保護液對重組蛋白穩定性影響及其化學發光應用研究

摘要：探討了不同保護液配方對重組蛋白穩定性的影響，并將其應用于化學發光檢測系統。通過正交實驗篩選出最佳保護液配方，包括甘油、蔗糖、BSA和吐溫20等成分。結果表明，優化后的保護液能顯著提高重組熒光素酶的熱穩定性和長期儲存穩定性。將該保護液應用于化學發光免疫分析檢測人血清中甲胎蛋白（AFP），檢測靈敏度提高了2倍，線性范圍擴大到0.1～1 000.0 ng/mL。為提高重組蛋白穩定性和改善化學發光檢測性能提供了新的思路。

關鍵詞：重組蛋白；保護液；穩定性；化學發光；免疫分析

重組蛋白在生物醫藥、診斷試劑等領域有著廣泛應用，但其穩定性一直是制約應用的關鍵因素之一。提高重組蛋白的穩定性對于延長其保質期、保持活性至關重要。保護液作為一種常用的穩定劑，其配方設計直接影響蛋白的穩定性。本研究以重組熒光素酶為模型蛋白，系統研究了保護液成分對其穩定性的影響，并將優化后的保護液應用于化學發光免疫分析，以期為相關領域提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

本研究所用的主要材料和試劑包括：重組熒光素酶（由本實驗室構建的大腸桿菌表達系統獲得）、甘油、蔗糖、牛血清白蛋白、吐溫20、乙二胺四乙酸、二硫蘇糖醇、D熒光素（化學發光底物）、人甲胎蛋白（AFP）標準品、抗AFP單克隆抗體和多克隆抗體、羧基修飾磁性納米顆粒（直徑1 μm）、1乙基3（3二甲基氨丙基）碳二亞胺鹽酸鹽和N羥基琥珀酰亞胺。磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）和三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液（pH 8.0，由實驗室自制）。所有化學試劑均為分析純或更高純度，實驗用水為超純水系統制備的去離子水。

1.2儀器與設備

研究使用的主要儀器設備包括：高速離心機、紫外可見分光光度計、蛋白電泳系統、蛋白純化系統、多功能酶標儀、恒溫混勻儀、pH計、電子天平、微量離心機、旋轉蒸發儀、振蕩器、冷凍離心機、超速離心機、倒置熒光顯微鏡和納米粒度分析儀。這些儀器設備覆蓋了蛋白質表達、純化、分析和應用的全過程，確保了實驗操作的精確性和數據的可靠性。所有儀器在使用前均按照標準操作程序進行校準和質量控制，以保證實驗結果的準確性和可重復性。

1.3重組熒光素酶的表達與純化

重組熒光素酶的表達采用大腸桿菌BL21（DE3）株系，將含有目的基因的pET28a質粒轉化入菌株中［1］，挑選單菌落接種于50 mL LB培養基，37 ℃培養過夜。次日將培養物按1∶100比例接種至1 L LB培養基中，30 ℃培養至OD 600達0.6～0.8。加入IPTG至終濃度0.5 mmol誘導表達，18 ℃培養16 h。離心收集菌體，超聲破碎后12 000 g離心20 min分離上清液。上清液經過NiNTA親和層析柱純化，用含20 mmol咪唑的洗脫緩沖液洗滌，隨后用含250 mmol咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。收集的蛋白溶液用10 kDa截留分子量的超濾管濃縮并更換緩沖液為PBS（pH 7.4）。純化后的蛋白經SDSPAGE和Western blot鑒定，使用BCA法測定蛋白濃度。最后，將純化的重組熒光素酶分裝，-80 ℃保存備用。

1.4保護液配方優化

采用正交實驗設計法優化保護液配方。選取4個主要因素：甘油、蔗糖、BSA和吐溫20，每個因素設置3個水平。設計L9（3^4）正交表，共進行9組實驗。以PBS（pH 7.4）為基礎緩沖液，按照正交表配制不同組合的保護液。將純化的重組熒光素酶稀釋至0.1 mg/mL，與等體積的各組保護液混合。將混合液分裝后在37 ℃、4 ℃和-20 ℃條件下儲存，分別在0、1、7、14、30天測定酶活性。酶活性測定采用化學發光法，使用D熒光素作為底物，在多功能酶標儀上測量發光值。以酶活性保留率作為評價指標，通過方差分析確定各因素對酶活性的影響程度。根據分析結果，選擇最優配方進行驗證實驗，并與商業保護液進行對比。最終確定的最佳保護液配方為：15%（v/v）甘油、10%（w/v）蔗糖、0.1%（w/v）BSA和0.05%（v/v）吐溫20。

1.5重組熒光素酶穩定性評價

重組熒光素酶的穩定性評價，主要從熱穩定性和長期儲存穩定性2個方面進行評估。熱穩定性測試中，將酶液（0.1 mg/mL）分別在25 ℃、37 ℃和45 ℃恒溫水浴中孵育，每隔30 min取樣測定剩余酶活性，直至4 h。長期儲存穩定性測試中，將酶液在4 ℃和-20 ℃條件下儲存，分別在0、7、14、30、60、90天取樣測定剩余酶活性。酶活性測定采用化學發光法，使用100 μmol D熒光素作為底物，在多功能酶標儀上測量30 s內的累積發光值［2］，以初始酶活性為100%，計算各時間點的酶活性保留率。通過繪制酶活性保留率隨時間變化的曲線，評估重組熒光素酶在不同條件下的穩定性。

1.6化學發光免疫分析方法

采用雙抗體夾心法建立化學發光免疫分析方法。將抗AFP單克隆抗體偶聯到羧基修飾磁性納米顆粒上，取50 μL磁珠懸液，用MES緩沖液（pH 6.0）洗滌3次，加入10 μg抗體、50 μL EDC（10 mg/mL）和50 μL NHS（10 mg/mL），室溫反應2 h。反應后用PBS洗滌3次，用1% BSA封閉1 h。將偶聯好的磁珠與100 μL樣品（或標準品）混合，37 ℃孵育1 h。洗滌后加入100 μL生物素化抗AFP多克隆抗體（1 μg/mL），37 ℃孵育30 min。再次洗滌后加入100 μL重組熒光素酶親和素復合物（1∶2 000稀釋），室溫孵育15 min。最后洗滌，加入100 μL D熒光素（10 μmol），立即在多功能酶標儀上測量化學發光值。

2結果與討論

2.1保護液配方對重組熒光素酶熱穩定性的影響

本研究考察了不同保護液配方對重組熒光素酶熱穩定性的影響。在37 ℃條件下，添加15%甘油和10%蔗糖的保護液顯著提高了酶的熱穩定性，4 h后仍保留80%以上的活性，而無保護液的對照組僅保留30%活性［3］。進一步研究發現，0.1%牛血清白蛋白的加入可進一步提高熱穩定性，使4 h后的活性保留率達到90%。這可能是由于甘油和蔗糖形成的氫鍵網絡穩定了蛋白質的三級結構，而牛血清白蛋白則通過表面吸附減少了蛋白質分子間的相互作用，從而抑制了熱變性的發生。

2.2保護液配方對重組熒光素酶長期儲存穩定性的影響長期儲存穩定性研究結果表明，優化后的保護液配方顯著延長了重組熒光素酶的儲存期限。在4 ℃條件下，添加保護液的酶液在90天后仍保持85%的初始活性，而無保護液的對照組活性降至40%。-20 ℃儲存條件下，保護液的效果更為顯著，90天后酶活性保留率高達95%。分析發現，0.05%吐溫-20的加入對長期儲存穩定性有顯著貢獻，這可能是由于其減少酶分子在反復凍融過程中的聚集。此外，蔗糖可能通過形成玻璃態結構，進一步保護酶分子免受凍融損傷［4］。

2.3最佳保護液配方的確定

通過正交實驗設計和單因素優化，最終確定了重組熒光素酶的最佳保護液配方：15%甘油、10%蔗糖、0.1%牛血清白蛋白和0.05%吐溫20，以磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）為基礎。該配方在熱穩定性和長期儲存穩定性方面均表現出優異的效果。進一步的驗證實驗表明，該保護液配方能夠使重組熒光素酶在37 ℃條件下4 h后保留90%以上的活性，在4 ℃儲存90天后保留85%以上的活性。與商業保護液相比，本研究優化的配方在各項指標上均表現出明顯優勢，為重組熒光素酶的穩定性保護提供了有效方案。

2.4優化保護液在化學發光免疫分析中的應用

將優化后的保護液應用于人甲胎蛋白（AFP）化學發光免疫分析中，顯著提高了檢測的靈敏度和穩定性。與未添加保護液的對照組相比，檢測靈敏度提高了2倍，最低檢測限達到0.1 ng/mL［5］。線性范圍擴大到0.1～1 000.0 ng/mL，相關系數R2為0.999 8。重復性實驗表明，批內變異系數（CV）小于5%，批間變異系數小于8%。加入保護液后，檢測試劑在4 ℃條件下可穩定保存3個月，室溫下工作8 h活性無明顯下降。這些結果表明，優化的保護液配方顯著改善了化學發光免疫分析的性能，為臨床診斷提供了更可靠的方法。

3結語

通過系統優化保護液配方，成功提高重組熒光素酶的穩定性，并將其應用于化學發光免疫分析中。研究結果表明，優化后的保護液配方（15%甘油、10%蔗糖、0.1%牛血清白蛋白和0.05%吐溫-20）顯著提高重組熒光素酶的熱穩定性和長期儲存穩定性。在37 ℃條件下4 h后仍保留90%以上的活性，在4 ℃儲存90天后保留85%以上的活性。將優化后的保護液應用于人甲胎蛋白（AFP）化學發光免疫分析中，檢測靈敏度提高了2倍，最低檢測限達到0.1 ng/mL，線性范圍擴大到0.1～1 000.0 ng/mL。為提高重組蛋白穩定性和改善化學發光免疫分析性能提供了新的思路和方法，具有重要的理論意義和應用價值。

參考文獻：

［1］孔祥君，陳玉妹，林英武，等.金屬卟啉重組蛋白的光活性與光穩定性研究［J］.南華大學學報（自然科學版），2023，37（3）：65-70，98.

［2］呂玲，邢義高，張秀濤，等.通用型細胞凍存保護液的探索［J］.中國醫藥生物技術，2022，17（4）：347-349.

［3］周鷹，吳美麗，朱晗婷，等.過敏原Der p 23重組蛋白制備及其特異性IgE化學發光檢測方法的建立［J］.中國免疫學雜志，2020，36（20）：2491-2494.

［4］杭鑫茹，耿榮慶，錢林.牛奶過敏原β乳球蛋白的重組制備及磁微粒化學發光檢測法的建立［J］.生物技術通報，2020，36（3）：193-198.

［5］王兢磊，孔飛志，黨智笙，等.t-PAIC單克隆抗體制備及磁微粒化學發光免疫檢測［J］.包裝學報，2023，15（4）：59-67.

作者簡介：沈超，女，黑龍江哈爾濱人，研發工程師，碩士，研究方向：基因克隆重組蛋白的表達純化、蛋白質穩定性及免疫診斷試劑。