裸藻β-1，3-葡聚糖提高斑馬魚及細(xì)胞免疫活性研究

關(guān)鍵詞：纖細(xì)裸藻；β-1，3-葡聚糖；斑馬魚；免疫活性

中圖分類號：TS201.4：Q952 文獻標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2025）02-0158-07

近年來，通過營養(yǎng)干預(yù)來改善身體機能的方法愈發(fā)受到人們重視，在此背景下，免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)類食品的開發(fā)與研究具有廣闊的應(yīng)用前景。β-葡聚糖是一類以D-吡喃型葡萄糖為基本單元，由β-糖苷鍵連接而成的非淀粉多糖，具有廣泛的生物活性。目前，多種來源的β-葡聚糖作為食品原料或食品添加劑已在中國、美國、澳大利亞、日本等多個國家被批準(zhǔn)使用。作為一種天然的免疫調(diào)節(jié)劑，裸藻β-1，3-葡聚糖被認(rèn)為可以促進免疫系統(tǒng)的活性，增強機體的免疫力，并有助于抑制炎癥反應(yīng)，從而對身體健康產(chǎn)生積極影響。

β-葡聚糖廣泛存在于谷物、細(xì)菌、真菌和藻類中。在谷物中，β-葡聚糖主要存在于胚乳和糊粉層細(xì)胞壁中，其中以燕麥和大麥中含量最高，約為1.8%～7.0%。在微生物中，β-葡聚糖主要存在于細(xì)胞壁中，其中在酵母細(xì)胞壁成分中的占比高達(dá)50%～65%。又因為酵母價格低廉，使其成為β-葡聚糖的主要來源。然而，β-葡聚糖具有特殊的三維螺旋結(jié)構(gòu)，常見的純化方法難以除盡細(xì)胞壁中的其他物質(zhì)，如結(jié)構(gòu)性蛋白、脂質(zhì)等，致使其在工業(yè)化生產(chǎn)中具有一定的局限性。許多微藻（如裸藻門、硅藻門、金藻門）可以產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)和溶解性的β-葡聚糖，這些微藻源的β-葡聚糖已經(jīng)成為非常有潛力的生物資源。其中，裸藻沒有細(xì)胞壁，對營養(yǎng)成分的吸收率高達(dá)93%，富含大量的蛋白質(zhì)、多糖、維生素和多不飽和脂肪酸，是一種富含天然β-葡聚糖的新超級食物來源，為我國2013年獲批的8種新食品原料之一。裸藻細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有一種具有沒有分支的線性β-（1，3）主鏈的β-1，3-葡聚糖（又稱裸藻副淀粉），是裸藻用來儲存碳當(dāng)量的主要物質(zhì)。與其他p -葡聚糖相比，裸藻β-1，3-葡聚糖產(chǎn)率極高，通常占細(xì)胞干重的90%以上，并且更容易純化?？梢愿鶕?jù)裸藻β-1，3-葡聚糖不溶于水的特點，將粉碎過的藻細(xì)胞離心，用低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的SDS溶液連續(xù)沖洗去掉蛋白即可實現(xiàn)純化，其提純方法兼具低成本與高產(chǎn)率的優(yōu)勢。

斑馬魚模型已被廣泛用于研究作為抗炎、免疫調(diào)節(jié)劑和抗氧化劑調(diào)節(jié)劑的化合物的體內(nèi)生物活性。在斑馬魚胚胎形成的第1天，先天性免疫系統(tǒng)即可被激活，需要1～4天發(fā)育成熟，適應(yīng)性免疫系統(tǒng)則需要4～6周才會在形態(tài)和功能上發(fā)育完善，與其他模型動物相比，利用斑馬魚模型評估化合物的免疫功效耗時更短。而且，斑馬魚模型維護成本低、需要的目標(biāo)化合物數(shù)量少，更適合高通量篩選。斑馬魚已成功用于評估酵母β-1，3-葡聚糖的生物活性，Rodriguez等在研究腹腔注射β-葡聚糖對實驗感染嗜水氣單胞菌斑馬魚的影響時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度為5mg/mL時可明顯降低因感染嗜水氣單胞菌而導(dǎo)致的死亡率。細(xì)胞快速評價方法是藥物篩選、毒性評價和生物學(xué)研究中常用的重要手段，趙文婷等利用細(xì)胞快速評價方法發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酵母β-1，3-葡聚糖濃度為500μL/mL時，能顯著促進斑馬魚噬細(xì)胞的吞噬功能，作用增強了48%。

本研究旨在通過斑馬魚模型和細(xì)胞模型快速評價方法，系統(tǒng)評估裸藻樣品A（纖細(xì)裸藻β-1，3-葡聚糖）、樣品B（纖細(xì)裸藻粉）和樣品C（商業(yè)纖細(xì)裸藻粉）的免疫功效。以深入了解纖細(xì)裸藻β-1，3-葡聚糖對免疫系統(tǒng)的潛在調(diào)節(jié)作用，為其在食品、藥物等領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。同時，比較不同裸藻粉樣品的效果，有助于篩選出具有較高免疫增強活性的樣品，可為相關(guān)領(lǐng)域的產(chǎn)品開發(fā)和保健品推廣提供有力支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

纖細(xì)裸藻粉（Euglena gracilis）（樣品B）由山東納美達(dá)生物科技有限公司提供；裸藻β-1，3-葡聚糖（樣品A）由纖細(xì)裸藻粉在強堿（pHgt;12）條件下提純獲得；商業(yè)纖細(xì)裸藻粉（樣品C）購自建明（中國）科技有限公司。野生型斑馬魚AB品系、轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系均由山東省科學(xué)院生物研究所斑馬魚藥物篩選平臺提供。

1.2纖細(xì)裸藻β-1，3-葡聚糖的分離提取

采用SDS提取法提取β-1，3-葡聚糖，取50 mL離心管，分別加入2g左右纖細(xì)裸藻粉和30 mL蒸餾水，在渦旋振蕩器上充分振蕩后，3000r/min離心10min，棄上清液，重復(fù)以上步驟3～4次；向沉淀中加入30 mL SDS，在超聲破碎儀（SCIENTZ-ⅡD寧波新芝生物科技股份有限公司）以200 kHz、6號振幅桿、超聲頻率為40%～45%超聲18min，3 000 r/min離心10min，棄上清液；將沉淀于60℃烘干24 h后得到的β-1，3-葡聚糖。

1.3樣品檢測指標(biāo)及方法

1.3.1安全性劑量檢測 選用發(fā)育至24 hpf（受精后24h）的健康野生型斑馬魚AB品系，轉(zhuǎn)移至12孔板，每孔15條。對照組給予斑馬魚養(yǎng)殖水，試驗組給予不同濃度（0、50、100、200、400、800μg/mL）的樣品溶液，置于28.5℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至72hpf。然后在SZX16型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察，并統(tǒng)計斑馬魚死亡率，每處理重復(fù)3次。

1.3.2免疫促進試驗 選用發(fā)育至24hpf的健康轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，對照組（CK）給予斑馬魚養(yǎng)殖水，模型組（Model）給予100μg/mL的長春瑞濱溶液，試驗組給予不同濃度（25、50、100μg/mL）的樣品溶液，脫膜后轉(zhuǎn)移至12孔板，每孔15條。置于28.5℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至48hpf。熒光顯微鏡下觀察，采用DP2-BSW圖像采集系統(tǒng)（日本Olympus公司）拍照，統(tǒng)計斑馬魚尾部熒光細(xì)胞數(shù)目，每處理重復(fù)3次。

1.3.3細(xì)胞增殖試驗 將小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（Raw 264.7細(xì)胞）培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）和雙抗的DMEM培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）中，置于37℃和5% CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d傳代一次。傳代時，無菌條件下在操作臺上將培養(yǎng)瓶中Raw 264.7細(xì)胞除去細(xì)胞培養(yǎng)基，加入3mL新鮮的DMEM培養(yǎng)基后，吹打混勻，將細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞濃度為1×10⁴個/mL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后加入不同濃度（0、50、100、200、400μg/mL）的樣品溶液處理細(xì)胞，每組4個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；然后每孔加入10μL CCK8試劑，培養(yǎng)2h后，在酶標(biāo)儀上檢測450 nm波長下各孔的光密度（optical density，OD），計算細(xì)胞存活率。存活率（%）=OD_試驗／OD_對照×100。

1.3.4抗炎試驗 將Raw 264.7細(xì)胞以每孔1×104的細(xì)胞濃度接種于96孔板中，培養(yǎng)條件同1.3.3。培養(yǎng)24h后進行藥物處理，模型組更換含1μg/mL LPS（脂多糖，Lipopolysaccharides）的培養(yǎng)基，藥物組更換含不同濃度（25、50、100μg/mL）樣品的培養(yǎng)基，陽性對照組（Positive）更換含50μmol/L吲哚美辛（購自北京索萊寶科技有限公司）的培養(yǎng)基。每組4個復(fù)孔。在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中處理24h后，取50μL細(xì)胞培養(yǎng)液于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，先后加入50μL Griess Reagent Ⅰ和50μL Griess ReagentⅡ試劑混勻。使用酶標(biāo)儀在540 nm波長處測量OD值。通過Griess反應(yīng)測定培養(yǎng)液中一氧化氮（NO）含量。NO含量（%）=（OD_試驗-OD_對照）／（OD_模型-OD_對照）×100。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

使用ImageJ軟件統(tǒng)計斑馬魚尾部熒光細(xì)胞數(shù)目。所有數(shù)據(jù)顯示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）和獨立樣本t檢驗（t-test）分析，顯著性水平均設(shè)為Plt;0.05。使用Origin 2022軟件對數(shù)據(jù)進行可視化展示。

2結(jié)果與分析

2.1 β-1，3-葡聚糖安全劑量確定

如圖1所示，不同濃度樣品作用于發(fā)育至24hpf的斑馬魚幼魚48h后，對于樣品A，當(dāng)濃度≤400μg/mL時，斑馬魚存活率均在90%以上，當(dāng)濃度為800μg/mL時，斑馬魚存活率顯著下降，為75%左右；對于樣品B，當(dāng)濃度≤200μg/mL時，在處理后的48h內(nèi)各組斑馬魚發(fā)育正常，而濃度在400μg/mL和800μg/mL時，斑馬魚存活率顯著降至30%以下；對于樣品C，在濃度為400μg/mL和800μg/mL時斑馬魚存活率顯著下降。結(jié)果表明，樣品A對斑馬魚的安全劑量為≤400μg/mL，樣品B和樣品C對斑馬魚的安全劑量均為≤200μg/mL。

2.2不同樣品對斑馬魚免疫性能的影響

不同樣品作用于斑馬魚幼魚48 h后，在熒光顯微鏡下進行觀察、拍照，結(jié)果（圖2）表明，與CK相比，Model組斑馬魚尾部免疫細(xì)胞數(shù)目明顯減少，說明免疫抑制模型構(gòu)建成功；與Model組相比，樣品A、B、C均可以使斑馬魚尾部的免疫細(xì)胞數(shù)目增加。

通過對免疫細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計分析（圖3）發(fā)現(xiàn)，與Model組相比，當(dāng)樣品A濃度為50μg/mL和100μg/mL，樣品B和C濃度為100μg/mL時，斑馬魚尾部免疫細(xì)胞顯著增加，各樣品其他濃度與Model組相比免疫細(xì)胞數(shù)目雖有增加但差異并不顯著。

2.3不同樣品對Raw 264.7細(xì)胞增殖的影響

不同劑量的樣品處理Raw 264.7細(xì)胞24 h后，通過CCK8試劑檢測細(xì)胞活力。結(jié)果（圖4）表明：與CK相比，各樣品在≤200μg/mL濃度下對細(xì)胞的活性均無顯著影響：當(dāng)樣品濃度達(dá)到400μg/mL時，細(xì)胞活力顯著下降。確定樣品A、B和C的安全濃度均為≤200μg/mL。

2.4不同樣品對Raw 264.7細(xì)胞抗炎性的影響

通過用1μg/mL的LPS處理Raw 264.7細(xì)胞建立細(xì)胞炎癥模型（Model），50μmol/L吲哚美辛作為陽性對照（Positive），用不同樣品處理細(xì)胞。結(jié)果（圖5）表明：陽性對照組NO含量顯著下降，驗證了實驗?zāi)Ｐ偷挠行裕粯悠稟在50μg/mL和100μg/mL時，培養(yǎng)液中NO含量明顯下降，而在25μg/mL時沒有明顯變化，表明樣品A可能在一定濃度范圍內(nèi)對抑制炎癥反應(yīng)具有明顯效果；樣品B和樣品C在100μg/mL劑量下，培養(yǎng)液中NO含量顯著下降，表明兩個樣品在高濃度下可能有一定的抗炎作用，而在較低濃度下效果較弱或不明顯。

3討論與結(jié)論

3-1，3-葡聚糖是裸藻的主要活性成分，已有研究表明，β-1，3-葡聚糖具有多種功能，包括調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和降低感染發(fā)生率的作用。本研究中，檢測了樣品A（纖細(xì)裸藻β-1，3-葡聚糖）、樣品B（纖細(xì)裸藻粉）、樣品C（商用纖細(xì)裸藻粉）在安全劑量下的免疫促進作用，并通過不同的模型，比較了纖細(xì)裸藻β-1，3-葡聚糖對細(xì)胞增殖和抗炎性的影響。

在評估免疫調(diào)節(jié)劑的功效時，認(rèn)識到其作用的雙重性質(zhì)至關(guān)重要。纖細(xì)裸藻β-1，3-葡聚糖發(fā)揮最佳的免疫調(diào)節(jié)作用是通過適宜的劑量實現(xiàn)的，劑量過高可能導(dǎo)致免疫抑制或細(xì)胞凋亡。已有研究報道，從釀酒酵母中純化的β-1，3-葡聚糖濃度與龍蝦粒細(xì)胞活力之間存在負(fù)相關(guān)性，劑量閾值為0.005%；β-1，3-葡聚糖對鯉魚前腎白細(xì)胞具有明顯的促凋亡作用，劑量閾值為500mg/mL或更高。本研究中，纖細(xì)裸藻β-1，3-葡聚糖對斑馬魚的安全閾值為400μg/mL，這種安全性的差異可能對葡聚糖在不同領(lǐng)域的應(yīng)用產(chǎn)生重要影響。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，與纖細(xì)裸藻粉相比，纖細(xì)裸藻β-1，3-葡聚糖具有更高的安全性。說明在實際應(yīng)用中，選擇纖細(xì)裸藻β-1，3-葡聚糖可能更為可靠，因為它在維持所需效果的同時，能更大程度上避免對生物體的潛在危害。

β-葡聚糖被認(rèn)為可以激活各種免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、樹突細(xì)胞等，具有免疫調(diào)節(jié)和免疫促進的潛力，對免疫系統(tǒng)有刺激作用。Sonck等發(fā)現(xiàn)裸藻β-1，3-葡聚糖對豬嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中活性氧（ROS）的產(chǎn)生有顯著的活化作用。Russo等研究表明，β-葡聚糖可以作為一種安全有效的天然免疫系統(tǒng)輔助因子，其經(jīng)過聲波化和堿化處理后可使人體炎性因子（NO、TNF-α、IL-6和COX -2）上調(diào)。本研究從纖細(xì)裸藻提取并制備了經(jīng)堿化處理的裸藻β-1，3-葡聚糖，發(fā)現(xiàn)當(dāng)其濃度為50μg/mL和100μg/mL時，斑馬魚尾部免疫細(xì)胞數(shù)量顯著增加。這表明β-1，3-葡聚糖在這兩種濃度下可能對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的刺激作用，具有生物激活免疫反應(yīng)的能力。巨噬細(xì)胞通過釋放多種因素，例如促炎癥細(xì)胞因子、氮氧化物和活性氧簇等，在特異性和非特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中，NO為一種無機自由基氣態(tài)分子，具有廣泛的生理功能，參與機體內(nèi)各種生化調(diào)節(jié)，可能與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。NO作為關(guān)鍵的第二信使，在病原體感染過程中對免疫反應(yīng)有顯著影響，本研究結(jié)果表明，纖細(xì)裸藻β-1，3-葡聚糖以濃度依賴的方式顯著誘導(dǎo)Raw 264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO。

β-葡聚糖的理化性質(zhì)和生物活性可能受到其結(jié)構(gòu)變異性的顯著影響，這取決于其來源。Long等發(fā)現(xiàn)通過γ射線輻照制備的水溶性、低分子量（約25kDa）β-葡聚糖能有效降低小鼠血脂和血糖水平。Chen等發(fā)現(xiàn)在高原裸大麥中提取的β-葡聚糖對實驗嚙齒動物的胃腸道具有保護作用，能減輕乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷并促進腸道健康。Aoe等研究發(fā)現(xiàn)，大麥β-葡聚糖的攝入會減少內(nèi)臟的脂肪。以上研究表明，不同來源的β-葡聚糖可能存在著生物學(xué)上的差異，對其進行細(xì)致研究至關(guān)重要。

綜上，樣品A（纖細(xì)裸藻β-1，3-葡聚糖）對斑馬魚幼魚的安全劑量為≤400μg/mL，樣品B（纖細(xì)裸藻粉）和樣品C（商用纖細(xì)裸藻粉）對斑馬魚幼魚的安全劑量均為≤200μg/mL；50μg/mL和100μg/mL裸藻β-1，3-葡聚糖對斑馬魚免疫細(xì)胞數(shù)量具有明顯的促進作用；100μg/mL樣品B、C對斑馬魚免疫細(xì)胞數(shù)量具有明顯的促進作用。樣品A、B、C對Raw 264.7細(xì)胞的安全劑量均為≤200μg/mL。樣品A在50μg/mL和100μg/mL劑量下，樣品B、C在100μg/mL劑量下，Raw 264.7細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量均明顯降低，說明樣品具有免疫調(diào)節(jié)（抗炎）作用。以上結(jié)果表明樣品A、B、C對斑馬魚和Raw 264.7細(xì)胞均具有免疫促進作用，其中樣品A的免疫促進作用優(yōu)于樣品B和樣品C。