基于轉錄組學探究日糧添加酵母β-葡聚糖對新城疫疫苗免疫雞腸道免疫的影響

摘 要： 旨在探討基礎日糧中添加酵母β-葡聚糖（G70）對新城疫疫苗免疫雞腸道免疫功能的影響。試驗選取16只1日齡健康烏骨雞隨機分為2個組，對照組（Vaccine）和G70組（G70+Vaccine），G70組在飼喂基礎日糧的基礎上添加1 g·kg^－1的G70，分別于14、28日齡進行新城疫疫苗首次免疫和加強免疫。35日齡時，采集雞的空腸組織，測定空腸黏膜IgA+細胞數量，空腸CD4+CD8+雙陽性T細胞占比與空腸免疫相關基因mRNA表達水平，隨后進行轉錄組學測序，并對差異表達基因進行GO功能和KEGG通路富集分析。結果表明，與對照組相比，飼料添加G70顯著提高空腸黏膜內IgA+細胞的數量（Plt;0.05），空腸CD4+CD8+雙陽性T細胞占比顯著上升（Plt;0.05），GATA-3、MHC-I、MHC-II、CCR7和IFN-γ mRNA表達水平顯著上調（Plt;0.05）；轉錄組學研究表明，添加G70后空腸組織差異表達基因有559個，其中54個基因上調和505個基因下調，基因本體（GO）富集分析揭示差異表達基因多數被注釋到胺代謝和分解、蛋白質合成、刺激生長因子（TGF-β）和調節酶活性等相關的GO條目上；KEGG信號通路分析顯示差異表達基因主要富集在與核糖體、MAPK、細胞黏附和局部黏附等與細胞合成和代謝相關的信號通路。上述結果提示，飼糧中添加酵母β-葡聚糖（G70）可增加新城疫免疫雞空腸中IgA+細胞的數量，提高空腸CD4+CD8+雙陽性T細胞占比，上調空腸中免疫相關基因的表達，其機制可能是通過調節IL-17RD、TGF-β和TMEM158等免疫相關基因的表達，影響IL-17受體、TGF-β和MAPK信號通路提高雞的腸道免疫功能。

關鍵詞： 酵母β-葡聚糖；新城疫疫苗；腸道免疫；轉錄組學

中圖分類號：

S831.7"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1441-12

收稿日期：2024-06-25

基金項目：重慶市技術創新與應用發展專項資助項目（cstc2019jsccx-lyjsBX0003；cstc2021jscx-lyjsAX0008）

作者簡介：李常營（1983-），男，山東滕州人，講師，博士，主要從事動物營養與疾病防控研究，E-mail： licy1983@163.com，Tel：023-46751588

*通信作者：曹立亭，主要從事新中獸藥創制研究，E-mail：caoliting@swu.edu.cn

Effect of Dietary Yeast β-glucan Supplementation on Intestinal Immune Function in Chickens

Immunized against Newcastle Disease Vaccine based on Transcriptomic

LI" Changying1， LI" Jun^2，3， LInbsp; Xifeng3， BI" Shicheng^3，4， CAO" Liting^3，4*

（1.College of Animal Science and Technology， Southwest University， Chongqing 402460，" China;

2.Cuiping Animal Epidemic Prevention and Quarantine Center of Yibin， Yibin 644000，" China;

3.College of Veterinary Medicine， Southwest University， Chongqing 402460，" China;

4.Institute of Traditional Chinese Veterinary Medicine， Southwest University， Chongqing

402460，" China）

Abstract：" The aim of this study is to investigate the effect of adding yeast β-glucan （G70） to the diet on intestinal immune function in chickens immunized Newcastle disease （ND） vaccine. Sixteen 1-day-old healthy black-bone chickens were randomly divided into 2 groups， the Vaccine group and the G70+Vaccine group， and in the G70+Vaccine group， yeast β-glucan was added at 1 g·kg^－1 in the basal diet. At 14 and 28 days of age， ND vaccine was administered for the 1^st immunization and booster immunization. At 35 days of age， jejunum tissue was collected to determine the number of IgA+cells， the proportions of CD4+CD8+double-positive T cells， and the mRNA expression levels of immune-related genes in jejunum， then transcriptome sequencing was performed， and the differentially expressed genes were analyzed by GO function and KEGG pathway. The results showed that， compared with the Vaccine group， dietary G70 significantly increased the number of IgA+cells （Plt;0.05） and the proportions of CD4+CD8+double-positive T cells in the jejunum （Plt;0.05）， and the mRNA expression levels of GATA-3， MHC-I， MHC-II， CCR7 and IFN-γ were significantly up-regulated （Plt;0.05）. RNA-seq showed that there were 559 differentially expressed genes in G70+Vaccine group， of which 54 were up-regulated and 505 were down-regulated， the GO analysis revealed that most of the differentially expressed genes were annotated to the GO entries related to amine metabolism and catabolism， protein synthesis， stimulation of TGF-β， and regulation of enzyme activities. KEGG signaling pathway analysis revealed that the differentially expressed genes were mainly enriched in signaling pathways related to cell synthesis and metabolism， such as ribosomes， MAPK， cell adhesion and local adhesion. In summary， the addition of yeast β-glucan （G70） to the diet increased the number of IgA+cells， promoted the proportions of CD4+CD8+double-positive T cells， and up-regulated the expression of immune-related genes in jejunum. The possible mechanism of improving chicken′s intestinal immune function might be affecting the IL-17 receptor， TGF-β and MAPK signaling pathways by regulating the expression of immune-related genes such as IL-17RD， TGF-β and TMEM158.

Keywords： yeast β-glucan; Newcastle disease vaccine; intestinal immune function; transcriptomics

*Corresponding author： CAO Liting，E-mail：caoliting@swu.edu.cn

新城疫（Newcastle disease， ND）是由新城疫病毒引起的一種高度接觸性禽類烈性傳染病，主要感染雞和火雞等禽類^［1］。ND在全球廣泛流行，傳播速度快，常引起雛雞感染，病死率高，耐過的病雞生產性能下降，因免疫抑制而易導致免疫失敗，加之新城疫病毒（NDV）基因型眾多且雞、火雞、鵪鶉等家禽及野生禽均能引起感染，導致臨床實際免疫效果不佳，對世界養禽業危害巨大^［2-4］。臨床上常用疫苗佐劑來提高ND疫苗的免疫接種效果，然而疫苗佐劑存在例如組織損傷、應激反應和毒性殘留等不良作用，新型疫苗佐劑也因價格昂貴限制了其推廣應用。眾所周知，理想的疫苗不僅需要誘導有效的體液免疫，也需要刺激細胞免疫和腸道黏膜免疫^［5］。因此，探究有效的方法來提高疫苗的免疫效果具有重要意義。本團隊前期研究表明，飼料中添加0.1%的酵母β-葡聚糖（G70）可顯著增強雞免疫新城疫疫苗后機體體液免疫及細胞免疫反應^［6］。空腸腸道是機體營養物質消化和吸收的關鍵場所，同樣也是機體免疫的重要組成部分，其緊密連接的黏膜上皮結構為機體提供物理屏障，并通過分泌免疫型抗體發揮其免疫屏障功能，均能有效阻止細菌及內毒素等有害物質穿過腸黏膜進入血液循環^［7］。因此，本研究擬通過測定空腸IgA+細胞數量和CD4+CD8+雙陽性T細胞占比以及腸道免疫相關基因的mRNA表達水平來研究酵母β-葡聚糖（G70）對雞腸道免疫的影響，并運用RNA-seq技術探究G70對雞空腸基因表達的影響，闡明其潛在的信號傳導途徑，以期為G70作為免疫增強劑應用于養禽業生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用1日齡健康商品烏骨雞購自貴州羽順禽業有限公司。酵母β-葡聚糖（G70，含量：99％，QB-T4572），購自湖北宜昌安琪酵母股份有限公司；雞新城疫活疫苗（La Sota株），購自青島易邦生物工程有限公司；TRIzol（9109），購自北京寶日醫生物技術有限公司；SYBRPremix Ex Taq^TMII（RR036A），購自北京寶日醫生物技術有限公司。

1.2 試驗設計與飼養管理

試驗雛雞采用籠養飼養在西南大學動物醫學院SPF動物房，飼養期間可自由采食和飲水。正式試驗于適應性飼養5 d后開始。將16只健康5日齡商品烏骨雞隨機分為2組：G70組（G70+Vaccine）和對照組（Vaccine），每組8只，對照組飼喂基礎日糧，G70組在飼喂基礎日糧的基礎上添加1 g·kg^－1的酵母β-葡聚糖（G70）^［6］。于14日齡和28日齡分別進行首次免疫和加強免疫，免疫方式為點眼滴鼻，劑量為4單位ND抗原。基礎日糧的成分與營養水平見表1。本研究經過西南大學實驗動物倫理審查委員會審查批準（倫理證明編號：IAC-2021-1020）。

1.3 樣品采集

飼養至35日齡，試驗各組雞只用二氧化碳氣體窒息處死，采集空腸樣本（以十二指腸懸韌帶為空腸取樣的起始點采集長約8 cm腸段，分為2份），一份用4%多聚甲醛固定，另一份迅速置于液氮速凍后-80 ℃保存備用。

1.4 空腸IgA+細胞檢測

采用石蠟包埋法制作空腸組織切片，每個樣品制作4個厚度為5 μm的不連續切片，免疫組織化學法檢測空腸IgA+細胞，使用Image J軟件測量IgA+細胞面積。每張切片選取6個視野進行統計分析。

1.5 酵母β-葡聚糖（G70）對雞腸道CD4+CD8+雙陽性T細胞占比的影響

參考文獻［8］報道的試驗方法，制備雞空腸淋巴細胞懸液，并調整細胞濃度為5×105 cell·mL^－1。吸取1 mL細胞懸液，2 500 r·min^－1離心5 min，棄上清；再加入1 mL PBS重懸洗滌細胞，2 500 r·min^－1離心10 min后，棄上清；依次加入小鼠抗雞CD3-APC、CD4-FITC和CD8-PE，冰上孵育20 min，然后用PBS洗滌2次，上機檢測，之后使用FlowJo軟件進行統計分析。

1.6 RT-qPCR檢測空腸中免疫相關基因表達水平

使用TRIzol法提取空腸總RNA，根據反轉錄試劑盒將總RNA反轉為cDNA，以雞的β-actin為內參基因，免疫相關基因的引物序列見表2，熒光定量結果采用2^-ΔΔCT法計算基因在空腸組織中的表達量。

1.7 轉錄組學測序與分析

1.7.1 測序

使用TRIzol法提取樣品總RNA，隨后進行RNA質量檢測，采用NanoDrop分光光度計（美國IMPLEN公司，CA，美國）檢測RNA純度，Agilent 2100 bioanalyzer（美國安捷倫技術公司，CA，美國）檢測RNA完整度。樣品檢測合格后，每組樣品各取1.5 μg的RNA用于測序。通過Oligo（dT）磁珠富集樣本mRNA，以片段化的mRNA為模版，隨機寡核苷酸為引物，在逆轉錄酶體系中合成cDNA第一條鏈，以dNTPs為原料合成第二鏈cDNA。為篩選250～300 bp的cDNA，純化后的雙鏈cDNA經過末端修復，加A尾并連接測序接頭，采用PCR擴增技術構建cDNA文庫。文庫質檢合格后，通過Illumina NovaSeq 6000（Illumina， 美國）上機測序。將測序所得原始數據（Raw reads）進行過濾，去除帶有測序接頭的Reads，不確定堿基含量比例大于10%的Reads，以及低質量堿基（Q≤20）含量大于50%的Reads，得到Clean reads，最后，通過HISAT2軟件與參考基因組比對分析。

1.7.2 差異表達基因分析

本試驗將Padj≤0.05且log2FoldChange≥1作為篩選差異表達基因（differential expressed genes， DEGs）的標準。

1.7.3 差異表達基因富集分析

用GOseq R包對DEGs進行富集分析，使用KOBAS （v2.0）軟件檢測差異表達基因在統計學上富集的KEGG通路。

1.7.4 RT-qPCR驗證

為驗證轉錄組測序結果，選擇了8個差異表達基因進行驗證，使用Primer premier 5軟件設計引物送至上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物信息見表2。以β-actin作為內參基因，熒光定量結果采用2^-ΔΔCT法計算基因在組織中的表達量。

1.8 數據分析

使用Excel 2016整理試驗數據，GO seq R包和KOBAS （v2.0）軟件用于分析差異表達基因GO和富集KEGG通路，Padj≤0.05且log2FoldChange≥1作為篩選差異表達基因的標準，用log2FoldChange驗證差異基因的表達趨勢；運用GraphPad Prism 8進一步分析并繪制柱狀圖。

2 結 果

2.1 酵母β-葡聚糖（G70）對雞空腸IgA+細胞數量的影響

如圖1可知，與對照組相比，飼料添加G70顯著提高空腸黏膜內IgA+細胞的數量（Plt;0.05）。

2.2 酵母β-葡聚糖（G70）對雞空腸CD4+CD8+雙陽性T細胞占比的影響

圖2A、2B分別顯示了淋巴細胞、CD3+T細胞的設門，圖2C、2D顯示了G70組、對照組CD4+T細胞和CD8+T細胞的比例。由圖2E可知，加強免疫后7 d，與免疫對照組相比，G70組空腸CD4+CD8+雙陽性T細胞占比顯著上升（Plt;0.05）。

2.3 酵母β-葡聚糖（G70）對雞空腸相關基因mRNA表達的影響

空腸相關細胞因子mRNA相對表達量變化如圖3所示，與Vaccine組相比，G70組空腸組織中GATA-3、MHC-I、MHC-II、CCR7和IFN-γ表達水平顯著上調（Plt;0.05），而IL-6、TGF-β、NF-κB、TLR3、TLR4、TLR5、CCR9、J-CHAIN、pIgR、CD40和CD80的mRNA表達水平變化差異不顯著。

2.4 差異表達基因篩選

如圖4所示，本研究共篩選出559個DEGs（Differentially Expressed Genes，差異表達基因），與疫苗對照組相比，G70組54個DEGs顯著上調和505個DEGs顯著下調。圖5為差異表達基因的聚類分析結果，表明G70組的整體基因表達譜與對照組相比差異較大，部分上調和下調的差異基因詳見表3。

2.5 差異表達基因GO富集分析

差異表達基因GO（Gene Ontology，GO）富集柱狀圖能夠直觀的反映出差異表達基因在生物過程（Biological process， BP）、細胞組分（Cellular component， CC）和分子功能（Molecular function， MF）的富集分布情況。在G70組與對照組之間下調差異基因生成的GO富集柱狀圖中，共有20個GO條目顯著富集，詳見圖6B。生物過程顯著富集的GO term為翻譯（Translation）、肽生物合成過程（Peptide biosynthetic process）、脂質轉運（Lipid transport）、胺生物合成過程（Amide biosynthetic process）等；與細胞組分相關的GO條目包括核糖體（Ribosome）、細胞質部分（Cytoplasmic part）、核糖核蛋白復合物（Ribonucleoprotein complex）、非膜結構細胞器（Non-membrane-bounded organelle）等；核糖體結構成分（Structural constituent of ribosome）、結構分子活性（Structural molecule activity）和酶的調節活性（Enzyme regulator activity）等與分子功能有關。上調的差異表達基因主要富集在跨膜受體蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶信號傳導途徑（Transmembrane receptor protein serine/threonine kinase signaling pathway）、TGF-β受體信號傳導途徑（Transforming growth factor beta receptor signaling pathway）、生長因子反應（Response to growth factor）等，詳見圖6A。

2.6 差異表達基因KEGG代謝通路分析

G70組和對照組之間的差異基因共被注釋到20條通路，差異基因主要富集在以下4條通路，包括核糖體（Ribosome）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、細胞黏附分子（Cell adhesion molecules）和局部黏附（Focal adhesion），分別包含11、9、7和7個差異表達基因，詳見圖7和表4。

2.7 RT-qPCR驗證差異表達基因

試驗結果如圖8所示，所有差異基因的表達趨勢與轉錄組數據相一致。

3 討 論

腸道是機體最大的免疫器官，腸道黏膜免疫系統在保護機體免受感染方面發揮著重要作用^［9］。IgA+細胞在黏膜表面大量分泌IgA，保護宿主免受病原體的侵害，并限制共生體進入上皮下^［10］。位于腸道相關淋巴組織的T和B淋巴細胞，經誘導分化為CD4+和CD8+T細胞參與腸道免疫。CD4+和CD8+T細胞兩個亞群是直接反映機體免疫能力的T細胞亞群^［11］。CD4+T細胞主要產生細胞因子并促進B細胞成熟，而CD8+T細胞與殺傷靶細胞有關^［12］。在本研究中，G70組檢測到腸道淋巴細胞CD4+CD8+雙陽性T細胞的占比顯著增加，表明酵母β-葡聚糖（G70）可以促進腸道淋巴細胞增殖分化為CD4+和CD8+T細胞。這與本團隊前期的研究結果基本一致^［6］。

細胞因子含量以及動態變化直接反映腸道免疫甚至機體的免疫功能狀態。IFN-γ是機體免疫反應的主要調節細胞因子，是激活免疫細胞的關鍵信號分子。另外，IFN-γ能夠激活巨噬細胞以增強多種細胞表面MHC-I和MHC-II的表達，并促進中和抗體分泌以阻斷病毒復制^［13］。在本研究中，IFN-γ、MHC-I（Plt;0.05）和MHC-II的mRNA的表達水平升高。這與Gardner和Ruffell^［14］的研究結果相符。GATA-3在調節Th1和Th2細胞分化中起關鍵作用^［15］。本研究發現，在加強免疫后1周，GATA-3的mRNA水平顯著表達，表明G70在誘導CD4+T細胞分化的基礎上，能夠激活Th1和Th2型免疫應答反應。前期同樣有報道酵母葡聚糖能夠共同刺激GATA-3基因的相對表達，與本文的結果一致^［8］。CCR7和CCR9是派爾集合淋巴結（Peyer patch）中腸道淋巴細胞歸巢到次級淋巴組織過程中的重要趨化因子，其表達上調通常與腸道黏膜中T細胞和IgA+細胞的增加有關^［16-17］。本研究中空腸黏膜IgA+細胞數量顯著增加，其原因可能是空腸中CCR7的mRNA表達顯著上調。這與課題組的前期研究結果相一致^［5］。

轉錄組學研究中，KEGG通路富集分析表明，差異表達基因主要被歸入兩條路徑，包括“核糖體”和“MAPK”信號傳導路徑。β-葡聚糖的模式識別受體富集在免疫細胞表面，β-葡聚糖識別后，酪氨酸激酶和NF-κB受體受到刺激，誘導促炎性細胞因子的分泌和激活免疫反應^［18-22］。MAPK是絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族重要成員，在雞的炎癥發應和細胞因子產生中起著重要作用。Byun等^［23］證明，酵母β-葡聚糖提高了IFN-γ和IL-2的產生，并引發腹腔巨噬細胞中MAPK p38的磷酸化水平明顯提高。Wang等^［24］報道，酵母β-葡聚糖通過抑制p38" MAPK的激活而減弱THP-1型細胞的炎癥反應。在本研究中，在MAPK信號通路中發現了9個DEGs，包括JUND、novel.677、ECSIT、NFKB2、TGFA、ENSGALG00000050166、ENSGALG00000031518、GADD45G和PGF，提示酵母β-葡聚糖可能通過MAPK信號通路調節雞的腸道免疫反應。IL-17是輔助性T細胞17（Th17）的標志性細胞因子，在自身免疫、炎癥和抑制腫瘤發展以及宿主防御細菌和真菌感染方面起著重要作用^［25-26］。此外，IL-17還能夠促進抗菌肽產生和誘導中性粒細胞產生，進而增強黏膜表面的物理屏障防御^［27］。本研究中IL-17RD基因的表達量上調，提示了G70的免疫增強作用可能與IL-17受體信號通路有關。

TMEM家族是一類跨膜蛋白，能夠編碼鈣離子激活氯通道，具有促進細胞增殖的作用，在免疫相關疾病中發揮著重要作用^［28］。TMEM家族蛋白廣泛參與基本生物學功能，包括物質運輸、信號傳導以及作為膜的基本成分^［29］。此外，其家族中的蛋白成員參與調控的生物學過程包括自噬、平滑肌收縮、蛋白質糖基化和炎癥反應等。TMEM158一直被認為是腫瘤抑制因子的關鍵基因。有研究報道TMEM158缺失可以調節癌細胞中的細胞周期和TGF-β表達來抑制細胞增殖、侵襲和黏附^［30］。此外，Fu等^［31］研究發現，TMEM158在癌細胞中表達上調，并通過激活TGF-β1和PI3K/AKT信號通路促進癌細胞增殖、遷移和侵襲。在本研究中，TMEM158基因表達量下調，同時KEGG富集分析結果顯示，有4個差異顯著基因富集在TGF-β信號通路，這提示了G70的免疫增強作用可能與TGF-β信號通路有關。

4 結 論

飼料中添加酵母β-葡聚糖（G70）增加了新城疫免疫雛雞空腸中IgA+細胞的數量，提高了腸道CD4+CD8+雙陽性T細胞比率，并上調了空腸免疫相關基因的表達。此外，G70可能通過調節IL-17RD、TGF-β和TMEM158等免疫相關基因的表達發揮其免疫增強作用，其機制可能是通過影響IL-17受體、TGF-β和MAPK信號通路。

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（編輯 范子娟）