorescence flow sorting， and a SS18-SSX1+-HEK293T monoclonal cell line was successfully constructed by RT-PCR， Sanger sequencing and Western Blot. Results A lentivirus-CRISPR v2-SS18-gRNA-SSX1-gRNA-EGFP lentiviral vector was successfully constructed. One SS18-SSX1 positive monoclonal cell line was successfully screened and validated in 178 HEK293T monoclonal cells by RT-PCR， Sanger sequencing and WB experiments. Conclusion First successful construction of SS18-SSX1 fusion gene positive HEK293T cell line using CRISPR/Cas9 technology.

Key words： CRISPR/Cas9;synovial sarcoma;SS18-SSX1;HEK293T cells

0 前言

滑膜肉瘤（Synovial sarcoma，SS）是軟組織肉瘤的第四大常見類型，約占所有病例的5%～10%。本病多見于15～35歲的患者，約70%的SS發生于四肢軟組織。SS患者的5年生存率約為36%，10年生存率為10%～30%^［1-2］。從分子遺傳學上看，SS含有特征性的t（X；18）（p11；q11）易位，即18號染色體上的SS18與X染色體上的SSX基因之一（SSX1、SSX2或SSX4）融合，最常見的融合轉錄本是SS18（exon10）-SSX1（exon6）^［3-4］。研究SS18-SSX融合基因的作用機制或許能為臨床檢測和開發滑膜肉瘤的治療藥物提供新的思路^［5］。

細胞模型對于探究滑膜肉瘤中SS18-SSX1融合基因的作用機制來說必不可少，在過去的幾年里，基因編輯技術逐漸應用于細胞模型的構建，其中CRISPR/Cas9技術在靶標設計的簡單和高效率方面有著更大的優勢^［6］。在CRISPR/Cas9技術中，細胞可通過非同源末端連接（Nonhomologous end-joining，NHEJ）的方式來修復Cas9核酸酶切割形成的DNA雙鏈斷裂末端（Double strand breaks，DSBs）^［7］。參與修復的蛋白經常會在DNA末端插入或刪除幾個堿基（indel），然后將DNA連接到一起。修復后的基因由于含有突變而導致功能喪失，稱為基因敲除（knock-out），這是比較常見的CRISPR/Cas9技術運用案例^［8-10］。但近年來也有少量文獻報導，NHEJ修復途徑也可以導致染色體重排，形成融合基因^［11-14］，目前國內外尚未發現運用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建滑膜肉瘤SS18-SSX融合基因陽性細胞模型的報導。

本研究運用CRISPR/Cas9基因編輯技術在人胚胎腎細胞系HEK293T細胞中構建滑膜肉瘤SS18-SSX1融合基因陽性的細胞模型。與常用的質粒轉染整個融合基因序列不同，我們分別靶向SS18和SSX1兩個單基因的內含子，使之產生DNA雙鏈斷裂末端形成SS18-SSX1融合基因。我們優化了sgRNA的設計流程并構建了一體化Cas9質粒，部分提高了sgRNA的剪切效率和載體的轉染效率。基于細胞非同源末端連接的修復方式，一些細胞中SS18的1-10外顯子會與SSX1的6-8外顯子融合在一起形成SS18-SSX1+-HEK293T的細胞模型。本研究成功篩選并驗證了這一模型，這為CRISPR/Cas9基因編輯技術應用于滑膜肉瘤提供了一定理論支持，并為課題組進一步深入研究滑膜肉瘤中SS18-SSX1融合基因產生的R-loops作用機制提供了細胞模型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人胚胎腎細胞系HEK293T和無SS18-SSX融合基因的人滑膜肉瘤細胞系SW982購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心，DMEM高糖培養基、胎牛血清、青-鏈霉素混合液均購自美國Gibco公司，Lenticrispr V2質粒、SS18-sgRNA、SSX1-sgRNA均購自蘇州賽業公司，lipofectamine 3000、RNA 提取試劑 Trizol 購自美國 Invitrogen公司，用于sgRNA克隆及RT-PCR引物的寡脫氧核苷酸鏈由上海生工生物有限公司合成；質粒提取試劑盒購自于北京天根生物有限公司；Bbs I 限制性內切酶、T4 DNA 連接酶、 PNK 磷酸化酶購自于 Thermo Scientific 公司；SS18-SSX抗體購自Cell signaling technology公司，β-Actin抗 體購自碧云天。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養方法

HEK293T和SW982細胞使用含有10% 胎牛血清、1%青-鏈霉素的高糖 DMEM 培養基。細胞置于 37℃、含 5% 二氧化碳的無菌培養箱中培養，間隔 2～3d 更換細胞培養基。

1.2.2 sgRNA的設計

根據查閱文獻，SS18可分別與SSX1、SSX2和SSX4形成融合基因SS18-SSX，本研究構建最常見的融合基因亞型SS18-SSX1，它是由SS18的1-10外顯子與SSX1的6-8外顯子融合形成。基于ensembl數據庫檢索人源SS18和SSX1基因的基因組序列并下載。在形成融合基因的斷裂點位置，即SS18的第10內含子和SSX1的第5內含子的1 000 bp序列處，用在線工具（http：//crispor.tefor.net/）設計gRNA，分別選擇SS18和SSX1評分前十名的特異性較好的gRNA序列。

1.2.3 sgRNA的篩選

打開網站https：//cctop.cos.uni-heidelberg.de：8043/index.html，把選擇好的SS18和SSX1的sgRNA序列分別粘貼在框內，物種選擇Human，點擊Submit，進行sgRNA脫靶驗證。驗證后脫靶效率低的SS18和SSX1的各3條sgRNA作為最終設計好的sgRNA送到蘇州賽業公司合成（表1）。

1.2.4 sgRNA剪切效率的檢測與篩選

3條SS18-sgRNA和3條SSX1-sgRNA合成后分別與Cas9蛋白一起電轉進HEK293T細胞，提取細胞基因組進行Sanger測序，測序數據導入https：//tide.nki.nl/網站檢測sgRNA的剪切效率，選擇剪切效率最高的SS18-gRNA3和SSX1-gRNA3進行后續CRISPR慢病毒載體的合成，剪切效率見表2。

1.2.5 LV-SS18-SSX1-Cas9慢病毒質粒的構建

構建一體化CRISPR/Cas9慢病毒載體即LV-U6gt;{hSS18-gRNA}-U6gt;{hSSX1-gRNA}-CMVgt;hCas9/P2A/EGFP。首先使用Bsm BI限制性內切酶消化骨架載體獲得線性化載體。隨后使用諾唯贊 P515 酶 PCR 體系擴增SS18-sgRNA、SSX1-sgRNA目的基因片段，隨后將酶切好的載體和擴增后的基因片段使用C115 Infusion 連接酶進行連接。對重組產物直接進行轉化，挑取平板上的克隆進行 PCR 鑒定，對陽性克隆進行酶切鑒定、測序鑒定。將正確克隆大提，用于后續的病毒包裝、轉染。

1.2.6 慢病毒轉染與流式熒光分選

使用 lipofectamine 3000轉染試劑將含有SS18和SSX1基因sgRNA 的 重組質粒與慢病毒包裝質粒共轉染入 HEK293T 細 胞，分 別 于 48h 和 72h 收集慢病毒，得到LV-SS18-SSX1-Cas9慢病毒液。將1mL慢病毒液加入預先鋪在六孔板中的HEK293T細胞進行轉染，并在 72h后于熒光顯微鏡下觀察EGTP綠色熒光蛋白標簽的表達，以判斷轉染是否成功，將轉染后的細胞采用流式熒光分選活細胞技術篩選出轉染成功的HEK293T細胞（表達EGFP綠色熒光）。

1.2.7 單克隆細胞的培養與測序鑒定

將流式熒光分選后的HEK293T細胞按照1個細胞/孔的接種比例接種于96孔板中進行培養，每 5～7d更換含有10%FBS的DMEM培養基。待單個細胞長滿96孔板的一個孔后轉移到48孔板，繼續按照24孔板、六孔板、瓶進行擴大培養建系。培養瓶中細胞一半凍存，一半提取RNA進行RT-PCR篩選是否有融合基因SS18-SSX1表達，PCR 產物送上海生工生物工程公司進行測序分析。

1.2.8 RT-PCR檢測SS18-SSX1融合基因的表達

用Trizol法提取CRISPR編輯的SS18-SSX1+-HEK293T細胞基因組，利用SS18-SSX融合基因引物進行一步法RT-PCR擴增。PCR反應體系25 ul： 5X buffer（5 ul）; dNTP（1 uL）;引物SS18， SSX為0.6 ul；樣本 RNA 0.2ug; mixed enzyme（1uL），余加去離子水。PCR反應體系：逆轉錄50℃ 30 min; PCR起始95℃ 15 min滅活逆轉錄酶; PCR循環94 ℃/30s; 55 ℃ 30 s ; 72 ℃ 30 s; 40個循環后72℃ 10 min終延伸。PCR產物進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條帶送上海生工生物公司進行測序鑒定（表3）。

1.2.9 Western blot 檢測SS18-SSX1融合蛋白的表達

野生型HEK293T細胞和上述CRISPR編輯的SS18-SSX1+-HEK293T細胞分別種于6孔板，細胞長滿后棄去培養基并用PBS 清洗，加入100～200μL RIPA 裂解液后靜置 5 min，刮下細胞后置于1.5mL EP管中在冰上超聲裂解，靜置20 min，離心取上清并測定蛋白濃度。向 10%的聚丙烯酰胺凝膠中加入各組蛋白樣品進行電泳，并轉印至 PVDF 膜上。印跡膜采用 5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h，采用含兔抗SS18-SSX抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜。第 2 天除去一抗后使用1X 的TBST 溶液清洗 3 次，每次 5 min，加入β-actin（1∶1 000）抗鼠二抗，室溫孵育 1 h，TBST 洗膜 3 次，每次 5 min，采用超敏 ECL 化學發光底物曝光并上機檢測。

2 結果

2.1 成功構建敲入SS18-SSX1的CRISPR/Cas9慢病毒載體

使用在線工具（http：//crispor.tefor.net/）靶向人源SS18基因的第10內含子和SSX1基因的第5內含子，按特異性分數從高到低各選擇10條sgRNA。

結合https：//cctop.cos.uni-heidelberg.de：8043/index.htm網站預測10條sgRNA的脫靶效率，從中分別選擇脫靶可能性低的前三名sgRNA。3條SS18-sgRNA、SSX1-sgRNA分別與Cas9蛋白電轉入HEK293T細胞，提取相應的RNA進行Sanger測序并使用https：//tide.nki.nl/網站分析sgRNA的剪切效率，剪切效率的范圍為19.9%～68.4%（圖1A，表2）。選取SS18基因中剪切效率最高的SS18-gRNA3（剪切效率68.4%），SSX1基因中剪切效率最高的SSX1-gRNA3（剪切效率38.1%）進行后續CRISPR質粒的構建（圖1B）。通過優化載體設計，我們構建了LV-SS18- sgRNA -SSX1-sgRNA-Cas9-EGFP一體化質粒。后進行質粒雙酶切實驗，通過凝膠電泳可觀察到內切酶處理后的質粒片段大小正確，接著對電泳條帶進行測序驗證，測序結果合格，這證明CRISPR/Cas9慢病毒質粒構建成功（圖1C，圖1D）。

2.2 基于CRISPR/Cas9技術的SS18-SSX1+-HEK293T多克隆細胞系的構建與驗證

將構建好的LV-U6gt;{hSS18-gRNA}-U6gt;{hSSX1-gRNA}-CMVgt;hCas9/P2A/EGFP一體化慢病毒質粒轉染HEK293T細胞，轉染成功的細胞會表達EGFP綠色熒光。在熒光顯微鏡下觀測，發現EGFP熒光陽性細胞所占比例較小即轉染效率較低。繼續進行熒光流式分選實驗，分選出EGFP熒光陽性的細胞，即成功轉入CRISPR慢病毒質粒的細胞。熒光顯微鏡下觀察流式分選實驗后的HEK293T細胞，熒光細胞比例≥95%，認為轉染成功（圖2A）。PCR結果顯示，實驗組多克隆HEK293T細胞中檢測到98bp的目的基因條帶（圖2B），且RT-PCR擴增產物的Sanger測序結果與融合基因SS18-SSX1序列對比顯示一致，因此證實了多克隆HEK293T細胞中產生了與預期符合的SS18-SSX1融合基因（圖2C）。

2.3 基于CRISPR/Cas9技術的SS18-SSX1+-HEK293T單克隆細胞系的構建與驗證

在驗證有SS18-SSX1生成的多克隆細胞系的基礎上進一步篩選單個HEK293T細胞到96孔板中培養，待單個細胞長滿96孔板的一個孔后轉移到48孔板，繼續按照24孔板、六孔板、培養瓶進行擴大培養建系。共篩選3批五塊96孔板，共計數單細胞 178個。對178個單克隆細胞孔內培養擴大的單克隆細胞系提取RNA，分批進行RT-PCR篩選，最終篩選出1株SS18-SSX1融合基因陽性的單克隆細胞系，凝膠電泳條帶送上海生工進行Sanger測序，條帶測序序列與SS18-SSX1目的序列一致，證明SS18-SSX1融合基因陽性的單克隆細胞系篩選成功（圖3A，圖3B）。

Western blot結果顯示，SS18-SSX1+-HEK293T細胞有約75 kDa 的 SS18-SSX1型蛋白表達，HEK293T細胞呈陰性表達。結果與預期相符，從蛋白水平上證明了成功構建SS18-SSX1陽性單克隆細胞系（圖3C）。

3 討論

為了深入研究融合基因相關腫瘤的發病機理，近年來多種基因編輯技術得到應用。其中CRISPR/Cas9技術作為一種新型基因編輯技術，相對于傳統的基因編輯技術具有設計簡單、操作容易、節省時間等優點，現在逐漸應用于構建精確的染色體易位的體內/外模型^［15-18］。

我們查閱文獻，發現基于CRISPR/Cas9技術構建的融合基因細胞模型多見于上皮源性腫瘤和血液腫瘤，構建軟組織肉瘤的模型較少且多集中于尤文肉瘤EWSR1-FLI1模型的構建^［19-23］，國內外更是未見有利用CRISPR/Cas9技術構建滑膜肉瘤SS18-SSX1融合基因陽性細胞模型的相關報導，所以我們決定進行相關技術的探索，為后續滑膜肉瘤融合基因模型的構建提供一些思路。

在sgRNA設計方面，Torres等人^［19］構建了基于CRISPR/Cas9技術的尤文肉瘤模型，靶向EWSR1基因的內含子7和FLI1基因的內含子4共設計了4條sgRNA，最終剪切效率為2.9%～9.3%。我們結合文獻定位了SS18和SSX1基因的斷裂位點，優化sgRNA篩選，靶向SS18的第10內含子和SSX1的第5內含子各設計了3條sgRNA。Sanger測序檢測sgRNA的剪切效率，3條SS18-sgRNA的剪切效率為24.3%、36.7%、68.4%，3條SSX1-sgRNA的剪切效率為19.9%、30.2%、38.1%，最終選擇了其中剪切效率最高的SS18-gRNA3（剪切效率68.4%）和SSX1-gRNA3（剪切效率38.1%）來構建后續載體。

在載體設計方面，Peng等人^［24］構建的基于CRISPR/Cas9技術的非小細胞肺癌EML4-ALK模型時，使用的是CRISPR雙質粒方法誘導染色體易位，即分別構建EML4-sgRNA-Cas9質粒和ALK-sgRNA-Cas9質粒，并同時轉染目的細胞。我們結合文獻和對CRISPR/Cas9技術的學習，了解到多合一的Cas9表達質粒比CRISPR雙質粒的基因編輯效率更高^［21］。所有優化了載體設計，構建了SS18-sgRNA、SSX1-sgRNA、cas9核酸酶一體并攜帶綠色熒光標簽EGFP的慢病毒載體。但不足之處是由于慢病毒載體序列的限制，篩選標簽上只能在熒光標簽和藥篩標簽中選擇，最終我們選擇構建了攜帶EGFP的CRISPR/Cas9慢病毒質粒。

在靶細胞的選擇上，構建的非小細胞肺癌CD74-ROS1細胞模型^［25］、尤文肉瘤EWSR1-FLI1細胞模型^［26］、白血病MLL-AF9細胞模型^［27］等都選擇了易于轉染的人胚胎腎HEK293T細胞。考慮到最終構建的LV-U6gt;{hSS18-gRNA}-U6gt;{hSSX1-gRNA}-CMVgt;hCas9/P2A/EGFP慢病毒載體序列較長會降低轉染效率，我們也最終選擇了相對容易轉染的人胚胎腎HEK293T細胞作為靶細胞。

綜上，本研究成功構建了基于CRISPR/Cas9技術的滑膜肉瘤SS18-SSX1融合基因陽性HEK293T細胞模型，并在sgRNA的設計和載體構建上進行了優化。利用CRISPR/Cas9技術的可靠性和精確性，為我們更深入的研究滑膜肉瘤SS18-SSX1融合基因產生的R-loops影響DNA損傷相關機制提供了SS18-SSX1融合基因陽性細胞模型，也為其它獲得細胞模型較困難的染色體易位相關腫瘤的研究提供了思路。

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（責任編輯：編輯唐慧）

基金項目：國家自然科學基金項目（82173057，82002846）

作者簡介：田嬌（1997—） ，女，碩士研究生，專業方向為軟組織腫瘤病理。

*通信作者： 李鋒（1963—） ，男，教授，博士生導師，從事軟組織腫瘤病理分子診斷研究，e-mail： lifeng7855@126.com。