基于線粒體COⅠ基因的湖南省棉葉蟬種群遺傳多樣性研究

摘要：【目的】棉葉蟬（Amrasca biguttula）在湖南省棉田發生日趨嚴重，旨在解析當地棉葉蟬的遺傳多樣性與遺傳分化。【方法】2023年在湖南省采集了14個棉葉蟬地理種群樣本，基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction， PCR）獲得的線粒體DNA（mitochondrial DNA， mtDNA）細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunit Ⅰ， COⅠ）基因序列，利用MEGA 7.0、DnaSP 6.1、Arlequin 3.5和Network 10.2等軟件對湖南省14個棉葉蟬地理種群的遺傳多樣性、遺傳分化、種群動態和系統進化等進行分析。【結果】在140頭棉葉蟬個體中擴增獲得長度為568 bp的mtDNA COⅠ序列。共檢測到14個單倍型（Hap1～Hap14），其中Hap1被所有種群共享，其發生頻率達87.86%，是原始單倍型。棉葉蟬群體的單倍型多樣性指數為0.226 95，核苷酸多樣性為0.000 52，核苷酸平均差異數為0.296 25。各單倍型間的遺傳距離為0.001 76～0.007 09。棉葉蟬群體的遺傳分化程度低（遺傳分化系數為0.016 84），基因交流頻繁（基因流為29.19）。分子方差分析結果表明遺傳變異主要來自種群內。棉葉蟬群體Tajima’ D、Fu and Li’s D和Fu and Li’s F中性檢驗結果均為負值且顯著，表明湖南省棉葉蟬種群正在經歷擴張?！窘Y論】湖南省棉葉蟬種群遺傳多樣性水平較低，種群基因交流頻繁，遺傳分化程度低，群體正在經歷擴張，應該采取積極的監測和防控措施，保障湖南省棉花產業的健康發展。

關鍵詞：棉葉蟬；線粒體COⅠ基因；地理種群；遺傳多樣性；湖南省

Study on the genetic diversity of Amrasca biguttula population in Hunan Province based on mtDNA COⅠ gene

Liu Binglei1， Wang Yongbo1， Zhang Zhengyun1， Yang Bin2， Li Caihong1*

（1. Hunan Cotton Science Institute， Changde， Hunan 415101， China; 2. College of Electrical and Information Engineering， Hunan University， Changsha 410082， China）

Abstract： [Objective] The occurrence of Amrasca biguttula in the cotton field of Hunan Province is increasingly growing. The purpose of this study was to analyze the genetic diversity and genetic differentiation of A. biguttula in Hunan Province. [Methods] In 2023， 14 geographical population samples of A. biguttula were collected in Hunan Province. Based on the mitochondrial DNA （mtDNA） cytochrome c oxidase subunit Ⅰ （COⅠ） gene sequences obtained by polymerase chain reaction （PCR）， the genetic diversity， genetic differentiation， population dynamics， and systematic evolution of the 14 geographical populations of A. biguttula in Hunan Province were analyzed using MEGA 7.0， DnaSP 6.1， Arlequin 3.5， Network 10.2， and other softwares. [Results] The mtDNA COⅠ sequences of 568 bp were obtained from 140 individuals by PCR. A total of 14 haplotypes （Hap1-Hap14） were detected， among which Hap1 was shared by all populations. Hapl had a frequency of 87.86%， and was the original haplotype. The haplotype diversity index of the whole A. biguttula community was 0.226 95， the nucleotide diversity was 0.000 52， and the average number of nucleotide difference was 0.296 25. The genetic distance between haplotypes ranged 0.001 76 to 0.007 09. The whole A. biguttula community had a low degree of genetic differentiation （the genetic differentiation coefficient is 0.016 84）， and active gene exchange （the gene flow is 29.19）. Molecular variance analysis （AMOVA） results indicated that genetic variation mainly originated within the population. The Tajima's D， Fu and Li's D， and Fu and Li's F neutral tests for the whole A. biguttula community were significantly negative， suggesting that the A. biguttula population in Hunan Province is undergoing expansion. [Conclusion] The geographical population of A. biguttula in Hunan Province showed low genetic diversity， active gene exchange， and low genetic differentiation; and the total population is experiencing obvious expansion. Active monitoring and control measures should be taken to ensure the healthy development of cotton industry in Hunan Province.

Keywords： Amrasca biguttula; mtDNA COⅠ gene; geographical population; genetic diversity; Hunan Province

棉葉蟬（Amrasca biguttula）屬半翅目葉蟬科，又名二點綠葉蟬，具有寄主種類多、分布范圍廣、世代重疊、繁殖能力強等特點[1]。棉葉蟬是危害棉花中后期生長發育的主要害蟲之一，通過刺吸取食棉株汁液，造成葉片出現斑點、卷曲、皺縮等現象，發生嚴重時可導致葉片焦枯，蕾鈴大量脫落，棉田呈火燒狀[2]。

目前部分學者認為轉蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis， Bt）基因抗蟲棉的種植及管理制度的改變加重了棉葉蟬等刺吸式害蟲的發生與危害[3-5]。棉葉蟬已成為廣泛分布于印度、巴基斯坦、中國等亞洲棉花主產國的重要害蟲，嚴重影響了當地棉花產量，棉葉蟬曾導致印度的Bt棉減產50%，在巴基斯坦造成棉花減產67%，甚至絕收[6-7]。在我國，除了新疆地區，棉葉蟬在長江流域和黃河流域棉區均有分布，尤其在長江中下游及其以南植棉區發生比較嚴重，從每年4月開始1年可發生8～14代，若防治不當則會造成棉花不同程度的減產，如2016年在湖南省常德市鼎城區棉葉蟬造成棉花減產10%～70%[8]。棉葉蟬屬于遷飛性害蟲，具有強擴散力和適應力。通常物種或種群的遺傳多樣性水平較高會增強其對環境的適應能力[9]。種群遺傳結構與遺傳多樣性研究有助于深入解析害蟲的種群擴散規律。例如印度中部和北部棉葉蟬種群線粒體DNA（mitochondrial DNA， mtDNA）細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunit Ⅰ， COⅠ）基因序列存在明顯差異，且棉葉蟬種群的遺傳距離和地理距離存在相關性[6]?；趍tCOⅠ基因序列分析發現，巴基斯坦棉葉蟬種群遺傳分化明顯，但遺傳距離和地理距離無顯著相關性[7]。上述研究結果有助于棉葉蟬防控策略的制定。目前國內僅有少數關于棉葉蟬發生規律與綜合防控的研究報道[10-12]，對棉葉蟬遺傳多樣性及遺傳分化的研究還未見報道。

湖南是位于我國長江流域的重要植棉大省，氣候溫暖濕潤，也伴隨著蟲害的高發，其中棉葉蟬的發生與危害日趨嚴重。從20世紀80年代開始，湖南省一些研究人員持續關注著棉葉蟬的發生與防治[8， 10-11， 13]。為進一步了解棉葉蟬在湖南省的地理種群遺傳多樣性，本研究通過分析mtCOⅠ基因序列，從分子水平探討湖南省14個棉葉蟬地理種群的遺傳多樣性與遺傳分化情況，相關研究結果有助于深入了解湖南省棉葉蟬種群的遺傳結構，從而更好地了解棉葉蟬種群的發生動態與擴張機理，為其綜合防治策略的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

棉葉蟬樣本于2023年10月采集自湖南省棉花種植區域，采用5點取樣法，于岳陽市、常德市、益陽市、株洲市、衡陽市、郴州市采集到14個地理種群，共140頭棉葉蟬。樣本信息見表1。采集的蟲態均為成蟲，樣本用無水乙醇浸泡，保存于－20 ℃冰箱。

1.2 基因組DNA提取

按照天根生化科技（北京）有限公司動物基因組DNA提取試劑盒（DP304）的說明書提取單頭棉葉蟬的基因組DNA，將提取的DNA用30 μL超純水溶解，保存于－20 ℃冰箱備用。用Nano Drop 1000分光光度計（賽默飛，上海，中國）檢測DNA的濃度和質量，根據光密度（optical density， OD）值，后續實驗采用OD260/280為1.8～2.0、OD260/230為2.0～2.2的DNA樣品。

1.3 基因序列擴增與測序

采用引物組合[14]：5'-GCTCAACAAATCATA-AAGATATTGG-3'和5'-TAAACTTCAGGGTGA-CCAAAAAATCA-3'擴增棉葉蟬mtDNA COⅠ基因的目的片段。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction， PCR）體系：10 μL TaKaRa Ex Taq mix，7 μL ddH2O，DNA模板（質量濃度為20～70 ng·μL－1）2 μL，上下游引物各0.5 μL。PCR程序：98 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸5 min。將PCR擴增產物在1%（質量分數）瓊脂糖凝膠上以110 V電泳分離30 min，然后用凝膠成像系統分析電泳結果并拍照保存。在紫外燈下切下含有目的片段的明亮條帶，送至上海生工生物工程股份有限公司進行雙向測序。

1.4 基因序列整理與相關指標分析

將雙向測序結果導入MEGA 7.0軟件，利用SnapGene軟件識別峰圖并矯正序列后再進行多序列比對。與美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）數據庫已有棉葉蟬mtCOⅠ基因（GenBank：KJ867503.1）序列進行比對分析，以確定擴增的基因序列是棉葉蟬mtCOⅠ基因。

應用DnaSP 6.1軟件[15]計算單變異位點數、簡約信息位點數、單倍型多樣性、核苷酸多樣性、核苷酸平均差異數、遺傳分化系數、基因流等；對種群間與種群內的遺傳變異進行Tajima’s D、Fu and Li’s D和Fu and Li’s F中性檢驗[16]。利用MEGA 7.0軟件[17]分析棉葉蟬mtCOⅠ基因序列的堿基組成、顛換和轉換堿基對數等；并基于Kimura-2-Parameter（K2P）模型，采用非加權組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means， UPGMA），從NCBI數據庫中獲得近緣種黑尾葉蟬（Nephotettix cincticeps）、茶小綠葉蟬（Empoasca onukii）和棉葉蟬（A. biguttula）的COⅠ基因序列，對應的GenBank號分別為 MF716884.1、KJ867506.1和MH182661.1，并以此為外群構建單倍型系統發育樹，自展值（bootstrap）設置為1 000。同樣采用K2P模型分析單倍型間的遺傳距離。采用Arlequin 3.5軟件[18]進行種群的分子方差分析（analysis of molecular variance， AMOVA）。利用Network 10.2軟件基于中介鄰接網絡（median-joining network）算法構建單倍型間的網絡關系圖。

2 結果與分析

2.1 棉葉蟬mtCOⅠ基因序列分析

湖南省14個棉葉蟬地理種群共擴增得到140條棉葉蟬COⅠ序列。經過電泳檢測，將PCR產物進行雙向測序，測序結果經SnapGene軟件查看峰序圖，去除兩端測序不穩定的區間，之后在NCBI數據庫進行BLAST同源性搜索，確定為棉葉蟬mtCOⅠ基因的目標序列，可用于比對的有效片段長度為568 bp。分析表明棉葉蟬mtCOⅠ基因序列無堿基的插入或缺失，具有明顯的腺嘌呤（adenine， A）-胸腺嘧啶（thymine， T）堿基偏倚性，A和T的平均含量為70.4%，不存在轉換和顛換堿基對，序列有9個單變異多態性位點和5個簡約信息位點，共占堿基總數的2.46%。單變異多態性位點分別位于第38、80、182、225、272、299、330、464、486位；簡約信息位點分別位于第236、274、278、284、326位。

2.2 棉葉蟬種群遺傳多樣性分析

所有供試種群中共發現14種單倍型，分別為Hap1～Hap14，包括3個共享單倍型（Hap1、Hap4、Hap13），14個種群均含有Hap1，Hap4被 LK種群和DC種群共享，Hap13被YY種群和LW種群共享；其余的11個單倍型（Hap2～3、Hap5～12、Hap14）為相應地理種群的獨享單倍型，其中Hap10屬于HS2種群，Hap11屬于JH種群，Hap6～Hap9屬于HR1種群，Hap2和Hap3屬于AX種群，Hap12和Hap14屬于LW種群，Hap5屬于DC種群。Hap1的出現頻率占總樣本數的87.86%，出現頻率最高且分布最廣，為所有地理種群共有，其余13種單倍型出現頻率均較低（0.71%～1.43%）。各地理種群中，HR1種群的單倍型種類最多（5種），其次為LW種群（4種），AX種群和DC種群均含有3種單倍型，HS2種群、JH種群、YY種群和LK種群含有2種單倍型，其余種群分別僅有1種單倍型（表2）。

14個地理群體單倍型多樣性指數為0.226 95，核苷酸多樣性為0.000 52，核苷酸平均差異數為0.296 25。其中，HR1種群的單倍型多樣性指數最高（0.667 00），LW種群的核苷酸多樣性和核苷酸平均差異數均最高，分別為0.002 03和1.156 00。表明HR1種群和LW種群的遺傳多樣性較為豐富。此外，HS1種群、NX種群、HR2種群、HY種群、HN種群和HS3種群都有1種單倍型故單倍型多樣性和核苷酸多樣性均為0（表2）。

2.3 棉葉蟬種群遺傳分化與分子變異分析

湖南省14個棉葉蟬地理種群總群體遺傳分化系數為0.016 84（小于0.05），基因流為29.19（大于4），說明14個地理種群間的基因交流頻繁且不存在顯著的遺傳分化[19]。從成對種群間的情況來看，AX種群與HS1種群、HN種群、HR2種群、HS2種群、HS3種群、HY種群、LK種群、NX種群的遺傳分化系數為0.055～0.075，表明存在中等程度的遺傳分化，其余種群間的遺傳分化系數均低于0.05，表明不存在顯著的遺傳分化。所有種群間的基因流均不低于6.25，表明種群間的基因交流頻繁（表3）。

AMOVA結果（表4）顯示，棉葉蟬種群內遺傳變異占比為93.39%（遺傳分化系數FST＝0.066 09＞0.05，P＜0.01），說明種群內出現顯著的中等程度遺傳分化；種群間遺傳變異占比為6.61%，表明總群體的遺傳變異主要來源于種群內部個體間的變異。

2.4 棉葉蟬種群動態分析

中性檢驗結果（表5）表明，HS2種群、JH種群、HR1種群、AX種群、YY種群、LK種群、LW種群和DC種群的Tajima’ D、Fu and Li’s D、Fu and Li’s F結果均為負值，并未達到顯著水平。然而，棉葉蟬群體整體的中性檢驗結果均達到顯著水平（Tajima’s D＝－2.310 87，P＜0.01；Fu and Li’s D＝－4.189 03，P＜0.02；Fu and Li’s F＝－4.193 68，P＜0.02）。中性檢驗結果顯著說明假設不符合中性進化模型，即種群受到了自然選擇的影響；3個指標均小于0，則表明湖南省棉葉蟬種群正在經歷明顯的群體擴張，呈現持續增長模式。

2.5 單倍型遺傳距離及系統進化分析

14個單倍型的遺傳分化結果（表6）顯示，單倍型間的K2P遺傳距離為0.001 76～0.007 09。各單倍型間的遺傳距離存在差異，其中Hap11、Hap12與其他單倍型間的遺傳距離較大（0.003 53～0.007 09），Hap1與其他13個單倍型間的遺傳距離較小（0.001 76～0.003 53）。

從基于UPGMA法構建的棉葉蟬mtCOⅠ基因單倍型系統發生樹（圖1）可見，湖南省棉葉蟬14種單倍型與黑尾葉蟬、茶小綠葉蟬和棉葉蟬中的同源基因有明顯的區別，本研究中的14個單倍型匯聚到一支。在此基礎上，Hap12單獨形成一支；其余13個單倍型位于另一支，但它們之間的關聯較弱。從圖2可見，湖南省棉葉蟬14個地理種群的單倍型中介網絡關系圖以Hap1為中心呈現輻射發散狀，推測Hap1為祖先單倍型，因為其分布廣泛且分布頻次最高。Hap12與其他單倍型的距離最遠，Hap4與Hap11存在可能的突變位點mv1，這些結果與單倍型遺傳分化結果（表6）相符。系統發育樹結果表明湖南棉葉蟬地理種群沒有產生明確的地理分化，單倍型網絡關系圖呈現輻射發散狀表明湖南省棉葉蟬種群近期可能經歷了擴張。

3 討論

本研究通過PCR擴增和測序獲得了湖南省棉葉蟬140條mtCOⅠ基因序列，從單倍型、遺傳距離、分子方差、種群動態等方面進行遺傳多樣性分析。結果表明，湖南省棉葉蟬mtCOⅠ基因序列片段的堿基組成表現出較強的A-T偏倚性（平均含量70.4%），具備典型的昆蟲線粒體堿基組成特點[14]。在湖南省14個棉葉蟬地理種群中發現14個單倍型，其中共享單倍體和獨享單倍型分別有3個、11個，表明湖南省不同地區的棉葉蟬存在一定的交流，也產生了適應特定地區環境的遺傳變異。單倍型Hap1在所有地理種群中均有分布且出現頻率最高，在單倍型網絡關系圖中處于中心位置。鐘裕俊等[20]基于mtCOⅠ基因序列對中國蔥斑潛蠅（Liriomyza chinensis）不同地理種群的遺傳多樣性進行了分析研究，發現12個地理種群共有的單倍型Hap1總發生頻率高達81.82%，處于單倍型網絡關系圖的中心位置，該單倍型被認為是原始單倍型。陳世春等[21]基于mtCOⅠ基因序列分析表明我國茶網蝽（Stephanitis chinensis）種群的遺傳分化程度較高，偶爾發生基因交流，12個地理種群中鑒定到38個單倍型，未發現原始單倍型。據此，本研究推斷Hap1是湖南省棉葉蟬群體中適應性較強且分布廣泛的原始單倍型。單倍型種類最豐富的2個地區岳陽市華容縣新河鄉建軍八組（HR1）和郴州市臨武縣汾市鎮張家村（LW）處于湖南省與其他省份的交界地帶，可能是這種地緣交界促進了種群遺傳多樣性的產生。

本研究中供試棉葉蟬群體的單倍型多樣性指數為0.226 95，核苷酸多樣性為0.000 52，核苷酸平均差異數為0.296 25，這些遺傳多樣性指數表明湖南省棉葉蟬種群多樣性處于相對較低水平[22]。湖南省棉葉蟬群體的基因流達到29.19，而遺傳分化指數為0.016 84，說明湖南省棉葉蟬種群的基因交流水平較高，種群遺傳分化程度低[21]。AMOVA結果表明，遺傳變異主要來自種群內部，而不是種群之間。以上結果揭示了湖南省14個棉葉蟬種群并未形成明顯的地理種群結構。姚亮[23]對全國13個褐飛虱（Nilaparvata lugens）地理種群遺傳多樣性研究表明，各種群間的遺傳多樣性水平較低，130個樣本中僅存在10個單倍型，單倍型之間的遺傳距離較小，基因交流活躍，未出現地理種群結構，并認為這種趨勢與褐飛虱的遷飛屬性相符。同樣，棉葉蟬的遷飛性與寄主多樣性使得棉葉蟬在湖南省不同地區間遷飛，加強了基因的交流。

對湖南省棉葉蟬種群動態分析表明，Tajima’ D、Fu and Li’s D和Fu and Li’s F檢驗參數均為負值，且群體的參數呈現顯著性，這意味著湖南省不同棉葉蟬地理種群的進化不遵循中性模型[24]，不是中性突變在自然群體中進行隨機遺傳漂變的結果，種群正在經歷擴張。陳永年等[13]研究發現棉葉蟬的冬季宿主主要為棉花和茄子，冬季缺乏宿主植物則無法過冬。但隨著現在設施蔬菜的廣泛栽培以及茄科、棉花等棉葉蟬宿主植物種植制度的變化，棉葉蟬在湖南地區的越冬似乎也有可能[5]。成功越冬造成棉葉蟬發生量增多，這種變化可能造成種群規模擴大，加劇種群擴張，對棉花生產造成更大的威脅。因此，應加強對棉葉蟬的監測與防控研究。同時，為進一步在棉葉蟬的預測預報、成災機理及綜合防控等方面提供種群遺傳學信息，后續研究應通過增加采集棉葉蟬的寄主種類、樣本數量、生境類型等方法擴大樣本來源，更深層次地解析湖南省棉葉蟬的遺傳分化。

4 結論

基于mtCOⅠ基因從分子水平分析了湖南省14個棉葉蟬地理種群的遺傳多樣性。主要結果表明：在湖南省棉葉蟬群體中檢測到14個單倍型，其中在所有地理種群中均有分布且出現頻率最高的Hap1為原始單倍型；群體的遺傳分化系數和基因流分別為0.016 84和29.19，基因交流頻繁，遺傳分化水平較低；群體的Tajima’ D、Fu and Li’s D和Fu and Li’s F中性檢驗結果均為負值且顯著，表明湖南省棉葉蟬種群正在經歷明顯的種群擴張，對當地棉花產業的威脅也在日趨加大。

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（責任編輯：王小璐" " 責任校對：王國鑫）