廣西生姜鐮刀菌枯萎病病原菌的分離鑒定

摘要：為確定引起廣西生姜鐮刀菌枯萎病的病原菌種類，研究采集了廣西生姜主產區疑似鐮刀菌枯萎病的生姜病株，采用組織分離法分離純化獲得16株病原菌菌株，結合形態學觀察和TEF-1α序列分析對其進行鑒定，并接種3株典型菌株的分生孢子懸浮液進行致病性測定。結果表明：16株菌株均與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）聚為一支，經柯赫氏法則驗證，明確了尖孢鐮刀菌是引起廣西生姜鐮刀菌枯萎病的主要病原菌。

關鍵詞：生姜鐮刀菌枯萎病；病原菌鑒定；尖孢鐮刀菌

中圖分類號：S436.32 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2025）02-0054-05

Isolation and Identification of the Pathogen Causing Ginger Fusarium Wilt in Guangxi

YANG Wei-chao1，2，LI Xiao-li1，WEN Jun-li3，HUANG Hao3，ZHOU Sheng-mao3，YUAN Gao-qing1

（1. College of Agriculture， Guangxi University， Nanning 530004， PRC; 2. Lechang Branch， Guangdong Tobacco Shaoguan City Co.， Ltd.， Lechang 512200， PRC; 3. Vegetable Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， PRC）

Abstract： This study aims to identify the pathogen causing ginger Fusarium wilt in Guangxi. The plant samples with suspected ginger Fusarium wilt were collected from main ginger-producing areas in Guangxi. A total of 16 pathogen strains were isolated by the tissue culture method and identified by morphological observation and TEF-1α sequence analysis. The pathogenicity of three typical strains was determined by inoculating the conidial suspensions. The results showed that all the 16 isolates were clustered with Fusarium oxysporum in the phylogenetic tree and their pathogenicity was confirmed according to Koch's postulates. In conclusion， F. oxysporum was the main pathogen causing ginger Fusarium wilt in Guangxi.

Key words： ginger Fusarium wilt; pathogen identification; Fusarium oxysporum

生姜（Zingiber officinale Rosc.）為姜科姜屬草本植物，是中國重要的經濟作物，其產地主要分布于山東、四川、云南、廣西等省份。其中廣西生姜的種植面積和年產量均位居全國第三，且呈現逐年增長的趨勢，生姜已成為廣西的優勢特色農作物之一[1]。近年來中國生姜種植面積不斷擴大，且長期采用無性繁殖和重茬種植，導致卵菌、真菌、細菌和線蟲等多種土傳病原物連年累積，不同土傳病害頻發，其中由鐮刀菌屬（Fusarium）真菌引起的枯萎病是生姜主要土傳病害之一。鐮刀菌主要是從植物塊莖或莖基部的自然孔口或傷口侵入寄主植物，破壞根莖部或維管束組織，嚴重影響植物對水分和養分的吸收，最終導致植物枯萎死亡。枯萎病一般造成生姜減產20%～30%，嚴重時達50%以上，甚至絕產[2]。1930年生姜枯萎病首次記錄于澳大利亞昆士蘭州，1942年調查顯示致病微生物為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）[3]。據研究，尖孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌姜專化型（F. oxysporum f. sp. zingiberi）、輪枝鐮刀菌（F. verticillioides）和腐皮鐮刀菌（F. solani）等均可侵染生姜引發枯萎病[4-7]。

筆者對廣西生姜病害種類進行調查研究，發現進入5月份高溫高濕天氣后，田間生姜陸續出現全株萎蔫現象，其中大部分為青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的生姜青枯病[8]，一部分疑似為鐮刀菌引起的生姜枯萎病。雖然國內外已有一些對鐮刀菌引發的生姜枯萎病的研究報道[2-7，9-13]，但是關于廣西生姜枯萎病危害情況及病原菌種類的研究報道仍然較少。因此，本研究采集廣西生姜主產區疑似鐮刀菌枯萎病的生姜病株，采用組織分離法分離病原菌，通過形態學觀察、分子生物學鑒定和柯赫氏法則確定病原菌種類，以期為當地生姜鐮刀菌枯萎病及其他土傳病害的診斷與防治提供指導。

1 材料與方法

1.1 田間調查與采樣

采樣于2023年5—12月（生姜土傳病害主要發生時期）在廣西南寧市、賀州市、梧州市、桂林市、玉林市和百色市等生姜種植基地進行，采用平行跳躍法取樣調查，每個調查點取2～5塊田，仔細觀察并記錄發病生姜植株癥狀特點，參考潘汝浩等[2]的方法對病株進行分級，統計發病率和病情指數。采集疑似生姜鐮刀菌枯萎病病株的姜塊和莖基部組織，帶回實驗室開展后續研究。

1.2 病原菌的分離純化及形態學觀察

對于有子實體產生的病組織，直接挑取子實體制片鏡檢；對于無子實體產生的病組織，取病健交界處組織在顯微鏡下觀察有無噴菌現象。選擇產生鐮刀菌霉層的病組織和無明顯噴菌現象的病組織，采用組織分離法分離病原菌[14]。具體操作步驟如下：取姜塊病健交界處大小為0.3 cm×0.5 cm的組織，置于75%酒精中消毒30 s，轉入5.5%次氯酸鈉溶液中消毒30 s，經無菌水漂洗3次后，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基上，28℃下恒溫培養3 d。

待培養基上長出菌絲后，在顯微鏡下用滅菌鑷子挑取單菌落邊緣菌絲尖端于PDA培養基上純化培養1～

2次，觀察記錄菌落、厚垣孢子、產孢細胞和分生孢子的特征，并隨機選取50個分生孢子測量其大小。

1.3 病原菌的分子生物學鑒定

收集病原菌的菌絲體，按照Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒說明書的方法提取其DNA。使用鐮刀菌屬通用引物TEF-1αF（5'-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3'）和TEF-1αR（5'-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3'）對轉錄延伸因子-1α（TEF-1α）進行PCR擴增[15]。PCR擴增體系（25.0 μL）：2×Taq PCR"MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板DNA"1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環；72℃再延伸10 min。取5.0 μL PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，110 V電壓下電泳25 min，將瓊脂糖凝膠置于掃描儀中觀察并拍照記錄。將PCR擴增產物送置生工生物工程（上海）股份有限公司測序。在NCBI數據庫中對序列進行BLAST比對，確定其同源性；利用ClustalW將比對序列對準，使用MEGA 6.0軟件進行系統分析，采用鄰接法構建系統發育樹，確定分離所得菌株的分類地位。

1.4 病原菌的致病性測定

為驗證分離所得菌株的的致病性，根據鑒定結果選擇3株代表性菌株，采用刺傷生姜莖基部再接種

分生孢子懸浮液的方法對生姜植株進行有傷接種[14]。用打孔器打取菌餅置于馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）中，于28℃、220 r/min條件下振蕩培養7 d，用血球計數板在光學顯微鏡下計數，用無菌水將孢子懸浮液濃度稀釋為1×106個/mL。選取培養了50 d且長勢一致的健康生姜幼苗，使用牙簽刺傷生姜莖基部，接種10 mL孢子懸浮液，以接種相同體積相同濃度的PDB培養液為對照，每個處理10株姜苗。把接種后的生姜置于（28±5）℃的溫室大棚中，觀察并記錄發病情況。待接種后的植株出現明顯發病癥狀后，從姜塊或莖基部病健交界處取樣，并按照組織分離法對病原菌再次進行分離鑒定，以完成柯赫氏法則的驗證。

2 結果與分析

2.1 田間癥狀特點

在桂林市灌陽縣和靈川縣、玉林市博白縣以及南寧市邕寧區4個生姜種植區采集樣品時，觀察到田間生姜植株從下到上葉片邊緣發黃卷曲，有的整株黃化萎蔫，逐步枯死；地下部分生姜塊莖表皮褐變，有的產生白色霉層，剖開塊莖維管束發現褐變；病株無明顯惡臭（圖1）。田間有明顯發病中心，發病率為5%～18%，病情指數為3.00～11.33。

2.2 病原菌分離結果及形態特征

挑取霉層在光學顯微鏡下觀察，發現有大量鐮刀菌屬真菌的小型分生孢子；取植株病健交界處組織鏡檢，無明顯噴菌現象；據此初步推測病害為生姜鐮刀菌枯萎病。從病害標樣中共分離獲得16株病原菌菌株。將菌株置于PDA培養基上28℃黑暗條件下培養，菌株生長4 d后，菌落直徑為4.5 cm；生長7 d后，菌落基本布滿直徑9 cm的平板。由圖2可知，菌落前期呈白色，后期產生紫色色素，氣生菌絲呈絨狀；小型分生孢子數量眾多，形狀多為卵圓形或腎形，有時呈假頭狀著生在產孢細胞上，大小為（5.0～12.6）μm×（2.5～3.6）μm；產孢細胞短，單瓶梗，在菌絲上分散生長，在分生孢子座上多分枝成叢；典型大型分生孢子未見產生；厚垣孢子呈球形，單生或對生。以上形態特征與鐮刀菌屬真菌相符[16]。

2.3 病原菌的分子生物學鑒定結果

經測序可知，16株鐮刀菌屬菌株的TEF-1α序列長度約為650 bp（NCBI登錄號：PP941939-PP941954）。Blastn比對結果顯示，這些菌株與Fusarium oxysporum"FOEP 42.1300 （NCBI登錄號為OR965935）的相似度達到了100%。采用鄰接法進行1 000次重復，通過Bootstraps檢驗后建立系統發育樹，由圖3可知，16株菌株與尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）以99%的支持率聚在一起。

2.4 病原菌的致病性測定結果

在生姜植株莖基部分別接種3株菌株的孢子懸浮液，由圖4可知，接種7 d后，接種部位出現褐變并逐漸向周圍蔓延，葉片邊緣發黃卷曲，隨后表現為整葉失綠、黃化；接種10 d后，發病嚴重的生姜地上部分枯萎，莖稈內維管束發生褐變；接種20 d

后，地下部分腐爛變褐，最終整株倒伏枯死。對照組生姜未發病。取發病生姜塊莖病健交界處組織，按照組織分離法重新分離，得到的菌株與接種菌株一致，說明以上菌株對生姜具有致病性。結合形態特征和分子序列鑒定，確定尖孢鐮刀菌是引起廣西生姜枯萎病的主要病原菌。

3 討論與結論

長期以來，多種土傳病害嚴重威脅了廣西生姜的生產，降低了產品的質量和產量。這些病害田間為害癥狀相似，病原種類復雜，包括青枯雷爾氏菌、腸桿菌（Enterobacter spp.）、果膠桿菌（Pectobacterium spp.）、腐霉菌（Pythium spp.）和鐮刀菌（Fusarium spp.）等，均可造成生姜根莖腐爛、全株枯死[17]。因此，明確不同產區病原菌種類對有效控制當地生姜病害具有重要意義。

本研究從廣西4個生姜產區的枯萎病病株中分離純化得到16株鐮刀菌菌株，經形態學特征觀察、分子生物學鑒定和致病性測定，發現目前廣西生姜鐮刀菌枯萎病的致病菌主要為尖孢鐮刀菌，但是否存在其他鐮刀菌種類還有待深入調查研究。

鐮刀菌是重要的植物土傳病原菌，由鐮刀菌屬真菌侵染所致的生姜枯萎病分布較為廣泛，不同生姜種植區鐮刀菌種類有所不同。國外報道的鐮刀菌有尖孢鐮刀菌姜專化型和輪枝鐮刀菌[3-5]；在國內，有研究表明山東省平度市和安丘市的生姜枯萎病病原菌為尖孢鐮刀菌[2，6]，湖北生姜枯萎病的病原菌為腐皮鐮刀菌[15]，重慶市榮昌區和浙江省江山市生姜枯萎病的病原菌為禾谷鐮刀菌（F. graminearum）[18-19]。其中尖孢鐮刀菌被列為世界十大植物病原真菌之一，有些種類具有寄主特異性，可根據寄主專化性分為不

同專化型菌株，目前已有100多個專化型被報道[20-21]。明確病原菌種下分化可以更好地指導抗病育種和病害防控，本研究因缺乏不同專化型的菌株作為參照，所以未能進一步開展病原菌的專化型鑒定。目前大部分報道僅對尖孢鐮刀菌鑒定到種，因此今后應加大對生姜枯萎病病原菌種下分化的研究。

本研究在進行病原菌的形態學鑒定時，未在PDA培養基上觀察到典型的大型分生孢子，這可能是不同菌株的差異導致的。鐮刀菌屬因形態復雜而難以單純通過形態學觀察鑒定到種，通常需要結合分子鑒定確定其分類地位。相較于ITS序列，TEF-1α序列在遺傳水平上具有良好的穩定性和多樣性，對鐮刀菌屬下種間的分辨力更高，目前已經被廣泛應用于鐮刀菌的分類鑒定[22-23]。因此本研究在形態學鑒定的基礎上，進一步結合TEF-1α序列進行系統發育分析，將廣西生姜鐮刀菌枯萎病病原菌鑒定為尖孢鐮刀菌。研究結果可為當地生姜土傳病害的監測預警和生姜枯萎病的防控提供理論依據，促進當地生姜產業的健康發展。

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（責任編輯：王婷）