番茄根際生防菌的分離鑒定及對鐮刀菌根腐病的生防潛力評價

關鍵詞：番茄；貝萊斯芽孢桿菌：鐮刀菌根腐病；拮抗菌；生防效果

中圖分類號：S436.412.1 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025）02-0141-09

番茄（Solannm lycopersicum）為茄科一年或多年生蔬菜，原產于南美洲，現已在全球廣泛種植，是世界第二大消費蔬菜。為保證番茄的四季供應，設施栽培已成為番茄生產的主要途徑，然而設施番茄復種指數高，易產生連作障礙，從而導致土傳病害發生。根腐病（FCRR）是由鐮刀菌（Fusarum spp.）感染導致的典型土傳病害，已成為全球性的植物病害，目前在美國、阿爾及利亞、日本、韓國等30多個國家均有報道。番茄FCRR可導致番茄根系和莖基部變褐腐爛、根系活力不足、養分吸收和運輸受限、成熟葉變黃、幼葉枯萎，植株在生長中后期時猝倒，使番茄品質降低、產量銳減。在番茄設施栽培中，FCRR的發病率達20%以上，由于集中式管理，一旦感染，病株會呈暴發式增加，且FCRR可降低番茄植株的防御能力，從而使得植株多病害復合發生。目前根腐病的發生防治已成為制約番茄生產的重要瓶頸之一。

當前針對根腐病等土傳病害的防治策略主要為抗性品種培育、化學藥劑殺菌及生物技術防治等。抗性品種的培育需要分子生物學和基因技術介導，多以轉基因技術為主，試驗初期對環境的要求苛刻、耗資較大，需要漫長的測試過程才能轉化，且研究表明相關轉基因品種會產生毒性物質，因此在食用作物中的應用較少。化學藥劑防治是目前控制土傳病害的常用方法，然而長期使用化學農藥導致病原體產生抗藥性，使得農藥殺菌功效銳減，且農藥殘留時間長，不易降解，從而對生態環境和人類健康造成嚴重威脅。生物防治技術具有污染程度低、疾病防治過程中殘留少、對環境無風險、目標病原菌無抗藥性等優勢，已逐漸被廣泛應用于根腐病等土傳病害的防治，為農業可持續化發展提供了新策略。

微生物菌株的分離、篩選及防治效果是決定其能否從實驗室走向田間的重要前提。田鳳鳴等篩選到可產分泌蛋白酶、纖維素酶及嗜鐵素的生防枯草芽孢桿菌W-5，可有效抑制花椒腐皮鐮刀菌菌絲的生長。魯海菊等從枇杷根系篩選得到3株木霉菌（P3.1、P3.5、P3.6），均可誘導枇杷幼苗合成茉莉酸和水楊酸，其中P3.5分離株可導致尖孢鐮刀菌菌絲扭曲變形、溶解。楊東亞等從黃瓜根際土壤中分離到3株解淀粉芽孢桿菌（XY-1、XY-13、XY-53），菌株分泌的揮發性化合物可抑制病原菌菌絲生長與產孢，對黃瓜苗期茄病鐮刀菌的盆栽防效達65.12%以上。目前關于微生物資源開發已有較多報道，但主要集中在生防機制和發酵技術方面，對菌劑實際運用的研究較少。本研究從大棚番茄根腐病發病區的健康番茄植株根際土壤中篩選得到一株拮抗菌MS06，對該菌株的形態學、生理生化特性及拮抗機理進行探索，并采用盆栽試驗和田間試驗分析其生防潛力，以期為番茄生產的生防資源開發及根腐病的生物防治提供理論依據。

1材料與方法

1.1供試材料

供試番茄品種為川科8號。供試番茄鐮刀菌根腐病病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）分離自四川省眉山市大棚番茄根腐病發生區，菌株發酵液由四川飄綠植物保護有限公司提供。

供試土壤樣本：拮抗菌根際土壤于2021年8月采集自眉山市大棚番茄根腐病發生區的健康植株根際，使用消毒的鏟子和剪刀收集5～10cm深緊貼側根的約100g土壤樣品，以同樣方法收集病株根系包裹土壤用于后續盆栽基質用土。

供試化學農藥：甲基硫菌靈、根腐靈、代森錳鋅，均為粉狀，購自四川美豐農資化工有限責任公司；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌肥、哈茨木霉真菌（Trichoderma harziannm）菌肥均為粉狀，有效活菌總數均大于1.0×10⁹cfu/g，購自山東碧藍生物科技有限公司。

1.2拮抗菌株分離、篩選

稱取5.00g健康番茄根際土壤至100mL錐形瓶中，加入50 mL無菌水稀釋，于30℃恒溫搖床中以180r/min往復振蕩2h，振蕩結束靜置15min，取1mL上清液采用梯度稀釋法將200μL等分試樣涂在營養瓊脂（NA）培養基上，采用平板劃線，直到獲得純化的單菌落，并命名，儲存于-20℃的甘油液中。以尖孢鐮刀菌為靶標菌，采用平板對峙法篩選不同純化分離株的拮抗性能，于28℃恒溫培養箱中培養7d，測定抑菌直徑，計算抑菌率。

1.3分離菌株生防和促生功能評估

采用水解圈（D）與菌落直徑（d）的比值（D/d）衡量菌株活性的高低。吲哚乙酸（IAA）分泌、固氮、溶有機磷、解鉀能力及產鐵載體能力分別采用Salkowski試劑比色法、阿須貝氏培養基法、蒙金娜有機磷培養基法、亞歷山大羅夫培養基法及鉻天青培養基法測定。降解纖維素和蛋白能力分別采用剛果紅纖維素培養基法和大豆酪蛋白瓊脂培養基法測定。

1.4最佳拮抗菌株鑒定

1.4.1形態生理分析 將對尖孢鐮刀菌抑菌效果最佳的菌株（MS06）發酵液均勻涂布于瓊脂培養基上，于28℃培養2d，觀察菌落的形態，挑取少量菌落制成臨時玻片，于體視顯微鏡（DM5000，德國徠卡公司）下觀察菌株外觀形態、大小等特征，參照《伯杰細菌鑒定手冊》（第二版）對菌株進行初步鑒定。菌株細胞與尖孢鐮刀菌菌絲形態皆采用掃描電鏡觀察，電鏡鍍金玻片的制備參照Chen等的方法。

1.4.2分子生物學鑒定 16SrRNA分子鑒定采用DNA試劑盒（OMEGA）提取菌株基因組DNA，采用細菌通用引物序列進行PCR擴增，其中上游引物為27F：5'-AGACTTTGATCCTGGCTCAG-3'下游引物為1492R：5’- GGTTACCTTGTTACGAC -TT-3'。PCR體系、擴增條件及熱循環程序參考陳海念等所述，MS06菌株的16SrRNA序列與模式菌株數據庫進行比對，基于MEGA 7.0系統采用鄰接法構建系統發育樹。分子鑒定工作由四川飄綠植物保護有限公司完成。

1.5菌株特性分析

1.5.1代謝產物測定 菌株發酵液采用NB固體培養基上劃線一搖瓶培養法獲得。通過差速離心法獲取MS06菌株發酵液的發酵上清液（CC）和菌體細胞粗提取物（T3）。CC的獲取采用菌株發酵液在4℃環境下高速（9000r/min）離心5min，取上清液采用有機濾膜過濾，濾液即為CC。CC獲取完畢后，將未通過有機濾膜的細碎物質與首次離心的沉淀物混合，在4℃條件下超高速（15000r/min）離心10min，棄上清，底部沉淀加入5mL濃度為50mmol/L的磷酸氫二鉀混合緩沖液（pH=7.5），采用頻率為30Hz的超聲破碎，即可得到T3。纖維素酶、幾丁質酶含量檢測采用北京索萊寶生物科技有限公司生產的試劑盒進行測定，試劑盒型號分別為BC2540、BC0820。

1.5.2對尖孢鐮刀菌的抑制能力評價 使用牛津杯法評估MS06拮抗尖孢鐮刀菌的能力。將牛津杯置于固體營養瓊脂（NA）平板（含有1.5%瓊脂的營養肉湯）中。將在海藻糖-甘露醇（TM）或營養肉湯（NB）液體培養基中生長的20μL尖孢鐮刀菌細胞培養物（OD600=2）鋪在準備好的NA平板上，并留有4個直徑為5mm的孔。最后，將在NB培養基中生長的100μL不同稀釋倍數（10×、100×、500×、1000×）的MS06菌株發酵液（OD₆₀₀=2）、100μL NA培養基（陰性對照）添加到每個培養基預留孔中。將培養基在30℃的培養箱中培養72h，拮抗活性由抑制區的大小判斷。

1.6最佳拮抗菌對番茄根腐病的防治效果測定

1.6.1盆栽試驗 盆栽試驗于2023年5—7月于內江職業技術學院現代農業學院的大棚中進行。用育苗盤將番茄培養至五葉期。設置6個處理：甲基硫菌靈、根腐靈、代森錳鋅、枯草芽孢桿菌菌肥、哈茨木霉真菌菌肥以及MS06菌劑處理，以不施用化學農藥和不施生物菌劑為對照（CK），各處理重復10次。

將番茄幼苗移栽至裝有3 kg滅菌土壤的塑料盆中，該土壤為發病植株根際土壤，其理化性質：pH 6.15，堿解氮、有效磷及速效鉀含量分別為54.37、9.76、96.65mg/kg。相關化學農藥及生物菌劑皆采用灌根方式在幼苗階段共90 mL分3次等量施入，首次施入在緩苗期（移栽后7d），后兩次均間隔7d。甲基硫菌靈、根腐靈、代森錳鋅處理皆為600倍稀釋液，枯草芽孢桿菌菌肥、哈茨木霉真菌菌肥為500倍稀釋液，MS06菌劑為菌株發酵液（2.0×10⁸cfu/mL）。施用菌劑、農藥7d后用尖孢鐮刀菌發酵液（5.0×10⁷cfu/mL）30mL灌根，接種尖孢鐮刀菌發酵液14 d后開始記錄發病情況。

1.6.2田間試驗 試驗于2023年5—7月于眉山市發生根腐病的番茄種植區進行，該種植區根腐病發病率為20%～30%，已連續兩年發病。田間相關處理同盆栽試驗，每處理重復3次，共21個小區，每小區20m²。番茄緩苗后按照盆栽試驗中農藥或菌劑的10倍體積用量每隔10d灌根施用，共3次，灌根結束后開始記錄發病情況。

1.7數據處理與分析

采用DPS 14.0軟件中的Duncan，s新復極差法對試驗數據進行顯著性分析，采用Origin 10.0軟件制圖。抑菌效果及相關病情指數計算如下：

抑菌率（%）=（對照組菌落直徑-接菌組菌落直徑）／（對照組菌落直徑一菌餅直徑）×100；

發病率（%）=（發病株數／調查總株數）×100；

病情指數=∑[（各級病株數×該病級值）／（調查總株數×最高病級值）×100]；

相對防效（%）=（陽性對照病情指數一處理病情指數）／陽性對照病情指數×100。

2結果與分析

2.1番茄鐮刀菌根腐病拮抗菌的初篩

從健康番茄植株根際土壤共獲得93株分離菌，以番茄鐮刀菌根腐病病原菌尖孢鐮刀菌為靶標菌，篩選獲得7株拮抗菌，分別標記為MS04、MS06、MS07、MS31、MS38、MS60、MS77。由圖1可知，菌株MS06的抑菌效果最強，其次為菌株MS31，菌株MS38和MS60拮抗活性較弱：不同拮抗菌的抑菌率表現為MS38

2.2分離菌株促生功能評估

由定性檢測結果（表1）初步判定，7株尖孢鐮刀菌拮抗菌中，菌株MS06同時具有固氮、溶有機磷、產鐵載體、產IAA及降解纖維素和蛋白的能力：菌株MS31具有固氮和降解纖維素的能力：菌株MS77具有溶有機磷、產鐵載體、IAA分泌能力。可見，菌株MS06的養分活化、促生及抑菌等綜合性能優越，可作為后續研究的供試菌株。

2.3拮抗菌株MS06的形態與分子生物學鑒定

2.3.1形態特征 由圖2可知，菌株MS06接種于瓊脂培養基上28℃培養2d后觀察發現，菌落呈乳白色、不透明、圓形或不規則形，邊緣整齊、干燥（圖2A）；革蘭氏染色呈陽性（圖2B）；透射電鏡顯示MS06細胞為短桿狀，兩端鈍圓，并附有細小鞭毛（圖2C）；掃描電子顯微鏡顯示，細胞的外表面不規則、有皺紋，細胞末端呈卵形，很少成鏈，呈單或聚合型短鏈排列，細胞大小約為（1.6～1.8）μm×（0.7～0.8）μm（圖2D）。

2.3.2分子生物學鑒定 對菌株MS06進行16SrRNA測序，獲得序列長度為1 488 bp，識別號為8TCWE8SN017。將其序列與模式菌株數據庫進行BLAST比對，并以成團泛菌（Pantoea agglomer-ans）、單核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）等相似度較低的菌株序列為外群，選取相似度較高的序列進行發育分析，采用鄰接法構建系統發育樹，結果（圖3）顯示，菌株MS06與貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis SQR9在同一分支上，比對相似性高達99.98%，確定菌株MS06為貝萊斯芽孢桿菌。

2.4拮抗菌株MS06的特性分析

2.4.1代謝產物分析 由表2可知，基于發酵液采用差速離心法，在菌株MS06的發酵上清液以及細胞粗提物中均檢測到幾丁質酶和纖維素酶，且兩者在上清液中的含量較高，較細胞粗提物中的含量分別顯著提高24.55、8.23倍。

2.4.2發酵液濃度對尖孢鐮刀菌的抑制效果由圖4可知，在未添加菌株MS06發酵液的培養基中，尖孢鐮刀菌繁殖較迅速，在28℃環境中菌絲由接種中心快速外延，培養72h后占據培養基大部分界面（圖4A）。在接種MS06發酵液條件下，原液下尖孢鐮刀菌菌絲主要在中心位置生長，在4處發酵液位置無外延（圖4B）；發酵液稀釋10倍時與原液無明顯差異（圖4C）：發酵液稀釋100倍條件下，菌絲外延，但發酵液接種處附近無菌絲分布（圖4D）；發酵液稀釋500倍條件下，菌絲從中心位置逐漸外延生長，發酵液接種位置附近存在菌絲分布（圖4E）；發酵液稀釋1000倍條件下，菌絲生長較迅速，分布區域越過發酵液接種位置（圖4F）。

2.4.3拮抗菌MS06發酵上清液對尖孢鐮刀菌菌絲形態的影響 將病原菌尖孢鐮刀菌在NB培養基中培養，掃描電鏡觀察發現，在未接種拮抗菌的對照組中，菌絲形狀充實飽滿、結構均勻有活力（圖SA）；在接種MS06拮抗菌發酵上清液的處理組中，菌絲形態萎縮、表面凹陷干癟，部分菌絲壁潰解（圖5B）。

2.5拮抗菌株MS06對番茄鐮刀菌根腐病的防治效果

由表3可知，在盆栽試驗中，不施用農藥和生物菌劑的對照組（CK）番茄鐮刀菌根腐病發病率為100%，農藥或生物菌劑處理下的發病率為0～85.00%；CK病情指數為89.33，各處理組病情指數為0～79.95;甲基硫菌靈、根腐靈、代森錳鋅、枯草芽孢桿菌菌肥、哈茨木霉真菌菌肥和MS06菌劑處理的相對防效分別為77.01%、10.50%、38.95%、52.01%、21.58%和100%，以MS06發酵液處理的相對防效最高，表明貝萊斯芽孢桿菌MS06對鐮刀菌根腐病具有良好的防治潛力。

田間試驗中，自然發病（CK）情況下，番茄鐮刀菌根腐病發病率最高，為16.65%，農藥或生物菌劑處理下發病率分別為4.58%～13.00%；CK病情指數為9.45，各處理組病情指數1.87～7.00，M06發酵液處理最低；甲基硫菌靈、根腐靈、代森錳鋅、枯草芽孢桿菌菌肥、哈茨木霉真菌菌肥和MS06發酵液處理的相對防效分別為71.75%、25.93%、35.98%、51.22%、32.91%和80.21%，以MS06發酵液的相對防效最佳，為80.21%，其次為甲基硫菌靈處理，為71.25%。

3討論與結論

植物病害是限制農作物生產的最重要因素之一，研究表明，全世界每年約30%的糧食作物遭受植物病害而減產。尖孢鐮刀菌是根腐病的主要致病菌之一，其致病性強，且可與細菌、真菌病原菌以及根結線蟲混合侵染，造成作物減產，嚴重時作物植株枯萎死亡。但不同生態區域、不同作物種類的主要致病菌種類型存在差異。本課題組前期調查發現，眉山市番茄根腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌。本研究從眉山市根腐病發病區的健康番茄株根際土壤篩選得到93株菌株。以尖孢鐮刀菌為靶向病原菌，得到7株拮抗菌（MS04、MS06、MS07、MS31、MS38、MS60、MS77），其中菌株MS06的拮抗活性最高：促生活性檢測顯示，具有固氮效果的有4株（MS04、MS06、MS31、MS60），溶磷功能的2株（MS06、MS77），產鐵載體的2株（MS06、MS77），產吲哚乙酸（IAA）的2株（MS06、MS77），可降解纖維素的2株（MS06、MS31），可降解蛋白的1株（MS06）。菌株MS06同時具有固氮、溶磷、產鐵載體、產IAA、降解纖維素和蛋白的能力，表明該菌株具有促生、養分活化及殺菌潛力。

農田生態系統中，由于作物類型較單一，作物極易受到真菌和細菌疾病的影響，且病原菌在繁殖的同時進化致病力，這給病害防治工作帶來重大挑戰。開發具有抗菌活性的生防菌株對于植物致病性尖孢鐮刀菌的防治具有重要意義，生防菌株分類地位的確定有助于將其更好地應用于生物病害的防治中。本研究結果表明，拮抗菌株MS06外觀形態為短桿狀，細胞附有細小鞭毛，呈單或聚合型短鏈排列，革蘭氏染色為陽性，初步確定屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。16SrRNA序列比對結果表明，菌株MS06與貝萊斯芽孢桿菌Ba-cillus velezensis SQR9的相似性高達99.98%，確定為貝萊斯芽孢桿菌。貝萊斯芽孢桿菌廣泛分布于自然界，是土壤、海洋生態系統中的重要菌群之一，其對病原體的生物防治機制主要包括分泌抗生素、鐵載體、胞外裂解酶和介導生物膜形成等，在作物病害防治方面具有巨大的應用前景和研發價值。

根腐型病原菌尖孢鐮刀菌的細胞壁以幾丁質為主的有機物質為骨架，相關拮抗菌胞外裂解酶的產生能力決定著病原真菌細胞壁溶解、菌絲崩解效果。本研究中篩選得到的貝萊斯芽孢桿菌MS06，其發酵上清液和細胞粗提物中均含有一定量的幾丁質酶和纖維素酶，且在上清液中的相關酶含量較高，推測其通過分泌幾丁質酶和纖維素酶等抗菌物質，溶解致病菌骨架，且破壞細胞滲透壓平衡，從而達到抑菌效果。以尖孢鐮刀菌為靶向菌，采用牛津杯法對不同濃度MS06發酵液抑菌效果的測定表明，稀釋10倍條件下抑菌效果與發酵原液無明顯變化，當稀釋倍數達到500或1000時，抑菌效果明顯降低。掃描電鏡觀察顯示，經菌株MS06處理后，尖孢鐮刀菌菌絲萎縮干癟、活力喪失，部分菌絲壁潰解，表明MS06可能通過產生幾丁質酶、纖維素酶等活性物質破壞菌絲細胞壁結構。

良好的拮抗效果是反映生防菌能否成為潛在菌肥資源的重要前提，而實際的田間效率及功能是評價其最終應用潛力的參考。賈方方等研究表明，液化沙雷氏菌（Serratia liquefa-ciens L210）可溶解尖孢鐮刀菌的菌絲，提高煙葉多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶等防御酶的活性，盆栽、大田試驗中的防病效果分別為100%、77.90%。Tian等從番茄根際鑒定得到一株產紫籃狀菌（Talaromyces purpurogenus Q2），其發酵液菌劑可產生抗生素干擾鐮刀菌菌絲的生長發育，通過分泌蛋白酶和β-1，3-葡聚糖酶抑制細胞壁再生，盆栽、大田試驗中的防病效果分別為63.40%、60.22%。本研究結果顯示，無論是盆栽還是大田試驗，甲基硫菌靈對番茄鐮刀菌根腐病的防治效果皆優于其他農藥及商品生物有機肥，這與前人研究結果基本一致，表明甲基硫菌靈對根腐病病原菌的毒力最強，是防治鐮刀菌型根腐病的優選農藥之一；另外，貝萊斯芽孢桿菌MS06在盆栽試驗中對番茄根腐病的相對防效為100.00%，大田試驗為80.21%，高于之前報道的芽孢桿菌菌株，或可作為開發防治鐮刀型根腐病的潛在生防資源。