獼猴桃新煙堿類農藥樣品前處理提取工藝的優化

獼猴桃也稱奇異果，屬獼猴桃科獼猴桃屬，是一種落葉藤本果樹，是20世紀野生果樹人工馴化栽培最有成就的果樹之一，在我國栽培范圍較廣。獼猴桃富含維生素C，被稱為水果之王，果實中含有豐富的礦物質元素、維生素、多酚等成分，風味獨特、營養價值高，具有廣泛的觀賞、食用和藥用價值，研究開發潛力巨大。據統計，全世界獼猴桃屬植物共有54個種、21個變種，約75個分類單元，在我國分布的約為52個種，其中44個為中國特有。六盤水紅心獼猴桃較之其他品種質量更優，目前已獲得國家地理標志產品的稱號。新煙堿類農藥是一類高效廣譜的殺蟲劑，這類農藥在農業害蟲防治中發揮著重要作用，具有高效、廣譜、低毒、低殘留等特點。自1991年開發出來后，就迅速成為有機磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類等劇毒類殺蟲劑的替代品，是繼擬除蟲菊酯類殺蟲劑之后的第四代殺蟲劑。截至2021年9月，在我國登記的新煙堿類農藥有12種，分別為哌蟲啶、吡蟲啉、噻蟲嗪、噻蟲啉、氯噻啉、呋蟲胺、啶蟲瞇、噻蟲胺、環氧蟲啶、烯啶蟲胺、氟啶蟲胺腈和氟吡呋喃酮喃。根據對六盤水當地往年獼猴桃農藥殘留監測情況來看，噻蟲嗪、吡蟲啉和啶蟲脒是當地較為常用的新煙堿類農藥，這些農藥會通過飲食、呼吸、接觸的方式進入人體，并對人體造成神經毒性、肝毒性、生殖毒性等危害，目前世界上多個國家及組織已開始對其限制使用。為了更好地保護當地獼猴桃產業，合理有效地監測當地獼猴桃健康態勢，本文優化了新煙堿類農藥樣品前處理的提取工藝，并對其進行了驗證。

1.材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

微孔過濾膜（尼龍）：13 mmX0.2 um；Sep-Pak Vac1氨基固相萃取柱：1g，6mL；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、丙酮（色譜純）、正己烷（色譜純）、甲苯（優級純）、無水硫酸鈉（分析純）、氯化鈉（優級純）、娃哈哈純凈水，噻蟲嗪、吡蟲啉和啶蟲脒標準品。

1.2 儀器設備

HZQ-Q恒溫振蕩器，ME104E/02電子天平，N-1300旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司），AXTG20G離心機（鹽城市安信實驗儀器有限公司），LCMS-8040液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀（日本島津公司）：配有電噴霧離子源，高速均質機。

1.3 樣品前處理

提取：準確稱取20g獼猴桃試樣置于100mL的離心管中，加入一定量的乙腈。之后用高速均質機在一定轉速下，勻漿提取一定時間。然后再加入5g氯化鈉鹽析，提取1min，在4000r/min離心5min。最后在一定溫度下，水浴中旋轉濃縮至約lmL，待凈化。

凈化：在Sep-Pak Vac柱中加入脫水劑，并放入下接雞心瓶的固定架上。用4mL（乙腈：甲苯/4：1）預洗柱后加入上述濃縮液，并更換新雞心瓶接收。再每次用2mL（乙腈：甲苯/4：1）洗滌樣液瓶三次﹐并將洗滌液移入柱中。在柱上加上50mL貯液器，用25mL（乙腈：甲苯/4：1）洗脫農藥及相關化學品，合并于雞心瓶中，并在一定溫度下水浴旋轉濃縮至約0.5mL。將濃縮液置于氮氣吹干儀上吹干并迅速加lmL的乙腈：水/3：2），混勻。經0.2μm濾膜過濾后進行液相色譜-串聯質譜測定。

1.4 測試條件

色譜柱：色譜柱：Atlantis T3，（150 mmx2.1mm，3um.）；柱溫：40℃；進樣量：20μL。流動相的選擇及梯度洗脫條件間表1。

2.結果與分析

2.1 不同條件對獼猴桃加標的回收率的影響

圖1可知三種提取溶劑（丙酮、乙腈、乙酸乙酯）中，乙腈的加樣回收率最高，達到了81.2%，說明乙腈的提取效果優于丙酮和乙酸乙酯。圖2是不同脫水劑對加樣回收率的影響，從圖2可知無水硫酸鈉的脫水效果最高，加樣回收率達到了83.1%。為了考察凈化劑對樣品加樣回收率的影響，本文做了C18、N-丙基乙二胺、石墨化炭黑三種凈化劑對加樣回收率的影響。如圖3所示，在相同條件下，僅改變凈化劑種類，樣品加樣回收率不同，圖中N-丙基乙二胺的加樣回收率最高為91.4%。樣品的提取方式對加樣回收率至關重要。圖4為顯示了四種不同的提取方式（振蕩、高速渦旋、超聲提取、高速均質）對加樣回收率的影響。

2.2 正交試驗分析

以料液比（Ａ）、提取時間（B）、攪拌速率（C）、旋蒸溫度（D）為考察因素，以獼猴桃加標的回收率為考察指標，設計正交試驗。因素水平見表2。

本實驗選取的L9（33）正交表。各實驗因素對加樣回收率的影響如表3所示。根據正交試驗理論，極差越大，該因素越占主導地位。因此，影響獼猴桃加樣回收率的主次因素為：提取時間（B）＞攪拌速率（C）＞旋蒸溫度（D）＞料液比（A），得到最佳試驗條件為：A2B2C2D2，即料液比為1：3，提取時間為4min，攪拌速率為15000r/min，旋蒸溫度為50℃。

為了考察試驗的重復性，按照A2B2C2D2最佳工藝進行試驗，驗證3次，結果見表4。

由表4可知，在最佳實驗條件下所測得的加樣回收率變化幅度不大，重復性較好，平均加樣回收率為84.3%，說明最佳工藝條件改性所得到的樣品加樣回收率最佳。

結論

本研究考察了不同條件對獼猴桃加標的回收率的影響，結果顯示：在樣品前處理過程中，乙腈為最優的提取溶劑，無水硫酸鈉為最優的脫水劑，N-丙基乙二胺為最優的凈化劑，最佳的提取方式為高速均質。此外，采用正交試驗法對獼猴桃樣品前處理的提取步驟進行了工藝優化，確定了最佳提取工藝為料液比為1：3，提取時間為4min，攪拌速率為15000r/min，旋蒸溫度為50℃。

基金項目

六盤水市科技項目（52020-2021-0-3-13；52020-2021-0-3-14）。

*通信作者

袁璦金（1983-），女，本科，高級農藝師；研究方向：食品檢測。