嗜線蟲致病桿菌YZ011對鱗翅目昆蟲殺蟲活性及比較基因組學分析

收稿日期：2024-08-01

基金項目：國家重點研發計劃項目（2024YFD1400900）；江蘇省農業科技自主創新基金項目[CX（22）1009]；江蘇省國際合作項目（BZ2020039）；揚州市科技計劃項目（YZ2023244）；農業基礎性長期性科技工作項目（NAES069AM04）

作者簡介：林曼曼（1990-），女，江蘇徐州人，博士，助理研究員，主要從事農業害蟲生物防治。（E-mail）lin.man.happy@163.com

通訊作者：徐 健，（E-mail）bio-xj@163.com

摘要： 昆蟲病原線蟲共生菌是一類重要的生物防治資源。為明確本單位分離自小卷蛾斯氏線蟲共生菌YZ011對鱗翅目害蟲的殺蟲活性及機制，本研究在測定菌株YZ011對小菜蛾和草地貪夜蛾血腔注射毒性的基礎上，進一步對其進行全基因組測序和比較基因組學分析。結果表明，血腔注射100 nL 1.0×10⁶CFU/mL菌株YZ011 24 h后，小菜蛾幼蟲和草地貪夜蛾幼蟲的死亡率分別為75.0%和56.7%，均顯著高于血腔注射磷酸鹽緩沖液（PBS）對照。全基因組測序結果顯示菌株YZ011為嗜線蟲致病桿菌，其基因組含有19個次級代謝產物基因簇；與其同源性最高的嗜線蟲致病桿菌菌株YL001和菌株SⅡ相比，菌株YZ011含有29個特異基因簇。菌株YZ011基因組中共注釋到586個毒力因子相關基因。本研究結果從基因組層面解析了嗜線蟲致病桿菌YZ011的分子特征，對菌株YZ011的綜合利用具有重要意義。

關鍵詞： 嗜線蟲致病桿菌；殺蟲活性；基因組；次級代謝產物；毒力因子

中圖分類號： S476"" 文獻標識碼： A"" 文章編號： 1000-4440（2025）02-0258-10

Insecticidal activity and comparative genomics analysis of Xenorhabdus nematophila YZ011 against lepidopteran insects

LIN Manman1， LIU Qin1， HAN Guangjie1， HUANG Lixin1， XIA Yang1， LI Chuanming1， ZHANG Nan2， LU Yurong1， XU Bin1， XU Jian^1，2

（1.Institute of Agricultural Sciences of the Lixiahe District in Jiangsu Province/National Agricultural Experimental Station for Agricultural Microbiology in Yangzhou， Yangzhou 225007， China；2.College of Plant Protection， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）

Abstract： Entomopathogenic nematode symbionts are important biological control resources. In order to clarify the insecticidal toxicity and mechanism of the symbiotic bacteria YZ011 isolated from Steinernema carpocapsae on lepidopteran pests， the whole genome sequencing and comparative genomics analysis of strain YZ011 were further carried out on the basis of measuring the hemocoel injection toxicity of strain YZ011 to Plutella xylostella and Spodoptera frugiperda. The results showed that the mortality rates of Plutella xylostella larvae and Spodoptera frugiperda larvae were 75.0% and 56.7%， respectively， after hemocoel injection of 100 nL 1.0×10⁶ CFU/mL strain YZ011 for 24 h， which were significantly higher than those of phosphate buffered saline （PBS） control. The whole genome sequencing results showed that YZ011 was a nematophagous pathogenic bacterium， and its genome contained 19 secondary metabolite gene clusters. Compared with the most homologous strains YL001 and S Ⅱ， YZ011 contained 29 specific gene clusters， and 586 virulence factor-related genes were annotated. The results of this study analyzed the molecular characteristics of Xenorhabdus nematophila YZ011 at the genomic level， which was of great significance for the comprehensive utilization of strain YZ011.

Key words： Xenorhabdus nematophila;insecticidal activity;genome;secondary metabolite;virulence factor

昆蟲病原線蟲是廣泛存在于自然環境中的一類寄生性線蟲，它與體內共生菌互惠共生，具有天敵昆蟲兼病原微生物雙重特點，能通過感染害蟲，并利用其作為寄主進行繁殖和生存，最終導致昆蟲死亡^[1]。昆蟲病原線蟲共生菌存在于昆蟲病原線蟲腸道，屬革蘭氏陰性菌，包括與斯氏線蟲科（Steinernema）線蟲共生的致病桿菌屬（Xenorhabdus）菌和與異小桿線蟲科（Heterorhabditis）線蟲共生的發光桿菌屬（Photorhabdus）菌^[2-3]。昆蟲病原線蟲共生菌與線蟲專一性共生，線蟲入侵昆蟲血腔后致病桿菌由線蟲肛門排出，發光桿菌被線蟲反芻從口腔吐出。共生菌進入昆蟲血腔后，產生的一系列次級代謝產物能導致昆蟲死亡，分解昆蟲組織，為線蟲的生長與繁殖提供營養物質^[2，4]。作為一種重要的潛在生物殺蟲資源，越來越多具有生物活性的昆蟲病原線蟲共生菌菌株被發現。截至2024年7月，美國國家生物技術信息中心（NCBI）分類數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi）中共收錄了32個分類物種的致病桿菌菌株和24個分類物種的發光桿菌菌株，目前尚有166個致病桿菌菌株和116個發光桿菌菌株有待分類^[5]。

共生菌產生的次級代謝產物主要為聚酮合成酶（PKS）、非核糖體肽合成酶（NRPS）和其他類似酶合成的非核糖體衍生肽、聚酮化合物和雜合天然產物，合成這些化合物的基因占共生菌基因組的7.5%^[6-9]。由于共生菌次級代謝產物的抗菌和殺蟲潛力，其在藥品和生物農藥的研制中廣受關注。Palma等^[10]對分離自斯氏線蟲的14株致病桿菌進行生物活性測定和基因組分析，發現14株致病桿菌均對大蠟螟具有毒殺作用，基因組生物信息分析獲得110種殺蟲蛋白，包括Tc、Txp、Mcf、Pra/Prb和App同系物等，以及其他毒力因子，如殺線蟲蛋白、幾丁質酶和用于合成不同生物活性化合物的次級代謝產物。Wang等^[11]分離的122株共生菌對玉米螟幼蟲均有口服殺蟲活性或生長抑制作用，其中，致病桿菌菌株SY5對小菜蛾、甜菜夜蛾、玉米螟、黏蟲和黃粉蟲有較強的殺蟲活性。共生菌產生的具有殺蟲活性的蛋白類毒素根據其作用方式可分為血腔注射活性和胃毒活性兩類。血腔活性毒素蛋白包括Mcf毒素^[12]、Txp40毒素^[13]、XaxAB毒素^[14]、XhlA毒素^[15]、Pir毒素^[16-17]和RTX毒素^[18]等，胃毒活性殺蟲蛋白主要有Tc毒素^[19]、幾丁質酶^[20]和XnGroEL毒素^[21]等。

劉琴等^[22]從罹死二化螟蟲體中分離獲得對二化螟、小菜蛾、草地貪夜蛾等具有廣譜寄生活性的小卷蛾斯氏線蟲及其共生菌YZ011。為明確菌株YZ011功能基因、基因簇及殺蟲活性物質，本研究在測定共生菌YZ011對小菜蛾幼蟲和草地貪夜蛾幼蟲殺蟲活性的基礎上，進一步對其進行全基因組測序及生物信息學分析，注釋菌株YZ011基因功能，預測菌株YZ011的次級代謝產物基因簇及毒力因子，以期為菌株YZ011在害蟲生物防治中的應用提供基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

共生菌菌株YZ011分離自罹死二化螟幼蟲體內的小卷蛾斯氏線蟲，以甘油-80 ℃保存于江蘇里下河地區農業科學研究所^[22]。小菜蛾為揚州種群，室內用油菜苗飼養繁殖多代^[23]。草地貪夜蛾蟲源引自中國農業科學院植物保護研究所，人工飼料室內多代飼養繁殖^[22]。

1.2 菌株YZ011對小菜蛾、草地貪夜蛾的殺蟲毒力

取甘油保存的YZ011菌株10 μL轉接至1 mL 胰酪大豆胨液體培養基（TSB）^[22]中，28 ℃、220 r/min振蕩培養16 h后，取500 μL培養液轉接至50 mL TSB培養基再在28 ℃、220 r/min振蕩培養24 h，利用平板計數法測定菌液中菌體含量。菌液離心后用磷酸鹽緩沖液（PBS）重新懸浮菌體至1.0×10⁶CFU/mL。選取4齡小菜蛾幼蟲和草地貪夜蛾幼蟲，于解剖鏡下，利用Nanoject Ⅲ顯微注射器（美國Drummond公司產品）向蟲體倒數第2～3腹節間分別注射50 nL和100 nL 1.0×10⁶CFU/mL共生菌，以注射100 nL無菌PBS為對照。小菜蛾飼養于直徑為9.0 cm盛有卷心菜的培養皿中，草地貪夜蛾單頭飼養于盛有人工飼料的24孔細胞培養板內，每個處理20頭幼蟲，重復3次，生化培養箱25 ℃培養，光照時間為16 h/d，24 h后進行存活小菜蛾和草地貪夜蛾計數，計算死亡率。利用GraphPad Prism 9.5.0和IBM SPSS Statistics 21軟件進行數據統計和處理間差異顯著性分析（Plt;0.05）。

1.3 菌株YZ011全基因組測序及組分與功能分析

取菌株YZ011培養液50 μL轉接至5 mL TSB培養基中，培養16 h離心收集菌體，采用細菌DNA提取試劑盒（美國Omega公司產品）制備DNA樣本，委托南京集思慧遠生物科技有限公司進行菌株的全基因組測序。

采用Unicycler v0.4.8軟件組裝測序數據，獲得基因組序列。使用軟件Prokka v1.12軟件進行基因組組分分析，包括編碼基因和非編碼基因的注釋，參數使用--rfam--addgenes，其余參數取默認值。使用RepeatMasker 4.1.0軟件進行重復序列預測。采用綜合抗生素耐藥性數據庫（CARD）、碳水化合物活性酶數據庫（CAZy）、病原與宿主互作數據庫（PHI）進行基因功能注釋。利用EffectiveT3軟件預測Ⅲ型分泌系統效應蛋白，利用SignalP 4.1軟件進行分泌蛋白信號肽預測。利用BLAST軟件將預測的基因序列與非冗余蛋白質氨基酸序列數據庫（NR）、Swiss-Prot蛋白氨基酸序列數據庫、京都基因與基因組百科全書（KEGG）、同源蛋白質簇（COG）數據庫、真核生物同源基因組（KOG）數據庫、基因本體（GO）數據庫、蛋白質家族（Pfam）數據庫進行比對，獲得預測基因的注釋信息。利用Circos v0.69-5軟件（https：//circos.ca）及COG注釋繪制菌株YZ011基因組的全基因組圈圖。

1.4 進化分析和比較基因組學分析

上傳菌株YZ011全基因組序列至Type Strain Genome Server（TYGS）平臺（https：//tygs.dsmz.de），分別以16S rDNA和全基因組構建系統發育樹以確定菌株YZ011所屬物種。基于系統發育樹分析結果，從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取具有全基因組序列的嗜線蟲致病桿菌菌株基因組，上傳至TYGS平臺，分別以16S rDNA和全基因組構建系統發育樹，分析獲得同源性高的菌株。利用Geneious 9.0.2和OrthoVenn3軟件（https：//orthovenn3.bioinfotoolkits.net/start/upload）分別對菌株YZ011及其同源性高的菌株進行全基因組基因共線性分析和直系同源核心基因簇及特異基因簇分析。

1.5 次級代謝產物基因簇分析

將菌株YZ011基因組上傳至Anti-SMASH^[24]（https：//antismash.secondarymetabolites.org/#！/start），對其進行次級代謝產物基因簇分析。

1.6 毒力因子分析

采用病原菌毒力因子數據庫（Virulence Factor Database， VFDB）（https：//www.mgc.ac.cn/VFs）對菌株YZ011進行毒力因子基因鑒定。利用Blastall 2.2.26軟件對基因序列進行注釋，期望域值（E）設置為1×10^-10。

2 結果與分析

2.1 菌株YZ011對小菜蛾和草地貪夜蛾幼蟲的殺蟲活性

菌株YZ011對鱗翅目害蟲小菜蛾和草地貪夜蛾幼蟲均具有感染致死作用，顯微注射50 nL和100 nL的1.0×10⁶CFU/mL共生菌24 h后，小菜蛾幼蟲的死亡率分別為60.0%和75.0%，均顯著高于注射PBS對照；顯微注射50 nL和100 nL 的1.0×10⁶CFU/mL共生菌24 h后，草地貪夜蛾幼蟲的死亡率分別為 35.0%和56.7%，亦顯著高于注射PBS對照（圖1）。且注射100 nL 1.0×10⁶CFU/mL共生菌24 h后，小菜蛾和草地貪夜蛾幼蟲的死亡率均顯著高于注射50 nL 1.0×10⁶CFU/mL共生菌處理。

2.2 菌株YZ011全基因組

菌株YZ011的全基因組圖譜如圖2所示。從圖中可以看出，共生菌菌株YZ011基因組大小為4 408 387 bp（GenBank 登錄號：CP158108），G+C堿基含量為43.9%，預測得到3 985個編碼基因、22個rRNA、76個tRNA、110個misc_RNA和1個tmRNA。

從外到內的7個圈依次為基因組大小的標識、正鏈上的編碼序列（CDS）、負鏈上的CDS、正鏈上的rRNA和tRNA、負鏈上的rRNA和tRNA、G+C堿基含量和GC偏移值。

2.3 功能基因數

基于KEGG、COG、Swiss-Prot、GO和KOG等數據庫注釋得到的功能基因較多，分別為3 933個、2 907個、2 871個、2 678個和1 027個，占基因總數的99.37%、73.45%、72.54%和67.66%和25.95%；基于CARD數據庫注釋得到的基因有254個，占基因總數的6.42%，而基于CAZy數據庫注釋得到的基因最少，僅68個，占基因總數的1.72%。

2.4 菌株YZ011進化和全基因組比對

以菌株YZ011的16S rDNA和全基因組構建的系統發育樹如圖3所示。2個系統發育樹均顯示，菌株YZ011與嗜線蟲致病桿菌（Xenorhabdus nematophila）處于同一分支，因此，本研究認為共生菌菌株YZ011屬于嗜線蟲致病桿菌。

2.5 比較基因組

從NCBI獲得4株具有全基因組序列的嗜線蟲致病桿菌菌株，菌株SⅡ（Xenorhabdus nematophila，GenBank 登錄號：CP060401）、菌株YL001（Xenorhabdus nematophila，GenBank登錄號：CP032329）、菌株AN6/1（Xenorhabdus nematophila，GenBank登錄號：LN681227）和菌株ATCC 19061（Xenorhabdus nematophila，GenBank 登錄號：FN667742）。將菌株YZ011的基因組序列與上述4株嗜線蟲致病桿菌的基因組序列構建系統發育樹（圖4），從圖中可見菌株YZ011與菌株YL001同源性最高，其次為菌株SⅡ。

菌株YZ011與4株嗜線蟲致病桿菌基因組的DNA同源性值、平均核苷酸一致性、基因組大小和G+C堿基含量見表1。從表中可以看出，菌株YZ011與4個同源菌株的DNA同源性指數值d0、d4和d6均在88.4%以上，表明菌株YZ011與4株同源菌株基因組的同源性均較高。菌株YZ011與4株同源菌株的平均核苷酸一致性值為99.46%～99.98%，其中菌株YZ011與菌株YL001的平均核苷酸一致性最高（99.98%），與菌株SⅡ的平均核苷酸一致性次之（99.96%）。這一結果也與圖4結果相吻合。菌株YZ011與4株同源菌株的基因組大小和G+C堿基含量亦基本接近。

將菌株YZ011與同源性較高的菌株YL001和菌株SⅡ進行共線性分析，結果如圖5所示。從圖中可以看出，菌株YZ011與菌株YL001和菌株SⅡ有較多大片段的共線性，也存在基因顛倒重排和共線性較低的區域。

菌株YZ011與菌株YL001和菌株SⅡ的全基因組直系同源基因簇分析結果如圖6所示。菌株YZ011與菌株YL001和菌株SⅡ的核心基因簇有3 254個、非必須基因簇有269個以及特異基因簇42個（菌株YZ011 29個、菌株YL001 13個）。GO分析發現菌株YZ011的29個特異基因簇涉及2個條目（GO：0006313和GO：0032196），其中GO：0006313的基因簇數量為20個，GO：0032196基因簇數量為9個，主要參與轉座和DNA介導。

2.6 菌株YZ011次級代謝產物合成基因簇

菌株YZ011基因組次級代謝產物基因簇分析結果如表2所示。從表中可以看出，YZ011基因組含有19個次級代謝產物基因簇，包括8個非核糖體合成酶基因簇（NRPS）、2個類非核糖體合成酶基因簇（NRRS-like）、1個I型聚酮化合物合酶基因簇（T1PKS）、1個獨立于NRPS的鐵載體基因簇（NI-siderophore）、1個吩嗪生物合成基因簇（Phenazine）、1個丁內酯生物合成基因簇（Butyrolactone）、1個含有β-內酯的蛋白酶抑制劑生物合成基因簇（Betalactone）、1個核苷生物合成基因簇（Nucleoside）和3個未知功能的基因簇。Region 11的NRPS基因簇和Region 12未知功能基因簇位于菌株YZ011與菌株YL001和菌株SⅡ共線性較低的區域。

2.7 菌株YZ011毒力因子

基于VFDB數據庫，菌株YZ011基因組序列中共注釋到586個毒力因子相關基因，如大多數革蘭氏陰性病原細菌感染宿主的重要分泌系統Ⅲ型分泌系統（T3SS）、Ⅵ型分泌系統（T6SS）、脂多糖、抗菌物質、溶血素、毒力增強因子、穿孔毒素、毒素重復序列RTX等類型的基因。部分毒力因子與其他革蘭氏陰性昆蟲病原菌的殺蟲蛋白具有一定的相似性，如溶血素HlyA與嗜水氣單胞菌溶血素AhlA^[25]的相似度為59.6%，穿孔毒素與耶爾森氏菌YaxAB毒素^[26]的相似度為53.8%。

3 討論與結論

嗜線蟲致病桿菌是與小卷蛾斯氏線蟲共生的昆蟲病原細菌，其產生的次級代謝產物具有抗真菌、抗細菌和殺蟲等活性^[27]。本團隊從二化螟罹死蟲體中分離獲得的小卷蛾斯氏線蟲N-Yz1對二化螟幼蟲和草地貪夜蛾幼蟲均有較高感染致死作用^[28]，進一步從小卷蛾斯氏線蟲體內分離獲得了共生菌菌株YZ011，生物活性測定結果表明菌株YZ011對小菜蛾幼蟲和草地貪夜蛾幼蟲均具有較高的毒力。在全基因組測序基礎上，基于16S rDNA和全基因組序列構建的系統進化樹均表明菌株YZ011屬于嗜線蟲致病桿菌，且該菌株基因組大小、G+C堿基含量與其他已報道的嗜線蟲致病桿菌菌株一致。通過與4株已有全基因組序列的嗜線蟲致病桿菌進行基因組比較分析發現，菌株YZ011與嗜線蟲致病桿菌菌株YL001相似度最高。菌株YL001不僅對馬鈴薯晚疫病病原菌（Phytophthora infestans）、玉米大斑病病原菌（Exserohilum turcicum）、水稻紋枯病病原菌（Rhizoctonia solani）等具有較強抗菌活性^[29]，其發酵上清液中還含有水溶性苯并芘類化合物Xenocoumacins和酰胺類化合物Nematophin等殺蟲活性物質，而在其他嗜線蟲致病桿菌中亦分離得到Xenocoumacins、Nematophin、PAX肽（Peptide-antimicrobial-Xenorhabdus）、Benzylideneacetone、Xenomatides和Xenematides等^[8，30-31]殺蟲活性物質，但嗜線蟲致病桿菌代謝產物中發揮殺蟲作用的具體化合物還不明確。

嗜線蟲致病桿菌不能獨立于其宿主長時間存活，因此很難將共生菌直接用作生物農藥。基于全基因組測序技術和生物信息學方法，對致病桿菌的毒力因子進行分析對推進共生菌在害蟲防控領域的應用具有重要意義。本研究對菌株YZ011次級代謝產物合成基因簇及其毒力因子進行了分析，為后續克隆相關基因獲得對鱗翅目害蟲具有殺蟲活性的毒素提供基礎。聚酮類化合物（Polyketide， PK）和非核糖體多肽（Nonribosonmal peptide， NRP）是目前研究最多的兩類重要的次級代謝產物，其生物合成需要PK和NRP。PK合成多種聚酮化合物，包括抗生素、抗腫瘤物質、免疫抑制劑等，NRP則合成多種天然多肽，如免疫抑制劑、抗生素、抗癌和抗病毒因子、殺蟲劑、鐵載體和生物表面活性劑等^[6-7]。對菌株YZ011預測得到的19個次級代謝產物基因簇中NRP基因簇達9個，表明菌株YZ011中可能存在毒素物質合成基因。值得注意的是，次級代謝產物基因簇中Region 11的NRP基因簇位于菌株YZ011與菌株YL001和菌株SⅡ共線性較低的區域，該共線性較低的區域還包括Region 12這一未知功能基因簇，說明該區域可能存在新的潛在活性物質基因。基于VFDB數據庫，菌株YZ011基因組中注釋到多種毒素、胞外酶和抗菌劑基因，其中一些同源基因在毒殺昆蟲、營養獲取和免疫逃避等方面發揮重要作用^[32-33]。毒力因子與特定的分泌系統有關，革蘭氏陰性菌特有的分泌機制可以將蛋白質直接從細胞質分泌到細胞外或直接進入靶細胞，包括Ⅰ型分泌系統（T1SS）、T3SS和T6SS。其中，T1SS能產生相對分子量較大的毒素蛋白，如RTX蛋白家族的蛋白^[34]。菌株YZ011注釋到9個由T1SS分泌的RTX家族蛋白。T3SS在致病桿菌侵染宿主過程中發揮著重要作用，病原菌通過T3SS將效應蛋白注射到宿主細胞中，進而調控其致病力。目前已報道發光桿菌菌株均編碼至少1個T3SS，而致病桿菌卻不一定存在T3SS^{[9， 35-38]}。另外，致病桿菌通過T6SS分泌系統將毒素分子直接遞送到靶細胞，致病桿菌基因組至少編碼1個T6SS，具有多個T6SS的菌株在與宿主的相互作用中更具有競爭優勢^[35，39]。本研究中，菌株YZ011基因組中預測得到5個T3SS效應蛋白基因和32個T6SS效應蛋白基因，說明菌株YZ011在害蟲防控領域具有較高的應用潛力。

不同菌株的分泌系統存在一定差異，菌株分泌的活性物質亦變化較大，甚至在相同物種的菌株之間亦是如此^[40]。菌株YZ011毒力因子注釋結果表明，菌株YZ011中含有多個已報道嗜線蟲致病桿菌毒力因子，同時也存在一定差異。Txp40是一種在昆蟲病原線蟲共生菌中普遍存在且高度保守的殺蟲毒素蛋白，可導致昆蟲中腸腸壁細胞間排列紊亂，對多種鱗翅目和雙翅目昆蟲具有毒殺作用，Kinkar等^[13]研究結果表明重組Txp40對大蠟螟幼蟲具有致死毒性。本研究在菌株YZ011沒有注釋到Txp40毒素蛋白，但是菌株YZ011對小菜蛾和草地貪夜蛾幼蟲的血腔注射毒性預示其必然存在某些毒力物質，對注釋到的其他毒力因子XhlA、Cytolysin等在Cowles等^[15]、Mcquade等^[41]研究中已有報道。共生菌菌株YZ011對小菜蛾幼蟲和草地貪夜蛾幼蟲的殺蟲毒力受哪些毒力基因調控尚需進一步分析與驗證。

綜上，本研究對分離自小卷蛾斯氏線蟲的嗜線蟲致病桿菌YZ011進行了全基因組序列分析，對其潛在的毒力基因進行了預測，后續將進一步克隆毒力基因進行異源表達以及對靶標昆蟲生物活性測定，以期為害蟲生物防治開發新型生物農藥提供技術支撐。

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（責任編輯：石春林）