補中益氣加味方對結直腸癌移植瘤模型Vimentin、E-cadherin表達的研究

摘要：目的 結合課題組前期臨床觀察實踐以及網絡藥理學分析結果，探討補中益氣加味方對結直腸癌裸鼠移植瘤組織Vimentin、E-cadherin表達的研究。方法 于30只裸鼠右腿內側皮下接種人結腸癌細胞 SW480 構建結直腸癌移植瘤模型，隨機分為5組，模型對照組（生理鹽水）、補中益氣加味方低、中、高濃度組（26.72、53.43、106.86 g·kg-1），4組均每天灌胃給藥，連續14 d，化療組（腹腔注射氟尿嘧啶 25mg·kg-1）隔天給藥1次，連續14 d后處死裸鼠，免疫組化法檢測腫瘤組織中Vimentin、E-cadherin蛋白的表達情況。結果 模型對照組、低濃度干預組 Vimentin高表達，氟尿嘧啶干預組、中濃度和高濃度藥物干預組 Vimentin 表達下調（Plt;0.05）；模型對照組、低濃度干預組 E-cadherin低表達，氟尿嘧啶干預組、中濃度和高濃度藥物干預組 E-cadherin表達上調（Plt;0.05）。結論 補中益氣加味方可通過下調EMT標志物Vimentin的表達，上調E-cadherin有效抑制腫瘤細胞侵襲轉移。

關鍵詞：補中益氣加味方；結直腸癌；E-cadherin；Vimentin

中圖分類號：735.3+4"" 文獻標志碼：A"" 文章編號：1007-2349（2025）01-0073-05

Study on the Effects of Modified Buzhong Yiqi Decoction on Vimentin andE-cadherin Expression in a Colorectal Cancer Xenograft Model

【Abstract】Objective： To study the effects of modified Buzhong Yiqi Decoction on the expression of Vimentin and E-cadherin in a colorectal cancer xenograft model in nude mice based on previous clinical observations and network pharmacology analysis. Methods： A total of 30 nude mice were inoculated subcutaneously with human colon cancer cells （SW480） on the inner right thigh to establish a colorectal cancer xenograft model. The mice were randomly divided into five groups： the model control group （normal saline）， low-， medium-， and high-dose groups of modified Buzhong Yiqi Decoction （26.72， 53.43， 106.86 g·kg-1） and a chemotherapy group （intraperitoneal injection of fluorouracil at 25 mg·kg-1 every other day）. The four decoction groups received daily intragastric administration for 14 days. After 14 days， the mice were sacrificed and the tumor tissues were analyzed by using immunohistochemistry to detect Vimentin and E-cadherin protein expression. Results： Vimentin expression was high in the model control group and the low-dose intervention group but was significantly downregulated in the fluorouracil group and the medium- and high-dose decoction groups （Plt;0.05）. Conversely， E-cadherin expression was low in the model control group and the low-dose intervention group but significantly upregulated in the fluorouracil group and the medium- and high-dose decoction groups （Plt;0.05）. Conclusion： Modified Buzhong Yiqi Decoction can effectively inhibit tumor cell invasion and metastasis by downregulating the expression of the EMT marker Vimentin and upregulating E-cadherin.

【Key words】Modified Buzhong Yiqi Decoction; Colorectal Cancer; E-cadherin; Vimentin

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）作為常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率呈現逐年上升的趨勢，嚴重威脅我國居民的生命安全。根據世界癌癥中心數據顯示，近3年來，結直腸癌發病率已位居全球癌癥新發病例第三名，罹患結直腸癌患者死亡人數占世界癌癥死亡人數的9.4%，位列第二［1］。該病發生發展隱蔽，晚期患者及綜合治療后復發轉移是導致死亡的主要原因［2］。

結直腸癌常被廣大學者認為屬于中醫積聚范疇，其病理表現及疾病轉歸多呈現為“毒、痰、瘀、虛”。本病在中醫角度本就復雜難以一言概之，因其實質多為毒、痰、淤物積聚所致，故多為實證。然患病日久，再加金戈所傷，化療攻伐太過，機體脾胃受損，久之本虛標實，虛實夾雜。清末著名醫家沈金鰲在其所著的《雜病源流犀燭》中曾提出：癥積之治“扶正當以補中益氣湯為本”。中醫藥治則重治病求本，標本兼治，扶正祛邪，健脾補腎。

上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腫瘤發生和轉移中起關鍵作用。其具體轉化步驟為細胞失去上皮特征并獲得間充質特性，細胞間緊密連接丟失、細胞極性和骨架改變，從而獲得向遠處轉移的運動能力［3］。Vimentin和E-cadherin蛋白作為上皮-間質轉化的標志蛋白，在EMT發生發展的過程中扮演著重要角色。在EMT發展過程中主要表現為E-cadherin 表達減弱，N-cadherin、vinmentin 等間充質黏附蛋白表達增強［4-5］。有研究表明E-cadherin可以增強細胞粘附力，高表達時可以抑制腫瘤細胞浸潤轉移，是公認的抑癌因子，其表達缺失是EMT的發生標志［6］。

根據網絡藥理學結合分子對接技術，課題組發現補中益氣加味方能夠直接調控癌基因、抑癌基因、細胞凋亡、蛋白及信號通路等相關靶點。結合前期臨床基礎及網藥理學分析結果，本次實驗通過免疫組化法檢測結直腸癌裸鼠移植瘤組織中波形蛋白（Vimentin）、E鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達情況，探討補中益氣加味方對結直腸癌裸鼠移植瘤組織中上述指標的調控，完善了中藥復方通過多靶點治療結直腸癌的理論依據，并為結直腸癌患者提供有效治療方法。

1 材料與方法

1.1 細胞 人結腸癌細胞株 SW480，購買于中國科學院上海細胞庫。

1.2 實驗動物 SPF 級裸鼠 30 只，雌雄各半，體重（20±2）g。購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物實驗符合湖南省中醫藥研究院實驗動物倫理委員會規定。在（20～25）℃、40%～60%的相對濕度下飼養，自由進食、飲水。

1.3 主要儀器 石蠟包埋機（YB-8LF）、輪轉式切片機（RM2245）、生物組織攤烤片機（YT-7F）、自動組織脫水機（HP300）、顯微鏡（奧林巴斯 BX53）、細胞培養基（DMEM）。

1.4 藥品與試劑 補中益氣方加味方由黃芪 30 g，白術15 g，太子參30 g，當歸15 g，升麻10 g，陳皮10 g，柴胡10 g，炙甘草8 g，白芍20 g，黃芩15 g，黃連10 g，白花蛇舌草30 g，厚樸15 g，薏苡仁30 g，莪術12 g 組成，均購自湖南中醫藥大學第二附屬醫院中藥房，批號及質量標準符合 2020 年版《中華人民共和國藥典》相關要求。按人與裸鼠體表面積換算，中藥中濃度組給藥等效量為臨床等效計量：53.43 g·kg-1，高濃度組給藥為雙倍臨床等效劑量：106.86 g·kg-1，低濃度組給藥為臨床等效劑量的一半：26.715 g·kg-1。取上述方劑所需藥材，常規煎煮，濃縮為高濃度 106.86 g·kg-1，再分別稀釋為 53.43 g·kg-1、26.715 g·kg-1。氟尿嘧啶注射液（上海旭東海普藥業有限公司生產，規格：10mL，0.25 g×1 支）。Vimentin 抗體（00110734）、E-cadherin 抗體（00113481）均購買于武漢三鷹生物技術有限公司。

1.5 分組、造模、給藥及取材 30 只裸鼠適應環境一周后進行腫瘤模型的建立。于右腿內側皮下注射人結直腸癌細胞株（SW480）0.2mL（含細胞 1×106 個）。當裸鼠皮下移植瘤體積達 0.5 mm3時，表明造模成功。造模成功后隨機分成 5 組。模型對照組灌胃 0.9%氯化鈉溶液0.4mL/d，補中益氣加味方低、中、高濃度組分別灌胃中藥 26.715 g·kg-1、53.43 g·kg-1、106.86 g·kg-1，4組均每天給藥1次，連續 14d。化療組腹腔注射氟尿嘧啶注射液（臨床等效量 25mg·kg-1），隔天給藥1次，連續 14d。第15 d處死裸鼠，剝離瘤體，稱重、測量后將其剪成兩塊，一塊常規石蠟包埋，一塊置于-80℃冰箱凍存備用。

1.6 觀察指標及方法 石蠟包埋組織，組織切片脫蠟水化，用檸檬酸緩沖液（p H6.0）高溫高壓修復切片抗原，洗滌后于 3%H2O2溶液避光孵育20min，PBS 洗滌3次，再用 5%BSA封閉30min，滴加Vimentin、E-cadherin[HJ2.2mm]等-抗（1∶[KG-*2/3]100 體積比稀釋），置入 4℃冰箱過夜，室溫復溫后加二抗（1∶[KG-*2/3]500體積比稀釋）室溫放置 30min、PBS 沖洗3次；DAB顯色、蘇木精復染；脫水、透明、封片。400倍光鏡下觀察并收集圖像，并病理科醫師進行閱片。細胞漿內呈現黃色或棕褐色顆粒則為Vimentin、E-cadherin顯示胞質及胞膜陽性。免疫組化評分=細胞染色強度評分*陽性細胞百分比評分。細胞染色強度評分：無陽性著色計0分，淡黃色計1分，淺褐色計2分，棕褐色記3分；陽性細胞占比≤5%為陰性（-）計0分，5%lt;陽性細胞≤25%為弱陽性（+）計1分，25%lt;陽性細胞≤50%為陽性（++）計2分，陽性細胞gt;50%為強陽性（+++）計3分。

1.7 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件進行數據處理。計量資料如數據服從正態分布、各組間方差齊性時，采用單因素方差分析，如不符合，采用 Kruskal-Wallis H 檢驗。

2 結果

2.1 中藥復方與結直腸癌靶點Venn圖及PPI網絡圖 利用網絡藥理學結合分子對接技術，課題組發現通過TCMSP數據庫檢索，篩選去重后得到補中益氣加味方能夠直接作用調控靶點共251個。通過GeneCards數據庫獲得疾病靶點共11271個。通過TBtools軟件獲得藥物—疾病交集靶點共218個。將交集靶點導入STRING平臺，構建PPI網絡，運用Cytoscape軟件對其進行拓撲分析及可視化處理。詳見圖1、圖 2。（注：FFY代表復方藥，CC代表結直腸癌）

2.2 各組結直腸癌移植瘤腫瘤組織Vimentin 表達的調控情況 免疫組化檢測發現：模型對照組、低濃度干預組Vimentin 均為高表達，氟尿嘧啶干預組、中濃度和高濃度藥物干預組Vimentin呈現低表達。組間對比：低濃度組與模型對照組比較，組間表達無明顯"""差異（Pgt;0.05）。與模型對照組比較，氟尿嘧啶干預組、中濃度和高濃度藥物干預組Vimentin表達下調（Plt;0.05），見表1。

2.3 各組結直腸癌移植瘤腫瘤組織E-cadherin表達的調控情況 免疫組化檢測發現：模型對照組、低濃度干預組E-cadherin均為低表達，氟尿嘧啶干預組、中濃度和高濃度藥物干預組E-cadherin高表達。各組間比較：低濃度干預組與模型對照組相比，表達無明顯差異（Pgt;0.05），與模型對照組比較，氟尿嘧啶干預組、中濃度和高濃度藥物干預組E-cadherin表達上調（Plt;0.05）。

3 討論

結直腸癌位于胃癌和食道癌后的第三大消化道惡性腫瘤，是一種腸上皮來源的惡性腫瘤［7］。很大一部分患者在確診為結直腸癌時已是中晚期，目前針對于CRC患者，國內外均多采用手術根治結合術前術后聯合化療治療原則。雖當下手術及化療體系已較為全面、系統、完善，但患者生存率、生活質量以及遠期療效仍未達到我們所追求的目標及要求。中醫藥是中華民族的瑰寶，隨著國家振興中醫藥戰略的實施，中藥抗腫瘤得到普遍關注及重視。

本研究補中益氣加味方由黃芪、白術、太子參、莪術、白花蛇舌草、當歸、白芍、黃芩、薏苡仁、柴胡、升麻、陳皮、厚樸、黃連、甘草組成。君藥黃芪入脾、肺經，補中氣固衛氣，提高機體免疫力；臣藥太子參益氣健脾，佐以白術補氣健脾，助脾運化，滋養氣血生化之源；素體本虛，祛邪當先扶正，正不足則邪難除，易成正虛邪戀之勢。上述三藥合用補益后天之本，匡扶正氣；白花蛇舌草合莪術重清熱解毒、消癥散結；黃芩、薏苡仁清熱燥濕健脾、解毒散結滲濕；久積之處，多伏蘊熱，故佐以少量黃連清之；陳皮理氣健脾，厚樸行氣燥濕，二者調暢氣機，加升麻、柴胡引補脾胃之藥上行，升舉下陷之氣機；另妙用當歸補血活血，白芍斂陰養血，使氣有所附，亦防它藥耗傷破血太過；甘草補脾和中，調和諸藥。參、術、芪與莪術配伍，不但扶正以祛邪，亦如醫家張錫純所云：“大可開胃進食，而少有開破之弊”。該方中部分藥物通過研究證實具有抗腸癌作用，如：黃芪-莪術藥對［4］、白花蛇舌草［8］、薏苡仁［9-10］、黃芩［11-12］等。其中黃芪-莪術藥對能補氣健脾利水，行氣散瘀消癥，亦能一定程度上防止莪術破血太過，致氣隨血脫之癥。本方主補益氣血，加減組方使氣血相互為用、互生互利，力求扶正。次重清熱解毒燥濕、行氣消癥散結以祛邪。真正意義上做到治病求本，標本兼治，扶正祛邪。

上皮間質轉化是一種生物學過程，亦是腫瘤侵襲轉移發展的重要途徑之一。E-cadherin的缺失、Vimentin表達升高都能提示EMT的發生。E-cadherin是EMT過程中最具特征性的分子標記，其表達缺失被認為是發生EMT的標志［13］。諸多研究表明，Vimentin低表達多在中-高分化腺癌中呈現，而腫瘤組織中Vimentin高表達常常提示組織分化較差［14］。另外E-cadherin低表達或者缺失與結直腸癌臨床病理分期，組織分化程度有著密切關系，呈現負相關［15］。本次研究發現中濃度、高濃度補中益氣加味方和氟尿嘧啶干預組均能有效抑制腫瘤細胞侵襲轉移。其中中高濃度補中益氣加味方藥物干預組能促使裸鼠移植瘤中E-cadherin表達上調，與此同時下調Vimentin表達。兩者相輔相成能有效抑制EMT的發生發展，最終達到抑制腫瘤侵襲發展的目的。

綜上所述，結合實驗分析，得知補中益氣加味方用于結直腸癌患者，能有效抑制腫瘤細胞的轉移侵襲，充分發揮中藥復方抗腫瘤作用。通過調控E-cadherin及Vimentin表達，抑制EMT發生。然其具體作用途徑及相關作用機制尚未明確，待進一步研究探索。

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