新疆北疆部分棉區(qū)落葉型棉花黃萎病菌落形態(tài)特征及致病力鑒定

摘 要：【目的】分析新疆北疆地區(qū)棉花黃萎病的致病力及其分化現(xiàn)狀，以昌吉市、沙灣市為主，鑒定兩地收集的棉花黃萎病的形態(tài)特征及致病力。

【方法】利用棉花落葉型黃萎病的特異性引物DB19f/DB22r和非落葉型引物INTND2f/INTND2r對所有菌株的致病力進(jìn)行分子鑒定，并進(jìn)行全基因組重測序，以SNP 位點(diǎn)作為標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析，并利用顯微鏡觀察菌落、菌絲和孢子形態(tài)，以強(qiáng)致病力菌種V991作對照，觀察菌落形態(tài)和致病力鑒定，采用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)比較觀測具有強(qiáng)致病力的Vd-3和V991的病情變化圖像和熒光參數(shù)變化趨勢。

【結(jié)果】14個菌株均為落葉型。其菌落為圓形，菌絲的輪枝數(shù)為2，孢子形態(tài)為長卵圓形。與V991相比，Vd-3的病情指數(shù)最高，屬強(qiáng)致病力的菌株，其對棉花具有明顯不同的侵染方式和速度，Vd-3的侵染從葉緣到葉片中央，而V991的侵染是從葉肉部分的零星發(fā)病擴(kuò)展到葉緣，再發(fā)展到中央部分，并且Vd-3侵染葉片各熒光成像和參數(shù)天變化趨勢更為顯著，其中非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y（NO）和非光化學(xué)淬滅NPQ4在第6 d即到變化拐點(diǎn)，最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm和實(shí)際光量子產(chǎn)量Y（Ⅱ）則變化緩慢，13 d 時Fv/Fm表現(xiàn)明顯差異。

【結(jié)論】昌吉市、沙灣市兩地的大麗輪枝菌均為落葉型，圓形菌落，菌絲輪枝數(shù)是2，長卵圓形孢子，Vd-3不僅為遺傳距離最遠(yuǎn)且變異性大的菌株，而且為最強(qiáng)致病力的黃萎病病株，與V991相比，對棉花具有不同的侵染方式，熒光參數(shù)Y（NO）和NPQ變化更為敏銳。

關(guān)鍵詞：致病力；葉綠熒光成像；棉花黃萎病；全基因組重測序

中圖分類號：S435.1 ""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-4330（2025）01-0174-08

收稿日期（Received）：

2024-07-27

基金項(xiàng)目：

新疆維吾爾自治區(qū)重大專項(xiàng)“新疆主要農(nóng)作物創(chuàng)新育種工程-子課題機(jī)采棉新品種培育及技術(shù)示范”（2021A02001-4）

作者簡介：

賴成霞（1972-），女，新疆烏魯木齊人，副研究員，研究方向?yàn)槊藁鼓娣肿佑N，（E-mail）lchxia2001@163.com

通信作者：

馬君（1983-），男，甘肅民勤人，副研究員，研究方向?yàn)槊藁ǚN質(zhì)資源收集與利用，（E-mail）xj.majun@163.com

0 引 言

【研究意義】大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb）是引起新疆棉花黃萎病的主要因素［1］，可導(dǎo)致棉花落葉、發(fā)育遲緩和產(chǎn)量損失及纖維品質(zhì)的急劇下滑，寄主棉花也相應(yīng)形成一系列的復(fù)雜生理生化機(jī)制抵御大麗輪枝菌的侵染［2］，當(dāng)病原菌侵染植物后，大麗輪枝菌的小孢子和菌絲不僅僅能在棉花的維管系統(tǒng)中定殖、繁衍，與寄主植物發(fā)生養(yǎng)分和水分等競爭，還能釋放毒素［3］和誘導(dǎo)寄主棉花產(chǎn)生免疫反應(yīng)［4］等復(fù)雜機(jī)制來影響棉花的生長發(fā)育的，包括修飾寄主角質(zhì)層組織結(jié)構(gòu)［5-6］、形成抗菌物質(zhì)［7］、穩(wěn)定活性氧（ROS）［8］、傳導(dǎo)激素信號［9］等。2021年新疆棉花黃萎病的發(fā)病面積占總面積的50%以上，重病田達(dá)6.67×104 hm2（100萬畝）［10］，自2004年起新疆北疆地區(qū)棉花黃萎病的發(fā)生就呈現(xiàn)逐年激增態(tài)勢［11-12］，2023年調(diào)查北疆棉田土壤發(fā)現(xiàn)是以菌核型大麗輪枝菌為主，并且強(qiáng)致病性菌株占調(diào)查菌株的94.12%以上［13］。由于新疆北疆棉區(qū)土壤生理環(huán)境跨度大，差異明顯，黃萎病病原菌呈現(xiàn)多樣性、變異性特點(diǎn)。致病力分化已成為該病反復(fù)猖獗危害的主要原因［14-15］。針對性研究黃萎病的致病分化特性，對棉花的抗病育種及精準(zhǔn)防治具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】新疆北疆地區(qū)的棉花黃萎病致病力分化現(xiàn)象一直被監(jiān)測中［11-15］，新疆黃萎病致病力存在強(qiáng)、中、弱3種致病類型，并發(fā)現(xiàn)存在落葉型黃萎病，并且中等致病力的黃萎病菌株占比大，北疆大部分棉田病株的黃萎病病原菌的強(qiáng)致病力菌株占比已高達(dá)76.5%，并且通過對北疆棉田的土壤中的微菌核進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)落葉型黃萎病在所調(diào)查菌落中占97.6%。【本研究切入點(diǎn)】目前大麗輪枝菌引起的棉花黃萎病已成為新疆北疆地區(qū)棉花安全生產(chǎn)的障礙性因素，培育抗病品種是最經(jīng)濟(jì)、有效的策略。因大麗輪枝菌病菌的致病力分化速度快且強(qiáng)，需針對性研究新疆北疆棉花黃萎病致病力分化及為害狀態(tài)。【擬解決的關(guān)鍵問題】以昌吉市、沙灣市為主，對兩地收集的棉花黃萎病的致病特性、形態(tài)特征、致病力及侵染方式進(jìn)行鑒定。針對性研究當(dāng)前強(qiáng)致病性的大麗輪枝菌與以往大麗輪枝菌的致病分化狀態(tài)，揭示當(dāng)前大麗輪枝菌對棉花致病性，為有效選育抗病品種及黃萎病的綜合防治提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病原菌

Vc-1～Vc-4 大麗輪枝菌株來自昌吉市，Vd-1～Vd-10菌株來自沙灣市。對照菌株V991（Verticillium daliae Kleb）來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物學(xué)院朱龍付課題組。

1.1.2 供試藥劑及農(nóng)藥

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（Potato dextrose，PD）英國Oxoid公司）。100 bp DNA ladder，Golden View，瓊脂糖，Tris，冰乙酸等

1.1.3 黃萎病致病力分子鑒定

對獲得的各菌落利用PCR技術(shù)進(jìn)行分子鑒定：落葉型引物［16］為DB19f：5′-CGGTGACATAATACTGAGAG-3′，DB22r：5′-GACGATGCGGATTGAACGAA-3′，非落葉型引物［17］為INTND2f： （5′-CTCTTCGTACATGGCCATAGATGTGC-3′），INTND2r： （5′-CAATGACAATGTCCTGGGTGTGCCA-3′）

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

培養(yǎng)棉花黃萎病菌絲的固體培養(yǎng)基是馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的配制：39 g PDA干粉加入進(jìn)1 L水中，完全煮沸溶解后，121℃高壓滅菌15 min，再倒板；觀察孢子形態(tài)、大小的是液體查氏（Czapek）培養(yǎng)基：1 L水中含有20 g蔗糖，2 g NaNO3 ，1 g K2HPO4·3H2O ，0.5 g KCl ，0.5 g MgSO4·7H2O ，0.01 g FeSO4·7H2O，121℃高壓滅菌15 min。

1.2.2 菌種鑒定的PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件

菌種鑒定采用加熱裂解法，用槍頭挑取少量菌絲，到如下PCR管中，并以DB19f和DB22r作為鑒定落葉型黃萎病的引物對，以INTND2f和INTND2r作為鑒定非落葉型黃萎病的引物對，進(jìn)行如下PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件：95℃， 預(yù)變性5 min；95℃ 變性1 min，54℃ 退火1 min，72℃ 延伸30 s；執(zhí)行35循環(huán)，72℃ 延伸10 min；4℃ 保存。

1.2.3 全基因組測序

收集14份新疆北疆大麗輪枝菌，沙灣市的菌系被命名為Vd1～10，昌吉市的被命名為Vc1～4，菌樣送至北京百邁克生物科技有限公司進(jìn)行文庫制備與高通量測序。利用Bwa-mem2（v2.2）軟件將測序后的數(shù)據(jù)比對到參考基因組上，比對結(jié)果采用samtools flagstat/depth等命令計算比對效率、測序深度及覆蓋度等信息。采用 GATK軟件工具包實(shí)現(xiàn)對 SNP/InDel 檢測，使用samtools（v1.9）過濾冗余，并使用百邁客云平臺對 SNP 的深度為10的數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳多樣性分析，采用鄰位相接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstrap method 1 000 次）。

1.2.4 棉花黃萎病在離體葉片的致病力鑒定

離體葉片致病力鑒定依據(jù)賴成霞［13］等研究鑒定，選擇大小一致的新陸早57號棉花花期倒三葉的葉片，剪下葉片后用吸滿水分的棉絮放在葉柄處保濕，并進(jìn)行消毒處理，即70%乙醇中處理30 s，再用滅菌去離子水沖洗2次，用濾紙吸干葉片表面的水滴后，用無菌剪刀將葉柄剪去1 cm，然后插入含有1.5 mL菌液的離心管侵染40 min。每個菌系進(jìn)行6個重復(fù)，侵染結(jié)束拿出葉片用濾紙吸干表面菌液，插入帶有1.5 mL滅菌水的離心管，放入25℃溫室中弱光培養(yǎng)，培養(yǎng)13 d 。

采用熱裂解法，利用落葉型引物DB19f/DB22和非落葉型引物INTND2f/INTND2r對從從采自昌吉市的4株棉花黃萎菌（Vc-1、Vc-2、Vc-3、Vc-4） 和沙灣市的 10 株棉花黃萎病菌（ Vd-1～Vd-10 ） 及落葉型標(biāo)準(zhǔn)菌株 V991進(jìn)行致病力分子鑒定。

1.2.5 棉花黃萎病大麗輪枝菌菌落形態(tài)和顯微觀察

生長在PDA培養(yǎng)基上15 d的孢子和菌絲用水洗脫下進(jìn)行顯微觀察，統(tǒng)計孢子的形狀和大小；蓋玻片斜插至菌餅前方，待菌絲生長至蓋玻片上，顯微觀察菌絲形態(tài)。

1.2.6 葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)對棉花黃萎病病原菌侵染葉片成像過程的采集

利用葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)采集棉花黃萎病原菌侵染離體葉片，棉花葉片暗處理30 min后，設(shè)定5～6個興趣點(diǎn)AOI后，在軟件的Kinetics窗口執(zhí)行的動力學(xué)變化曲線檢測，結(jié)果從Report窗口導(dǎo)出。選用Fv/Fm（光系統(tǒng)II最大光量子產(chǎn)量）、Y（Ⅱ）（光系統(tǒng)II實(shí)際光量子產(chǎn)量）、NPQ（非光化學(xué)淬滅）、Y（NO）（非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量）等葉綠素?zé)晒鈪?shù)作為對病害侵染的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

1.2.7 病情指數(shù)

采用全面調(diào)查法，統(tǒng)計棉花黃萎病葉片發(fā)病情況，計算病情指數(shù)，分級標(biāo)準(zhǔn)：葉片無病斑，0級；病斑占整個葉面積的5%以下，1級；病斑占整個葉面積的6%～11%，3級；病斑占整個葉面積的11%～20%，5級；病斑占整個葉面積的21%～50%，7級；病斑占整個葉面積的51%以上，9級；死亡，11級。

病情指數(shù)=∑（極值×株數(shù)）最高極值×總株數(shù)100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用Origin2018 軟件和Sigmaplot14.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析作圖，圖片利用Photoshop 2017進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花黃萎病致病力分子鑒定

研究表明，利用DB19f/DB22引物對均可從15個菌落中擴(kuò)增出500 bp目的條帶，而INTND2f/INTND2r對則無任何產(chǎn)物被擴(kuò)增出，14個大麗輪枝菌株和V991一樣均為落葉型。圖1

2.2 遺傳多樣性

研究表明，當(dāng)遺傳距離大于 0.001 時，14 份大麗輪枝菌株被聚為 4 類，類群I有2個菌株，包括Vd-5和Vd-9，類群II有1個菌株，Vd-3，類群III有8個菌株，包括Vd-1、Vd-2、Vd-4、Vd-6、Vd-8和Vd-10，類群IV有3個菌株，包括Vd-4，Vd-7和Vc2，其中，類群I和類群II，類群III和類群IV的相似度比較高，結(jié)合 14 份菌株的來源，沙灣市和昌吉市兩地的大麗輪枝菌遺傳背景比較接近，僅有少數(shù)遺傳距離稍遠(yuǎn)，且變異性大的菌株Vd-3分布在沙灣市。圖2

2.3 菌落形態(tài)及顯微觀察

研究表明，15株大麗輪枝菌的菌落形態(tài)為圓型，孢子為長卵圓形，各菌落菌絲均含有2個。表1，圖3

2.4 致病力鑒定

研究表明，所調(diào)查的15個菌株侵染棉花葉片10 d后，其致病力表現(xiàn)明顯不同，病情指數(shù)在35以下的菌株有3株，分別為Vd-1、Vd-4、Vd-7；病情指數(shù)在35～60之間的菌株有8株，分別為Vc-2、Vc-3、Vc-4、Vd-2、Vd-6、Vd-8、Vd-9和Vd-10；病情指數(shù)在60-70的菌株有2株，分別為Vc-1和Vd-5，病情指數(shù)在70以上的菌株有2株，分別為V991和Vd-3。其致病力大小的順序?yàn)閂d-3gt;V991gt;Vc-1=Vd-5gt;Vc-2gt;Vd-8=Vd-9=Vd-10gt;Vc-3gt;Vd-10gt;Vd-2gt;Vc-4gt;Vd-4=Vd-7。圖4

2.5 接種典型菌株后的棉株葉片外觀及葉綠熒光成像變化特征

研究表明，2個菌侵染10 d時才出現(xiàn)病癥，而葉綠素?zé)晒鈪?shù)YII、NPQ4則在第6 d就有變化，其中Vd-3的Y（II）、NPQ4顯示病癥的發(fā)展是由葉緣至葉片中央蔓延，隨著侵染天數(shù)的增加，到第13 d，NPQ4、YII熒光參數(shù)顯示的發(fā)病面積分別占整個葉片面積的90%和80%以上，而V991的Y（II）、NPQ4病癥蔓延的方向?yàn)橄热~肉零星分布，再葉緣，最后由葉緣向葉片中央蔓延，并且到第13 d，NPQ4、YII熒光參數(shù)顯示的發(fā)病面積分別占整個葉片面積的85%和50%以上，V991與Vd-3發(fā)病程度、感染方式具有差異性。熒光參數(shù)NPQ4和Y（NO）更能敏銳地反應(yīng)病原菌的侵染狀態(tài)。圖5

2.6 典型菌株侵染后的葉綠素?zé)晒鈪?shù)動力學(xué)曲線變化

研究表明，隨著侵染時間的增加，Vd-3和V991侵染引發(fā)的葉片各熒光參數(shù)均有明顯變化，其中Vd-3的葉綠素?zé)晒鈪?shù)NPQ4和Y（NO）到達(dá)拐點(diǎn)的時間為6 d，而V991 2個參數(shù)到達(dá)拐點(diǎn)的時間則為10 d，Vd-3比V991對植物的侵染更為嚴(yán)重。并且隨著侵染時間的增加，F(xiàn)v/Fm、Y（II）、NPQ4均隨時間延長而下降，Vd-3的Fv/Fm數(shù)值在第12～13 d時大幅度下降，發(fā)病情況非常嚴(yán)重。V991則較為緩慢，發(fā)病也趨于平緩。侵染Vd-3的葉片發(fā)病程度比V991高，F(xiàn)v/Fm曲線是判定葉片發(fā)病嚴(yán)重與否的一個重要標(biāo)志。Y（II）中熒光值V991一直在Vd-3的曲線上方，2者熒光參數(shù)變化不大，且下降規(guī)律相同。根據(jù)葉綠熒光成像顯示，葉片也在同一時間發(fā)生癥狀，兩者互相印證。兩者NPQ4的數(shù)值總體先上升后下降，NPQ4數(shù)值下降至接近0，大麗輪枝菌對棉花葉片的侵染逐漸增大。葉綠素?zé)晒獬上駝恿W(xué)曲線能夠清晰反應(yīng)植物受病害脅迫程度，與V991相比，Vd-3的熒光參數(shù)Y（NO）和NPQ變化更為敏銳感知病原菌入侵的狀態(tài)。圖6

3 討 論

3.1

精準(zhǔn)分析新疆北疆黃萎病菌的致病力分化特點(diǎn)，可有效實(shí)現(xiàn)針對性的抗病品種選育及防治藥劑篩選［18］，

昌吉市和沙灣市是新疆北疆棉花的重要種植區(qū)，以V991為對照，對來自兩地共14個菌落從菌落形態(tài)、致病力、侵染方式等維度去解析其致病機(jī)制。首先，利用PCR技術(shù)從分子水平上鑒定了14個菌均為落葉型黃萎病，通過觀察北疆地區(qū)落葉型棉花黃萎病菌的菌落形態(tài)與已報道的落葉型菌落形態(tài)存在明顯差異，尤其明顯的是不具有菌絲團(tuán)的特征。基因組重測序分析顯示Vd-3為遺傳距離最遠(yuǎn)，變異最大的菌株，并且離體葉片致病力鑒定也表明致病力最強(qiáng)的病原菌是Vd-3，而V991是自1995年開始一直被認(rèn)為是發(fā)病最重的落葉型棉花黃萎病菌，而目前發(fā)現(xiàn)沙灣市菌系Vd-3發(fā)病情況與V991的明顯不同，盡管兩者病指均處于高位，但Vd-3發(fā)病表現(xiàn)更快，其發(fā)病部位首先由葉尖、葉緣開始而后迅速發(fā)展乃至焦枯死亡。并且葉綠素?zé)晒獬上窈蜔晒庵底兓脖砻鳎浒l(fā)病最嚴(yán)重且迅猛。

3.2

棉花早預(yù)防、早治療是防治棉花黃萎病的有效方式，基于植物葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)的無損檢測方式和其準(zhǔn)確性、效率性的特點(diǎn)，目前其也已成為植物抗病育種［19-20］和病害監(jiān)測［21-22］的一種有效輔助手段。在研究中各葉綠素?zé)晒鈪?shù)在13 d的變化趨勢中，Vd-3與V991相比，Vd-3的葉綠素?zé)晒鈪?shù)NPQ4和Y（NO）到達(dá)拐點(diǎn)的時間為6 d，而V991的2個參數(shù)到達(dá)拐點(diǎn)的時間則為10 d ，說明NPQ4和Y（NO）2個熒光參數(shù)更能敏銳感知棉花入侵過程，可作為該菌侵染的快速檢測指標(biāo)。

4 結(jié) 論

昌吉市、沙灣市兩地的大麗輪枝菌均為落葉型，其菌落類型為菌核型和孢子型，Vd-3是為害程度最大，發(fā)病速度最快的黃萎病菌，與V991相比，具有不同的侵染方式，Vd-3的侵染從葉緣到葉片中央，而V991的侵染是從中央葉肉部分的零星發(fā)病擴(kuò)展到葉緣，再發(fā)展到葉片中央部分，并且熒光參數(shù)NPQ4和Y（NO）更能敏銳地反應(yīng)Vd-3的侵染。

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Pathogen colony’s morphological characteristics and

pathogenicity identification of defioating cotton Verticillium

wilt in some areas in northern Xinjiang

LAI Chengxia1， YANG Yanlong1，WANG Penglong1， ZHU Mengyu2，

YANG Dong3， LI Chunping1，GE Fengwei4， Mayila Yusuyin1，

YANG Ni1，MA Jun1

（1. Research Institute of Economic Crops， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091， China; 2. College of Agriculture， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830091， China; 3. Plant Protection Station of Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830049， China; 4.College of Life Sciences， Xinjiang Normal University， Urumqi 830054， China）

Abstract：【Objective】 To identify morphological characteristics and pathogenicity of cotton Verticillium wilt collected from Changji and Shawan in the hope of comprehending the pathogenicity and differentiation of the cotton disease in northern Xinjiang.

【Methods】" The molecular detections of the pathogenicity for cotton wilt disease were performed using specific primers DB19f/DB22r for defioating pathotype and INTND2f/INTND2r for nondefioating pathotype. Whole genome resequencing was performed using SNP loci as markers for genetic diversity analysis. The colony morphology and the pathogenicity were identified adopting the virulence strain V991 as the control， chlorophyll fluorescence imaging technology was employed to compare and observe the disease changes and the trend of fluorescence parameters of Vd-3 and V991.

【Results】 Molecular identification showed that all 14 strains examined were defioating pathotype. In comparison with V991 strain， Vd-3 exhibited the highest disease index and high pathogenicity with different infection modes and rapid infection rates; The infection of Vd-3 was seen that the disease symptom extended from the leaf margin to the center， while the that of V991 spread from the sporadic distribution of the mesophyll to the leaf margin and then to the central part by observing the dynamic changes of imaging and fluorescence parameters employing the chlorophyll fluorescence imaging system. The daily variation trend of fluorescence imaging and parameters infected by Vd-3 plants was more obvious; The quantum yield Y （NO） of non-regulatory energy dissipation and the non-photochemical quenching （NPQ） reached the inflection point on the 6th day. The maximum photochemical quantum yield （Fv/Fm） and the actual optical quantum yield Y （Ⅱ） changed slowly， and the Fv/Fm showed obvious difference at 13 d.

【Conclusion】 The strains from Changji and Shawan city are defioating pathotype， and the colony is circular with 2 hyphal branches and long oval spores. In addition to the greatest genetic distance and variability， the most virulent strain of Verticillium wilt disease is Vd-3. Compared with that of V991，Vd-3 possesses the varied the infection mode for cotton， and fluorescence parameters Y （NO） and NPQ can exquisitely perceive the changes.

Key words：pathogenicity; chlorophyll fluorescence imaging; cotton Verticillium wilt; whole genome resequencing

Fund projects：Major Scientific R amp; D Program Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region “Cultivation and Technology Demonstration of New Varieties of Machine-Picked Cotton”（2021A02001-4）

Correspondence author： MA Jun（1983-），male，from Minqin， Gansu，associate research fellow，research direction：cotton germplasm resources collection and vtilization，（E-mail）xj.majun@163.com