中國沙棘ACBPs基因家族成員鑒定及響應鉛脅迫的表達分析

摘" " 要：【目的】ACBPs（acyl-CoA-binding proteins）基因家族在植物的正常生長和發育、響應非生物脅迫以及生物膜修復等方面具有重要作用。旨在探究中國沙棘ACBPs基因家族成員在重金屬鉛脅迫下的基因表達量，為初步解析中國沙棘響應重金屬鉛脅迫的分子機制及利用基因工程手段培育重金屬鉛低積累性的新品種提供研究基礎和分子靶標。【方法】通過生物信息學方法對中國沙棘ACBPs基因家族成員進行鑒定，并對其家族成員進行理化性質分析、多序列比對和系統進化分析、亞細胞定位和染色體定位分析、基因結構和Motif序列分析、順式作用元件分析、蛋白互作網絡和蛋白三維結構預測分析、物種內與物種間基因共線性分析以及對基因表達模式進行轉錄組分析和qRT-PCR驗證。【結果】在中國沙棘全基因組中共鑒定出8個ACBPs基因，不均勻分布于7條染色體上。ACBPs家族成員可細分為4個組，同一組內的成員基因結構保守且蛋白基序差異較小。共線性分析表明，中國沙棘ACBPs基因家族與擬南芥ACBPs基因家族之間存在9條共線性，與翅果油樹ACBPs基因家族之間存在17條共線性。轉錄組分析和qRT-PCR驗證表明，中國沙棘ACBPs基因家族中大部分基因在鉛濃度（w，后同）為1000 mg·kg-1時，表達量急劇下降；在鉛濃度為5000 mg·kg-1時，表達量顯著上升。【結論】在中國沙棘基因組中鑒定到8個ACBPs基因。Group1和Group3中的成員在基因結構、motif序列以及蛋白三維結構中均表現了一定的保守性；ACBPs基因家族成員的啟動子區域含有多種順式作用元件，能夠響應植物激素的調控、影響分生組織的基因活性，以及響應脅迫應激。基因家族大部分成員在鉛脅迫條件下的表達具有相似性，該基因家族通過調整基因的表達量響應不同濃度的重金屬鉛脅迫，從而減輕鉛脅迫帶來的傷害。

關鍵詞：中國沙棘；生物信息學；ACBPs基因家族；鉛脅迫

中圖分類號：S793.6 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2025）03-0526-17

Identification and expression analysis of ACBPs family members of Hippophae rhamnoides subsp. sinensis Rousi in response to lead stress

CHEN Ke1， 2， LI Xinjuan1， ZHANG Tian1， REN Qiandan1， SUN Jing2， ZHOU Wu1*

（1College of Eco-Environmental Engineering， Qinghai University， Xining 810016， Qinghai， China; 2Northwest Institute of Plateau Biology， Chinese Academy of Sciences/Qinghai Provincial Key Laboratory of Qinghai-Tibet Plateau Biological Resources/CAS Key Laboratory of Tibetan Medicine Research， Xining 810008， Qinghai， China）

Abstract： 【Objective】 Hippophae rhamnoides subsp. sinensis Rousi is a plant of substantial economic value and ecological significance， attracting sustained research interest. The ACBPs gene family is integral to plant biology， playing a critical role in normal plant growth and development. This gene family is deeply involved in cellular material and energy metabolism and plays a vital role in plants’ adaptation to abiotic stress and biomembrane repair， particularly in response to heavy metal stress. Information on the ACBPs gene family in H. rhamnoides remains scarce. This study aims to accurately and comprehensively identify the members of the ACBPs gene family in H. rhamnoides using bioinformatics tools， and to investigate the expression of these genes under heavy metal （lead） stress through molecular biology approaches. 【Methods】 In this study， the ACBPs gene family in H. rhamnoides subsp. sinensis Rousi was identified using the hidden Markov model （PF00887） and the HMMER search script. Physicochemical properties and subcellular localization were analyzed via the ExPASy and WoLF PSORT websites. Multiple sequence alignment and gene structure analyses were conducted using MEGA software and the GSDS website. Phylogenetic and motif analyses were performed using the TBtools FastTree plugin and the MEME website. Chromosome localization and cis-acting element analyses were conducted using Mapchart software and the PlantCARE website. Intra- and interspecific gene collinearity analyses were conducted via the TBtools Advanced Circos and One Step MCScanX plugins. Protein-protein interaction networks and three-dimensional structure prediction analyses were conducted using the STRING database and the SWISS-MODEL website. Additionally， expression profiles of ACBPs gene were visualized using heatmaps based on FPKM values from RNA-Seq data， and relative gene expression levels were validated through qRT-PCR experiments. 【Results】 A comprehensive search of the H. rhamnoides subsp. sinensis Rousi proteome identified eight ACBPs genes， named HrLACBPs1–HrLACBPs8. Physicochemical analysis revealed that most translated protein sequences were rich in acidic amino acids， with only one being basic， and most of the proteins were localized in the nucleus. Multiple sequence alignments identified two main motifs， YKQA and KWDAW， responsible for acyl-CoA binding. Chromosomal mapping indicated that HrLACBPs4 and HrLACBPs5 were on chromosome 4， while the other six genes were on chromosomes 1， 2， 3， 5， 11， and 12. Phylogenetic analysis with the ACBPs gene families of Arabidopsis， Elaeagnus mollis Diels and Helianthus annuus divided the HrLACBPs family into three groups： Groups 1 with three members， Group 2 with one member， and Group 3 and 4 each with two members. Gene structure and motif analysis showed conserved gene structures and minimal motif differences within each group， with Group 3 containing the most exons and motif sequences. Cis-acting element analysis， focusing on hormone regulation， meristem expression， and stress response elements， revealed that the promoters of HrLACBPs members generally contained three or more of these elements. Collinearity analysis demonstrated no collinearity between HrLACBPs4 and the other seven genes， but HrLACBPs2， HrLACBPs3， and HrLACBPs5 exhibited mutual collinearity on chromosomes 2， 3， and 4. Nine collinearities were identified between the H. rhamnoides ACBPs gene family and the Arabidopsis ACBPs gene family， and seventeen with the Elaeagnus mollis Diels ACBPs gene family. Protein interaction network analysis suggested that HrLACBPs1 in H. rhamnoides may functionally resemble ACBP6 in Arabidopsis. Protein 3D structure predictions revealed that Group 3 proteins were the most complex with high model similarity; Group 1 proteins were simpler but also similar; Group 4 proteins showed low similarity and large differences. Transcriptome analysis and qRT-PCR validation indicated that， except for HrLACBPs1， the other genes had lower expression levels at 2000 mg·kg-1 lead compared to controls， while their expression increased at 5000 mg·kg-1 lead. 【Conclusion】 In H. rhamnoides subsp. sinensis Rousi， eight ACBPs were identified， with Group 1 and 3 members exhibiting conserved patterns in gene structure， motif sequences， and three-dimensional protein structures. Group 3 contained the most exons， increasing the likelihood of alternative splicing and enhancing functional diversity. The gene family’s promoter regions contain various cis-acting elements responsive to plant hormones， meristematic activity， and stress stimuli， suggesting that HrLACBPs have multiple biological functions. Protein interaction network analysis highlighted AtACBP6， from the Arabidopsis ACBP family， as a core protein that enhances plant cold tolerance when overexpressed under cold stress. Low-temperature stress response elements were also identified in HrLACBPs1， suggesting its role in enhancing plant cold tolerance. Transcriptome analysis and qRT-PCR validation showed that most ACBPs genes in H. rhamnoides were significantly downregulated at 1000 mg·kg-1 lead， with upregulation occurring at 5000 mg·kg-1. This may occur because low lead concentrations cause less oxidative stress， allowing plants to enhance antioxidant defenses by upregulating gene expression to mitigate lead damage. HrLACBPs1 expression， localized in the endoplasmic reticulum， decreased at 500 mg·kg-1 lead compared to controls， then gradually increased at 2000 and 5000 mg·kg-1. Expression of the genes in the endoplasmic reticulum may reduce to alleviate protein synthesis burden at low lead stress and may increase to address protein damage and accumulation at higher stress levels. These findings provide a solid theoretical basis for further research on H. rhamnoides’s response to heavy metal lead stress.

Key words： Hippophae rhamnoides subsp. sinensis Rousi; Bioinformatics; ACBPs gene family; Lead stress

中國沙棘（Hippophae rhamnoides subsp. sinensis Rousi），是胡頹子科沙棘屬的一種落葉性灌木或小喬木，適應能力強，廣泛生長于中國華北、西北、西南等地[1]。中國沙棘是一種具有重要經濟和生態價值的植物，果實富含多種生物活性物質，如不飽和脂肪酸、維生素C等，對人類健康具有頗多益處[2]。中國沙棘是一種重金屬富集型的植物，能夠吸收并累積土壤中的鉛等重金屬，這種特性使沙棘果實及其加工產品中重金屬含量超出了安全標準，尤其是在濃縮果汁和其衍生產品中，這種超標情況更為顯著[3]。因此，研究中國沙棘對鉛脅迫的響應機制，對中國沙棘產業的可持續發展和人類健康具有重要意義。

隨著工業高速發展，環境問題日益突出，尤其是土壤中的鉛污染問題。鉛在土壤中溶解度低，受多種因素影響，遷移能力弱，導致土壤污染加劇[4]。鉛對植物生長有顯著的負面影響，高濃度鉛會抑制植物種子中的生長分子，影響生根和發芽，導致植物衰敗或死亡[5]。鉛污染還影響植物的光合作用、水分代謝和礦物質吸收[6]。鉛污染通過食物鏈影響人體健康，過量攝入鉛會影響兒童智力發育，損害閱讀和協調能力[7]，導致胃腸問題，如食欲不振和便秘。鉛的攝入還可能引起腎組織變性和腎功能改變[8]，增加腎衰竭風險。此外，鉛對神經系統有直接毒性作用，可能引發鉛性腦病[9]。

植物對鉛的吸收主要有兩個重要途徑，第一，植物葉片的吸收和吸附；第二，植物根系吸收和轉運。植物葉片具有吸收大氣中重金屬氣溶膠的能力[10]，由于鉛在土壤中的流動性較差，且主要以非可交換態存在[11]，因此，在大氣鉛濃度較高的地區，植物通過葉片的吸附和吸收作用積累鉛的可能性，要遠大于通過根系吸收后再向地上部分轉移的可能性。鉛從大氣環境中向植物葉片內部的轉移過程與葉片的表面形態和內部結構密切相關[12]。植物葉片表皮上的角質層小孔、氣孔以及排水孔道是大氣中鉛顆粒進入葉片的關鍵途徑，而在這些途徑中，氣孔的進入效率最高[13]。

植物根系對鉛的吸收可能涉及主動和被動兩種機制。大多數植物根系通過吸收在土壤中以溶解態的形式存在的鉛[14]，鉛在植物中的遷移率相對較低，大部分被植物吸收的鉛局限于根部，只有少量的鉛被輸送到芽中，這可能是由于內胚層中卡氏帶的屏障作用，以及木質部果膠等會阻礙鉛離子的運輸[15]。鉛一旦被植物根系表面吸附，就有可能通過質外體途徑和共質體途徑兩種主要的細胞間運輸途徑，進入根的內部。質外體途徑涉及細胞壁和細胞間隙，是一個非細胞質的路徑。在質外體途徑中，鉛可能與細胞壁的多糖（如纖維素、半纖維素和果膠）相互作用，這些多糖中含有可以與鉛離子形成絡合物的官能團。質外體途徑允許鉛在細胞間隙中相對快速地移動，但最終可能需要跨越質膜進入共質體途徑以進行長距離運輸[16]；共質體途徑涉及細胞質和質膜連接的細胞間連絲。這是一個細胞內的路徑，允許分子和離子在細胞之間直接移動。對于鉛而言，共質體途徑可能涉及特定的轉運蛋白，這些蛋白可以幫助鉛穿過質膜進入細胞質，然后通過共質體途徑在細胞之間轉移[17]。

植物在鉛污染的情況下，會發生一系列的生理生化變化來響應鉛脅迫，形成耐受機制。一般來說，植物對鉛的耐受和解毒機制可通過外部屏障作用來排斥鉛的吸收，以及通過內部生理調節來增強對鉛的耐受性[5]。植物通過根系的細胞壁和角質層形成物理屏障，這些屏障能夠限制鉛離子的跨膜運輸；當植物接觸到重金屬毒性區域時，能夠通過抑制其根系的擴展，有效減少與有毒重金屬的接觸面積，進而減輕重金屬造成的損害[18]。細胞壁是鉛離子進入植物細胞的第一道防線，在植物對鉛的耐性和解毒過程中發揮著關鍵作用。細胞壁中的組分（果膠、纖維素和木質素等），含有大量的負電基團，這些負電基團可通過吸附（通過靜電作用吸附帶正電的鉛離子）、絡合（與鉛離子形成絡合物）、沉淀（與鉛離子反應生成不溶性的沉淀物）等方式與鉛離子發生相互作用，能夠有效抑制其進入植物細胞內，從而降低了鉛對植物細胞的毒性[3]。除細胞壁外，質膜作為細胞的外層界限，也為細胞提供了一個物理屏障。質膜的脂質雙分子層對大多數離子和大分子是不可滲透的，這有助于限制鉛離子的進入。同樣，質膜表面帶有負電荷（磷酸基團），這些負電荷區域能夠吸附帶正電的鉛離子，減少了鉛離子通過膜的機會。植物細胞內的液泡含有多種有機酸、蛋白質和生物堿等成分，這些能夠與鉛離子形成絡合物[19]，而植物細胞內部的液泡可以通過液泡膜上的特定轉運蛋白，如HMA（重金屬ATP酶）家族蛋白，將鉛離子泵入液泡中，從而降低其對細胞的毒性[20]。

酰基輔酶A結合蛋白（ACBPs）是一類在脂類代謝過程中起關鍵作用的蛋白質，這類蛋白含有一個高度保守的酰基輔酶A結合域（ACB），其在不同物種間保持功能上的一致性。ACB能夠與碳鏈長度介于C12至C26之間的酰基輔酶A分子結合，形成穩定的復合物，這種穩定性對確保脂肪酸代謝過程中生化反應的順利進行至關重要[21]。植物ACBPs可以在不同的組織中表達，響應非生物和生物脅迫，并被分類到不同的亞細胞位置[22]。在植物中，根據ACBPs的結構和功能，可將其分為4個主要類別：分別是只含有一個ACB域的小分子質量的ACBPs（Small ACBPs）；含有N端ACB域和C端ankyrin結構域的大分子質量ACBPs（ANK-ACBPs）；只含有一個ACB域的大分子質量ACBPs（Large ACBPs）；含有N端ACB域和C端kelch結構域的大分子質量ACBPs（Kelch ACBPs）[23]。

植物中的酰基輔酶A結合蛋白對維持細胞內脂質代謝的平衡至關重要，該蛋白能夠參與調控植物的生長和發育過程，而且還能夠響應多種生物和非生物脅迫，包括重金屬、氧化應激、低溫以及病原體的侵襲等，對植物的正常生長發育與逆境應答具有重要作用[24]。擬南芥ACBPs基因家族中的AtACBP1和AtACBP2能夠結合卵磷脂（lecithin）和酰基輔酶脂類（Acyl-CoA），并參與長鏈飽和脂肪酸的合成[25]；AtACBP1和AtACBP2被鉛離子、鎘離子、銅離子等重金屬離子脅迫時，表達水平上升，并通過與亞油酰輔酶A（linoleoyl-CoA）和亞麻酰輔酶A（linolenoyl-CoA）結合，參與到細胞膜的修復過程[26]；過表達AtACBP2可以增強擬南芥的抗旱能力[27]。此外，在水稻的研究中發現，在干旱和高鹽條件下，OsACBP4的表達量迅速升高；在種子形成的過程中，OsACBP5的表達量顯著升高，OsACBP6對傷害（如機械損傷或病理傷害）非常敏感[28]，并且是目前已知唯一定位于過氧化物酶體的ACBP。過氧化物酶體是β-氧化的唯一場所，所以此發現意味著OsACBP6可能為脂類的降解運送了底物[29]。由此可見，ACBPs基因家族在幫助植物應對生物和非生物脅迫中具有重要作用。

中國沙棘是我國及世界的重要經濟作物，目前關于中國沙棘ACBPs基因家族的信息較為缺乏，因此開展中國沙棘ACBPs基因家族的全基因組鑒定以及分析其在鉛脅迫下的表達模式和功能具有重要意義。筆者基于中國沙棘的全基因組對中國沙棘ACBPs基因家族進行鑒定，篩選出8個ACBPs基因家族成員，并對該基因家族進行生物信息學分析，以及對不同濃度鉛脅迫下的基因表達量進行分析，為初步解析中國沙棘響應重金屬鉛脅迫的分子機制，以及通過基因工程手段培育重金屬鉛低積累性的新品種提供研究基礎和分子靶標。

1 材料和方法

1.1 中國沙棘ACBPs基因家族的鑒定及基本信息

從Pfam數據庫下載ACBPs基因結構域的隱馬爾可夫文件（PF00887），從國家基因庫核酸序列歸檔系統中獲取中國沙棘的全基因組、蛋白序列和注釋文件。利用Hmmer search腳本，以e值＜0.001為標準，對中國沙棘的全基因組蛋白序列進行搜索，篩選獲得候選蛋白。隨后將候選蛋白序列文件提交至SMART數據庫和Pfam數據庫，進行進一步的保守結構域比對確認，并根據結果對中國沙棘該家族的8個成員進行命名，分別為HrLACBPs1～HrLACBPs8。利用ExPASy網站和WoLF PSORT網站，分析中國沙棘ACBPs家族蛋白的蛋白長度、相對分子質量、理論等電點，以及預測該家族成員的亞細胞定位。

1.2 中國沙棘ACBPs基因家族的多序列比對和基因結構分析

利用MEGA 7.0軟件的ClustalW功能，對下載的中國沙棘蛋白序列進行多序列比對，將對比的結果導入GeneDoc軟件分析保守結構域，并對結果進行美化。將鑒定出的8個中國沙棘ACBPs基因家族成員的序列，以及該家族成員基因進化樹的nwk文件，上傳至基因結構展示服務器（GSDS）進行可視化分析，得到中國沙棘ACBPs基因家族的基因結構和進化樹的組合圖。

1.3 中國沙棘ACBPs基因家族系統發育及Motif分析

從JGI數據庫下載擬南芥、向日葵的ACBPs蛋白序列文件，從Figshare數據庫中下載翅果油樹（Elaeagnus mollis Diels）的全基因組、蛋白序列和注釋文件，并通過ACBPs基因結構域的隱馬爾可夫文件（PF00887），篩選得出10個翅果油樹ACBPs蛋白。將中國沙棘、擬南芥、翅果油樹、向日葵4種植物的ACBPs基因家族成員的蛋白質序列放到同一個文件中，導入到MEGA 11.0軟件中進行ClustalW比對、參數默認，比對完成之后剪切差異太大的序列。利用MEFA軟件的Neighbor-Joining（鄰接法）構建多物種系統發育樹。將系統發育樹的nwk文件提交Evolview網站進行可視化分析與美化處理。利用MEGA網站，設置搜索參數為10，對該家族的蛋白保守基序（motif）進行預測，并將預測結果文件與該家族成員基因進化樹的nwk文件上傳到TBtools軟件，得到蛋白保守基序與系統發育樹的組合圖。

1.4 中國沙棘ACBPs基因染色體定位、順式作用元件分析

利用Perl腳本從中國沙棘基因組的Gff注釋文件中提取ACBPs基因家族染色體的位置信息，通過Mapchart軟件可視化，并在Adobe Illustrator中進行美化處理。從中國沙棘ACBPs基因家族中提取轉錄起始位點前2000個堿基對的DNA序列，作為啟動子區域，利用PlantCare網站，分析該家族啟動子區域的順式作用元件。

1.5 中國沙棘ACBPs基因共線性、蛋白質互作網絡分析

使用TBtools中的相關插件分析中國沙棘ACBPs基因家族的染色體長度信息、基因關聯信息以及基因在染色體上的位置，再利用Advanced Circos插件進行繪圖，得到中國沙棘ACBPs基因家族物種內的共線性，并根據擬南芥和翅果油樹的基因組文件和Gff注釋文件進行分析，得到中國沙棘與擬南芥、翅果油樹ACBPs基因家族物種間的共線性。通過String數據庫確定中國沙棘ACBPs基因家族與擬南芥中相應基因之間的蛋白互作關系。獲得互作關系后，利用Cytospace軟件對蛋白互作網絡進行可視化處理，得到蛋白互作網絡。

1.6 中國沙棘ACBPs蛋白三維結構預測

采取同源建模（homology modeling）的方法對蛋白質的三維結構進行預測，相似的氨基酸序列對應著相似的蛋白質結構，利用在線工具SWISS-MODEL，找到與目標序列同源的已知結構作為模板（目標序列與模板序列的一致度至少要達到30%），選定好蛋白質模型下載PDB文件，然后提交至SAVES網站進行測評（提供5個軟件的評估結果），其中有3個顯示通過即表示預測結果可信度較高。進行上述生物信息學分析的在線工具網址如表1所示。

1.7 中國沙棘ACBPs基因家族轉錄組分析和qRT-PCR驗證

選取生長狀況良好的中國沙棘幼苗，并對其進行不同濃度的硝酸鉛脅迫：對照組（不含硝酸鉛）、500、1000、2000、5000 mg·kg-1，脅迫4周。使用DP452型號的RNA提取試劑盒（由天根公司提供）提取幼苗中的總RNA。將中國沙棘幼苗送至武漢邁特維爾生物科技有限公司，進行RNA-Seq測序。根據測序結果，基于ACBPs基因的FPKM值（每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的fragments），使用TBtools軟件繪制表達量熱圖，以展示基因表達的變化。

使用天根KR118試劑盒進行反轉錄得到cDNA。針對HrLACBPs家族的8個基因，通過上海生工生物工程股份有限公司合成特異性引物（表2）。選用微管蛋白（TUBULIN）作為內參基因，采用SYBR Green（FP215，天根）染料進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析，試驗的反應體系為20 μL，每個樣品進行3次重復試驗。使用2-ΔΔCt計算中國沙棘ACBPs基因家族的相對表達量，并使用GraphPad prism軟件對qRT-PCR結果進行可視化。

2 結果與分析

2.1 中國沙棘ACBPs基因家族的鑒定及基本信息

通過生物信息學方法對中國沙棘ACBPs基因家族進行鑒定，得到8個ACBPs基因家族成員，并對其編碼的蛋白質的理化性質進行分析，結果見表3。蛋白質的長度范圍為71 AA（HrLACBPs3）～677 AA（HrLACBPs7）；蛋白質分子質量為7995.1 Da（HrLACBPs3）～74498.7 Da（HrLACBPs7）；其理論等電點介于4.22（HrLACBPs4）～7.53（HrLACBPs5）之間，其中堿性氨基酸（pI＞7）較少，只有一個（HrLACBPs5），剩余7個均為酸性氨基酸。根據亞細胞定位預測分析，中國沙棘ACBPs基因家族蛋白質的分布也呈現多樣性。HrLACBPs1定位在內質網，HrLACBPs3定位在細胞質，HrLACBPs4定位在葉綠體，而其他蛋白質則定位于細胞核。

2.2 中國沙棘ACBPs基因家族的多序列比對和系統發育

在先前的研究中，ACBPs基因家族中的兩個保守基序YKQA和KWDAW被認為是結合酰基輔酶A酯的必要基序。多重序列比對分析表明（圖1），8個ACBPs的氨基酸序列中也發現了這兩個保守基序。

通過構建系統進化樹對中國沙棘（8個）、擬南芥（6個）[28]、翅果油樹（10個）、向日葵（8個）[30]的ACBPs蛋白序列進行系統進化分析，結果表明，這些植物中的ACBPs蛋白可根據系統發育樹的分支情況分為四大類（Group1～Group4）（圖2）。在各個類別中，ACBPs蛋白的成員數量存在差異。Group1含有3個中國沙棘ACBPs成員，Group2中含有1個中國沙棘ACBPs成員，Group3和Group4中都含有2個中國沙棘ACBPs成員。同時，通過系統樹可以發現翅果油樹的evm.model.LG01.147單獨分為了一類，通過進一步的理化性質分析，發現該蛋白在翅果油樹的10個ACBPs蛋白中等電點最低，為酸性蛋白質，猜測該蛋白可能進化出了新的功能，具體功能尚需進一步研究。

2.3 中國沙棘ACBPs基因家族基因結構及Motif分析

中國沙棘ACBPs基因家族的基因結構分析表明（圖3），中國沙棘8條ACBPs基因均含有外顯子結構，其中Group3中所含外顯子數量最多，均為18個外顯子；Group2的HrLACBPs4含有外顯子數量最少，僅有2個；Group1中成員的外顯子數量為3～4個。由此可見，位于同一類別中的HrLACBPs家族成員的外顯子數量接近，呈現高度的序列相似性和保守性。

為進一步了解中國沙棘ACBPs基因家族的特征，對ACBPs家族蛋白的Motif序列進行分析。分析結果表明（圖4），HrLACBPs家族編碼蛋白的10個Motif序列中，親緣關系較近的成員之間的Motif序列的位置分布更相似。所有的HrLACBPs成員都存在Motif1，表明Motif1在ACBPs基因家族中具有重要作用。此外，HrLACBPs6和HrLACBPs7缺失了Motif7序列，而在HrLACBPs2和HrLACBPs5均含有兩個Motif7序列，這表明了HrLACBPs家族基因在功能上也存在一定的差異。

2.4 中國沙棘ACBPs基因染色體定位和順式作用元件分析

中國沙棘ACBPs基因家族染色體定位結果表明（圖5），中國沙棘8個ACBPs基因分布于7條不同的染色體上，其中HrLACBPs5和HrLACBPs4位于4號染色體上，剩余6個基因分別位于1號、2號、3號、5號、11號、12號染色體上。

對中國沙棘ACBPs基因家族順式作用元件進行分析（圖6），重點選取了激素調控、分生組織表達和脅迫應激相關的調控元件。其中激素調控相關的順式作用元件主要包括4種類型：促進植物響應脫落酸信號的ABRE元件、與水楊酸信號轉導相關的TCA-element元件、參與生長素信號轉導的TGA-element元件，以及與茉莉酸甲酯信號相關的TGACG-motif元件；植物體內的基因表達調控也涉及到4種特定的順式作用元件：與低溫脅迫反應相關的LTR元件、脅迫響應元件STRE、涉及防御機制和應激反應的TC-rich元件，以及與傷害信號相關的WUN-motif元件；還有一類與分生組織特異性表達密切相關的順式作用元件，即CAT-box元件。

筆者所選取的9種順式作用元件在HrLACBPs基因家族成員的分布中呈現差異性。具體來說，HrLACBPs8含有最多的響應元件，共計10個；而HrLACBPs3最少，僅有2個。從響應元件的類型來看，HrLACBPs家族成員普遍包含3種或以上的元件。由此推測HrLACBPs家族成員可能具有多重生物學功能。在HrLACBPs1中發現含有與低溫脅迫反應相關的元件（LTR），這表明HrLACBPs1與AtACBP6類似，也可能參與響應低溫脅迫，提高植物對低溫的耐受性[31]。

2.5 中國沙棘ACBPs基因共線性、蛋白質互作網絡分析

通過中國沙棘ACBPs基因家族物種內共線性分析結果表明（圖7），在chr1、chr2、chr3、chr4、chr5、chr11和chr12上各分布有一些具有共線性的ACBPs基因，分別是定位在chr1和chr12上的HrLACBPs1和HrLACBPs8；定位在chr5和chr11上的HrLACBPs6和HrLACBPs7以及定位于chr2、chr3和chr4上的HrLACBPs2、HrLACBPs3和HrLACBPs5三個基因互有共線性。HrLACBPs4與其他7個基因均沒有共線性。中國沙棘ACBPs基因家族共線性分析結果表明，chr2、chr3和chr4之間存在較密切的共線性關系。

進一步構建中國沙棘ACBPs基因家族和擬南芥、翅果油樹的共線性分析（圖8），結果表明，中國沙棘ACBPs基因家族與擬南芥ACBPs基因家族之間存在9條共線性，而與中國沙棘同為胡頹子科的翅果油樹ACBPs基因家族之間存在17條共線性，分析發現，中國沙棘與翅果油樹ACBPs同源基因的數量要顯著多于中國沙棘與擬南芥ACBPs同源基因的數量，反映了胡頹子科ACBPs基因家族在進化過程中的保守性和相似性。

基于擬南芥與中國沙棘蛋白的同源性，利用String數據庫，進行HrLACBPs家族蛋白的互作分析。根據Cytoscape中的degree值篩選出核心蛋白，如圖9所示，圓圈內顏色的深淺代表不同互作強度，顏色深，代表與核心蛋白互作強度大，顏色淺，代表與核心蛋白互作強度小；圓圈之間的線條表示蛋白之間存在互作關系。根據結果可以看出，核心蛋白為擬南芥ACBPs基因家族的ACBP6，而ACBP6在冷脅迫下的應答中起重要作用，其過表達能夠增強植物的耐冷性。在冷脅迫條件下，ACBP6可能通過調控與冷脅迫相關的基因表達，參與脂類代謝中卵磷脂的轉運，修復受損的細胞膜，從而提高植物對低溫的耐受性[32]，而中國沙棘ACBPs基因家族中HrLACBPs1也存在低溫脅迫的順式作用元件。這表明中國沙棘的HrLACBPs1可能在低溫脅迫響應中起重要作用，與擬南芥ACBPs基因家族的ACBP6在功能上可能存在一定的相似性或相互作用。

2.6 中國沙棘ACBPs蛋白三維結構預測

基于同源建模原理，對中國沙棘ACBPs基因家族進行了蛋白三維結構預測，結果表明（圖10），Group3中的蛋白結構最為復雜，且結構模型相似度較高；Group1中的蛋白氨基酸序列較短且結構相對簡單，主要由α螺旋組成，同時伴有一些β轉角，這些蛋白的結構模型也展現出較高的相似性；Group2的HrLACBPs4，蛋白結構模型也較為簡單，相較于Group1中的蛋白模型，具有更多的α螺旋；Group4中的蛋白模型相似度較低，HrLACBPs1存在一條長而彎曲的鏈狀結構。這表明中國沙棘ACBPs基因家族在進化過程中發生了一定程度的變異和分化，也暗示ACBPs基因在功能上具有一定的多樣性。

2.7 中國沙棘ACBPs基因家族轉錄組分析和qRT-PCR驗證

選取生長狀況良好的中國沙棘幼苗，并對其進行不同濃度的硝酸鉛脅迫，脅迫4周后，將中國沙棘幼苗送至武漢邁特維爾生物科技有限公司，進行RNA-Seq測序。中國沙棘ACBPs基因家族測序結果表明（圖11），HrLACBPs家族成員在鉛脅迫條件下，表達量均發生了不同程度的變化。與對照相比，HrLACBPs1在低濃度鉛脅迫（500～1000 mg·kg-1）時，表達量下降，但在高濃度鉛脅迫（2000～5000 mg·kg-1）時，表達量上升；HrLACBPs2、HrLACBPs3、HrLACBPs5、HrLACBPs6以及HrLACBPs8在鉛脅迫濃度為500～2000 mg·kg-1時，表達量下調，但在鉛脅迫為5000 mg·kg-1下的表達量相對升高；HrLACBPs4隨著鉛脅迫濃度的升高，表達量呈先升高后下降的趨勢。

qRT-PCR的驗證結果（圖12）與轉錄組表達分析的結果基本一致。除了HrLACBPs1外，其他基因在與同基因其他樣本的對比中，在鉛脅迫濃度為2000 mg·kg-1下的表達量均較低，甚至HrLACBPs2和HrLACBPs3在Pb2000濃度時幾乎不表達；而HrLACBPs家族基因在鉛脅迫濃度為5000 mg·kg-1時相對表達量均會升高。通過分析可以推測中國沙棘面臨重金屬鉛脅迫時，HrLACBPs基因家族的成員有不同的表現，都可以在一定程度上響應重金屬鉛離子脅迫。

3 討 論

目前，在已知的植物ACBPs基因家族的研究中發現，除了一些多倍體植物ACBPs基因家族數量較多外，例如，陸地棉（24個）、白菜（20個）、歐洲油菜（45個）等，二倍體植物ACBPs基因家族數量較少，例如，毛果楊（7個）、擬南芥（6個）、水稻（6個）、高粱（5個）、玉米（5個）等[32]。筆者在本研究中對二倍體植物中國沙棘的ACBPs基因家族進行篩選得到8個基因，與其他二倍體植物ACBPs基因家族的數量總體相近。

根據系統發育關系可將中國沙棘ACBPs基因家族分為4組。根據基因結構分析的結果，發現中國沙棘ACBPs家族中Group3的成員含有最多的外顯子數量，這一特征可能增加了選擇性剪接的發生概率，進而增加了ACBPs基因家族功能的多樣性[33]。順式作用元件對許多生物過程和應激反應至關重要[34]，在順式作用元件的分析結果中發現，在大多數HrLACBPs啟動子區域中發現了參與對傷害信號、水楊酸和脫落酸信號響應的元件。

亞細胞定位預測結果表明，中國沙棘ACBPs蛋白主要定位在細胞核中，在細胞質、葉綠體、內質網中也有分布。這表明HrLACBPs家族成員可能參與調控基因表達、脂質的代謝和轉運、中長鏈酰基輔酶A（acyl-CoA）的轉運以及葉綠體生物膜的修復和維持等。此外，已有的研究表明，擬南芥ACBPs家族成員蛋白多數定位于細胞質，在水稻中，ACBPs家族成員可定位于細胞質與內質網以及定位于過氧化物酶體的OsACBP6[29]。

轉錄組表達分析與qRT-PCR檢測結果表明，與對照（0 mg·kg-1）相比，HrLACBPs家族的大部分基因在鉛濃度為500 mg·kg-1時表達量相對上升，在1000與2000 mg·kg-1時表達量大幅度下降，而在5000 mg·kg-1時表達量上升。這可能是由于低濃度的鉛脅迫（500 mg·kg-1）對植物造成的氧化應激較小，植物可以通過增強基因的表達量，進而增強植物的抗氧化防御機制，從而增強對鉛的耐受性[35]；而隨著鉛脅迫濃度增加到1000～2000 mg·kg-1時，可能會超過植物對鉛的耐受閾值，導致植物無法響應高濃度的鉛脅迫，因此基因的表達量會大幅度降低[36]；但在極高濃度的鉛脅迫（5000 mg·kg-1）下，植物可能會啟動另一種響應機制，包括重金屬的隔離、儲存或排出，以及修復受損細胞結構的基因上調[37]，導致基因的表達量上升。此外，定位于內質網的HrLACBPs1在低濃度鉛脅迫（500 mg·kg-1）時的表達量相較于對照有所下降，而在2000與5000 mg·kg-1時表達量逐漸上升。這表明基因表達的變化可能還與他們在細胞內的位置有關。定位于細胞核的基因，可能主要參與調控應激反應的轉錄調控因子或信號轉導分子，而定位于內質網的基因，可能與蛋白質的折疊、修飾和運輸以及脂質合成、加工和運輸有關。而HrLACBPs1表達量的不同，可能是因為內質網在感知到較低濃度的鉛脅迫時，會減少基因的表達以減少蛋白質的合成負荷，在更高濃度脅迫時，則可能提高表達量以應對蛋白質損傷的積累。上述解釋是基于一般生物學原理和已有的科學研究提出的假設，如果要準確解釋這些qRT-PCR分析結果，還需要更詳細的試驗數據和更深入的分子機制研究。

4 結 論

中國沙棘基因組中鑒定到8個HrLACBPs基因，不均勻分布在7條染色體上，這些基因分為4個類別且大部分基因預測定位于細胞核中；同一類別家族成員基因結構與Motif序列相似；Group1的基因成員之間具有較高的共線性；相比于擬南芥ACBPs基因家族，中國沙棘ACBPs基因家族與翅果油樹ACBPs基因家族表現出更高的共線性；蛋白質三維結構預測結果表明，中國沙棘ACBPs基因家族同一類別的成員三維結構相似；不同濃度重金屬鉛離子脅迫下的轉錄組分析表明，8個HrLACBPs基因在不同濃度的鉛脅迫條件下存在表達差異，可能通過不同的分子機制響應重金屬鉛離子脅迫。

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