circSLC8A1介導(dǎo)ATF3通路影響癲癇氧化應(yīng)激及鐵活性的機(jī)制

[摘要]"目的"分析circSLC8A1介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3（activating"transcription"factor"3，ATF3）通路影響癲癇細(xì)胞氧化應(yīng)激及鐵活性的機(jī)制。方法"采用無(wú)Mg2+方法構(gòu)建人神經(jīng)元-海馬細(xì)胞癲癇模型，檢測(cè)健康對(duì)照組和模型組細(xì)胞的circSLC8A1、ATF3表達(dá)水平，采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方式建立敲除circSLC8A1組、敲除ATF3組、敲除circSLC8A1+過(guò)表達(dá)ATF3組、敲除ATF3+過(guò)表達(dá)circSLC8A1組，轉(zhuǎn)染6h后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。檢測(cè)并比較不同干預(yù)組的細(xì)胞活力、鐵活性、活性氧（reactive"oxygen"species，ROS）、乳酸脫氫酶（lactate"dehydrogenase，LDH）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）差異。結(jié)果"模型組細(xì)胞的circSLC8A1、ATF3、ROS、LDH表達(dá)水平及鐵活性均顯著高于健康對(duì)照組，細(xì)胞活力和GSH表達(dá)水平均顯著低于健康對(duì)照組（Plt;0.05）；敲除circSLC8A1可顯著降低癲癇模型細(xì)胞circSLC8A1表達(dá)量，敲除ATF3可顯著降低癲癇模型細(xì)胞ATF3表達(dá)量（Plt;0.05）；敲除circSLC8A1或ATF3，可使癲癇模型細(xì)胞的細(xì)胞活力升高，鐵活性降低，氧化應(yīng)激反應(yīng)緩解，敲除circSLC8A1并過(guò)表達(dá)ATF3可逆轉(zhuǎn)上述趨勢(shì)，但敲除ATF3過(guò)表達(dá)circSLC8A1并不會(huì)導(dǎo)致上述現(xiàn)象。結(jié)論"circSLC8A1能夠通過(guò)介導(dǎo)ATF3通路，對(duì)癲癇模型對(duì)細(xì)胞活性、氧化應(yīng)激反應(yīng)及鐵活性進(jìn)程產(chǎn)生一定影響，可為癲癇產(chǎn)生機(jī)制及靶向治療提供借鑒。

[關(guān)鍵詞]"circSLC8A1通路；ATF3通路；癲癇進(jìn)程；氧化應(yīng)激；鐵活性；細(xì)胞活性

[中圖分類號(hào)]"R742.1""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2025.07.001

circSLC8A1"mediates"the"mechanism"of"ATF3"pathway"on"oxidative"stress"and"iron"activity"in"epilepsy

CHAI"Wen，"XIE"Chen，"ZHANG"Ji，"ZOU"Dongqin，"FANG"Susu，"KANG"Qin

Department"of"Neurology，"Jiangxi"Provincial"People’s"Hospital，"the"First"Affiliated"Hospital"of"Nanchang"Medical"College，"Nanchang"330006，"Jiangxi，"China

[Abstract]"Objective"To"analyze"the"effects"of"activating"transcription"factor"3"（ATF3）"pathway"mediated"by"circSLC8A1"on"oxidative"stress"and"iron"activity"of"epileptic"cells."Methods"An"epileptic"cell"model"was"established"using"human"neuronal-hippocampal"cells"through"Mg2+-free"method."The"expression"levels"of"circSLC8A1"and"ATF3"in"healthy"control"group"and"model"group"were"detected."Plasmid"transfection"was"used"to"establish"circSLC8A1"knockout"group，"ATF3"knockout"group，"circSLC8A1"knockout"+"ATF3"overexpression"group，"and"ATF3"knockout"+"circSLC8A1"overexpression"group."After"6h"transfection，"cells"were"cultured"in"normal"medium"for"48h."The"cell"viability，"iron"activity，"reactive"oxygen"speciesnbsp;（ROS），"lactate"dehydrogenase"（LDH）"and"glutathione"（GSH）"of"the"different"intervention"groups"were"detected"and"compared."Results"The"expression"levels"of"circSLC8A1，"ATF3，"ROS，"LDH"and"iron"activity"in"model"group"were"significantly"higher"than"those"in"healthy"control"group，"while"cell"activity"and"GSH"expression"were"significantly"lower"than"those"in"healthy"control"group"（Plt;0.05）."Knocking"out"circSLC8A1"can"significantly"reduce"the"expression"of"circSLC8A1"in"epileptic"model"cells，"while"knocking"out"ATF3"can"significantly"reduce"the"expression"of"ATF3"in"epileptic"model"cells"（Plt;0.05）."Knocking"out"circSLC8A1"or"ATF3"will"increase"the"cell"viability，"decrease"the"iron"activity"and"relieve"the"oxidative"stress"in"epileptic"model"cells."Knocking"out"circSLC8A1"and"overexpressing"ATF3"can"reverse"the"above"trend，"but"knocking"out"ATF3"and"overexpressing"circSLC8A1"will"not"lead"to"the"above"phenomenon."Conclusion"circSLC8A1"can"influence"the"cell"activity，"oxidative"stress"and"iron"activity"process"of"epileptic"model"cells"by"mediating"ATF3"pathway，"which"provides"some"reference"for"the"mechanism"of"epilepsy"and"its"targeted"therapy.

[Key"words]"circSLC8A1"pathway;"ATF3"pathway;"Epilepsy"process;"Oxidative"stress;"Iron"activity;"Cell"activity

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)疾病[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球總計(jì)約5000萬(wàn)癲癇患者，每年全球新發(fā)癲癇病例約500萬(wàn)例，高收入國(guó)家中每10萬(wàn)人就有49人被診斷為癲癇[2]。國(guó)內(nèi)的流行病學(xué)資料顯示，目前癲癇患者總數(shù)約900萬(wàn)例，其中活動(dòng)性癲癇患者總數(shù)超500萬(wàn)例，每年新發(fā)病例約70萬(wàn)例[3]。癲癇的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今仍未被完全闡明[4]。研究指出離子通道、神經(jīng)遞質(zhì)、免疫、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞改變等都可能與癲癇的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。細(xì)胞信號(hào)通路通過(guò)介導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞的存活、增殖、凋亡進(jìn)程產(chǎn)生影響，近年來(lái)研究證實(shí)多個(gè)信號(hào)通路可能與癲癇相關(guān)[6]。環(huán)狀RNA（circular"RNA，circRNA）是長(zhǎng)鏈非編碼RNA家族的一員，具有閉環(huán)結(jié)構(gòu)，研究證實(shí)circRNA與人動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病的發(fā)生關(guān)系密切[7-8]。circSLC8A1是來(lái)源于SLC8A1基因的circRNA，SLC8A1基因編碼鈉/鈣交換蛋白1，該蛋白可參與鈣穩(wěn)態(tài)，在神經(jīng)元功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。Hanan等[10]研究指出神經(jīng)系統(tǒng)疾病中circSLC8A1表達(dá)失調(diào)，該基因參與氧化應(yīng)激及神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展，但其機(jī)制仍待進(jìn)一步探索。本研究擬通過(guò)開(kāi)展細(xì)胞對(duì)照實(shí)驗(yàn)，分析circSLC8A1在癲癇進(jìn)展中的潛在參與價(jià)值，并分析其與癲癇細(xì)胞鐵活性和氧化應(yīng)激的關(guān)聯(lián)，為后續(xù)癲癇治療提供參考借鑒。

1""材料與方法

1.1"nbsp;細(xì)胞

人神經(jīng)元-海馬細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2""造模及實(shí)驗(yàn)分組

將細(xì)胞系置于10%胎牛血清及1%青霉素/鏈霉素溶液中，按照文獻(xiàn)[11]步驟（無(wú)Mg2+方式）建立癲癇體外細(xì)胞模型，造模成功后更換為正常培養(yǎng)基。健康對(duì)照組細(xì)胞在含有1mmol/L"Mg2+的正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)1d。將造模成功的細(xì)胞系分為模型組、敲除circSLC8A1組、敲除轉(zhuǎn)錄激活因子3（activating"transcription"factor"3，ATF3）組、敲除circSLC8A1+過(guò)表達(dá)ATF3組、敲除ATF3+過(guò)表達(dá)circSLC8A1組，與健康對(duì)照組細(xì)胞同樣進(jìn)行培養(yǎng)。本研究經(jīng)江西省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫理審批號(hào)：科快2024衛(wèi)（24）號(hào)]。

1.3""質(zhì)粒和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

健康對(duì)照組和模型組細(xì)胞不進(jìn)行任何操作，正常培養(yǎng)；敲除circSLC8A1組、敲除ATF3組、敲除circSLC8A1+過(guò)表達(dá)ATF3組、敲除ATF3+過(guò)表達(dá)circSLC8A1組按照分組標(biāo)準(zhǔn)采用質(zhì)粒及細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方式處理6h，隨后更換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，而后開(kāi)展體外實(shí)驗(yàn)。

1.4""觀察指標(biāo)

1.4.1""circSLC8A1、ATF3表達(dá)水平""采用定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative"real-time"polymerase"chain"reaction，qRT-PCR）技術(shù)及RNA提取技術(shù)，分別檢測(cè)并比較六組細(xì)胞的circSLC8A1、ATF3表達(dá)水平。

1.4.2""細(xì)胞活力及鐵活性差異""使用磷酸鹽緩沖液對(duì)六組細(xì)胞進(jìn)行沖洗，胰蛋白酶消化，而后采用鐵活性試劑盒對(duì)不同細(xì)胞系鐵活性進(jìn)行檢測(cè)；采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒測(cè)定法對(duì)模型細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)，使用無(wú)Mg2+溶液對(duì)不同組細(xì)胞進(jìn)行處理，96孔板接種，48h后加入CCK-8溶液，培養(yǎng)4～24h，使用微量滴定板讀數(shù)器測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.4.3""氧化應(yīng)激指標(biāo)差異""使用無(wú)Mg2+溶液對(duì)不同組細(xì)胞處理后，加入活性氧（reactive"oxygen"species，ROS）特異性熒光探測(cè)DCF-DA"20min，而后使用磷酸鹽緩沖液沖洗，并采用可視化熒光信號(hào)顯微鏡進(jìn)行觀察；采用試劑盒檢測(cè)乳酸脫氫酶（lactate"dehydrogenase，LDH）及谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5""統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS"26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（"）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""各組細(xì)胞的circSLC8A1、ATF3表達(dá)水平比較

模型組細(xì)胞的circSLC8A1、ATF3表達(dá)水平均顯著高于健康對(duì)照組（Plt;0.05）。敲除circSLC8A1可顯著降低癲癇模型細(xì)胞circSLC8A1表達(dá)量（Plt;0.05）；敲除ATF3對(duì)癲癇模型細(xì)胞circSLC8A1表達(dá)并無(wú)明顯影響，見(jiàn)圖4。敲除ATF3可顯著降低癲癇模型細(xì)胞ATF3表達(dá)量，使其低于模型組、敲除circSLC8A1+過(guò)表達(dá)ATF3組（Plt;0.05），敲除ATF3后，過(guò)表達(dá)circSLC8A1也不會(huì)顯著增加ATF3表達(dá)量，提示ATF3可能是circSLC8A1的下游基因，見(jiàn)圖1。

2.2""各組細(xì)胞活力及鐵活性比較

模型組細(xì)胞活力顯著低于健康對(duì)照組，鐵活性顯著高于健康對(duì)照組（Plt;0.05）。與模型組相比，敲除circSLC8A1組和敲除ATF3組的細(xì)胞活力均顯著升高（Plt;0.05）。敲除circSLC8A1+過(guò)表達(dá)ATF3組的細(xì)胞活力降低至接近模型組水平；而敲除ATF3+過(guò)表達(dá)circSLC8A1組的細(xì)胞活力維持在較高水平，與敲除ATF3組相近。鐵活性檢測(cè)顯示，與模型組相比，敲除circSLC8A1組和敲除ATF3組的鐵活性均顯著降低（Plt;0.05），但仍高于健康對(duì)照組。敲除circSLC8A1+過(guò)表達(dá)ATF3組的鐵活性升高至接近模型組水平，而敲除ATF3+過(guò)表達(dá)circSLC8A1組的鐵活性維持在較低水平，與敲除ATF3組相近，見(jiàn)圖2。

2.3""各組細(xì)胞的氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

模型組細(xì)胞的ROS、LDH表達(dá)水平均顯著高于健康對(duì)照組，GSH表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照組（Plt;0.05）。敲除circSLC8A1組、敲除ATF3組、敲除ATF3+過(guò)表達(dá)circSLC8A1組的LDH、ROS水平均低于模型組，GSH水平均高于模型組（Plt;0.05），但敲除circSLC8A1+過(guò)表達(dá)ATF3可使癲癇模型細(xì)胞的ROS、LDH水平再次回升到原有水平，GSH降低至原有水平，見(jiàn)圖3。

3""討論

癲癇是神經(jīng)元興奮和抑制失衡所引起的以神經(jīng)元群同步異常放電為典型特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病率為0.3%～0.5%，患病率為5‰～10‰[12]。癲癇具有重復(fù)性、陣發(fā)性、短暫性、僵硬性及致殘率較高等特點(diǎn)，癲癇持續(xù)狀態(tài)可對(duì)個(gè)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，嚴(yán)重?fù)p傷患者的海馬神經(jīng)元，癲癇長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致患者精神錯(cuò)亂、記憶力降低、社會(huì)適應(yīng)能力降低，青少年及兒童患者的智力和身體發(fā)育也會(huì)受到影響[13]。當(dāng)前全球約有5000萬(wàn)例癲癇患者，其中30%～40%的患者在藥物干預(yù)后病情仍得不到有效緩解，其原因與癲癇發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜有關(guān)[14]。細(xì)胞信號(hào)通路是近年來(lái)癲癇防治的研究熱點(diǎn)之一，目前已知的與癲癇有關(guān)的信號(hào)通路包括磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、促分裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路、核因子κB信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路等，這些信號(hào)通路通過(guò)激活或調(diào)節(jié)下游靶基因，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞功能及凋亡進(jìn)程產(chǎn)生影響，最終參與癲癇的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸等進(jìn)程[15]。

本研究構(gòu)建癲癇細(xì)胞模型并進(jìn)行分組干預(yù)發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞的circSLC8A1及ATF3表達(dá)水平顯著升高，提示circSLC8A1及ATF3可能與癲癇的發(fā)病存在一定關(guān)聯(lián)。Kang等[16]通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)癲癇模型細(xì)胞中circSLC8A1水平升高。進(jìn)一步的兩組細(xì)胞比較顯示，模型組細(xì)胞的氧化應(yīng)激指標(biāo)與健康對(duì)照組細(xì)胞差異較大，ROS和LDH表達(dá)水平顯著升高，而GSH水平顯著降低。氧化應(yīng)激是體內(nèi)自由基產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，過(guò)度氧化應(yīng)激可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，產(chǎn)生大量的氧化中間產(chǎn)物，其中ROS、LDH都屬于氧化中間產(chǎn)物。GSH可幫助保持正常的免疫系統(tǒng)功能，具有抗氧化、整合解毒等作用[17-18]。本研究結(jié)果顯示模型組細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)更明顯。

為驗(yàn)證circSLC8A1與ATF3之間是否存在關(guān)聯(lián)及circSLC8A1如何對(duì)癲癇細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞活性產(chǎn)生影響，本研究將癲癇模型細(xì)胞分別進(jìn)行敲除circSLC8A1、敲除ATF3、敲除circSLC8A1+過(guò)表達(dá)ATF3、敲除ATF3+過(guò)表達(dá)circSLC8A1處理，結(jié)果顯示敲除circSLC8A1或敲除ATF3可使其相應(yīng)表達(dá)水平降低。對(duì)比各干預(yù)組結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是敲除circSLC8A1還是敲除ATF3，均能提高癲癇模型細(xì)胞的活性，表明circSLC8A1和ATF3的存在可能促進(jìn)癲癇細(xì)胞的凋亡過(guò)程。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲除circSLC8A1+過(guò)表達(dá)ATF3可抵消細(xì)胞活性的提高，敲除ATF3后即使過(guò)表達(dá)circSLC8A1，細(xì)胞活性仍維持在較高水平；而敲除circSLC8A1+過(guò)表達(dá)ATF3會(huì)使細(xì)胞凋亡進(jìn)程繼續(xù)，敲除ATF3+過(guò)表達(dá)circSLC8A1則出現(xiàn)類似敲除circSLC8A1或敲除ATF3的表現(xiàn)，提示ATF3可能為circSLC8A1的下游基因，單純敲除circSLC8A1或敲除ATF3均可阻止該信號(hào)通路的傳導(dǎo)，敲除circSLC8A1+過(guò)表達(dá)ATF3則表現(xiàn)為信號(hào)通路未中斷，敲除ATF3+過(guò)表達(dá)circSLC8A1雖然在上游提供RNA，但ATF3作為下游通路被截?cái)啵詴?huì)出現(xiàn)與敲除ATF3一致的表現(xiàn)。同理，不同干預(yù)組細(xì)胞氧化應(yīng)激表達(dá)及鐵活性分析也進(jìn)一步驗(yàn)證circSLC8A1與ATF3屬于同一信號(hào)通路，且circSLC8A1是ATF3的上游通路。

綜上所述，circSLC8A1通過(guò)介導(dǎo)ATF3通路對(duì)癲癇模型的細(xì)胞活性、氧化應(yīng)激反應(yīng)及鐵活性進(jìn)程產(chǎn)生一定影響，可為癲癇產(chǎn)生機(jī)制及其靶向治療提供一定參考。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻(xiàn)]

[1] POKE"G，"STANLEY"J，"SCHEFFER"I"E，"et"al."Epidemiology"of"developmental"and"epileptic"encephalopathy"and"of"intellectual"disability"and"epilepsy"in"children[J]."Neurology，"2023，"100（13）："1363–1375.

[2] FALCO-WALTER"J."Epilepsy-definition，"classification，"pathophysiology，"and"epidemiology[J]."Semin"Neurol，"2020，"40（6）："617–623.

[3] Al"RUMAYYAN"A，"ALHARTHI"A，"AL-ROWAILI"M，"et"al."The"prevalence"of"active"epilepsy"in"the"Kingdom"of"Saudi"Arabia："A"cross-sectional"study[J]."Neuroepidemiology，"2023，"57（2）："78–89.

[4] NERI"S，"MASTROIANNI"G，"GARDELLA"E，"et"al."Epilepsy"in"neurodegenerative"diseases[J]."Epileptic"Disord，"2022，"24（2）："249–273.

[5] ZILBERTER"Y，"POPOVA"I，"ZILBERTER"M."Unifying"mechanism"behind"the"onset"of"acquired"epilepsy[J]."Trends"Pharmacol"Sci，"2022，"43（2）："87–96.

[6] 劉艷，"王敏，"李曉毛，"等."基于DJ-1/Nrf2/HO-1信號(hào)通路探討北柴胡地上部分多糖組分對(duì)癲癇小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激的影響[J]."中草藥，"2023，"54（1）："142–150.

[7] GRECO"S，"MARTELLI"F."Stressing"the"circle："Circular"RNA-LONP2"role"in"atherosclerosis[J]."JACC"Basic"Transl"Sci，"2024，"9（5）："671–673.

[8] TRISKA"J，"MATHEW"C，"ZHAO"Y，"et"al."Circular"RNA"as"therapeutic"targets"in"atherosclerosis："Are"we"running"in"circles？[J]."J"Clin"Med，"2023，nbsp;12（13）："4446.

[9] LI"Z，"GAO"Y，"ZHANG"B，"et"al."circRNA_SLC8A1"promotes"the"survival"of"mycobacterium"tuberculosis"in"macrophages"by"upregulating"expression"of"autophagy-"related"protein"SQSTM1/p62"to"activate"the"NF-κB"pathway[J]."Sci"Rep，"2024，"14（1）："5233.

[10] HANAN"M，"SIMCHOVITZ"A，"YAYON"N，"et"al."A"Parkinson’s"disease"circRNAs"resource"reveals"a"link"between"circSLC8A1"and"oxidative"stress[J]."EMBO"Mol"Med，"2020，"12（9）："e11942.