一種羊種布魯氏菌復(fù)方新諾明耐藥株熒光定量PCR檢測方法的建立

摘 要： 近年來，世界范圍內(nèi)已分離獲得布魯氏菌復(fù)方新諾明耐藥株，快速檢測樣品中是否含有耐藥株有助于指導(dǎo)臨床用藥。目前國內(nèi)外尚無布魯氏菌復(fù)方新諾明耐藥株的快速檢測方法。本研究旨在建立一種羊種布魯氏菌復(fù)方新諾明耐受株的快速檢測方法。基于前期的研究篩選最小抑菌濃度較高的我國羊種布魯氏菌分離株，利用基因組測序分析全基因組SNPs并篩選SNPs位點，利用MGB探針建立熒光定量檢測羊種布魯氏菌復(fù)方新諾明耐藥株。研究發(fā)現(xiàn)，羊種布魯氏菌2型標(biāo)準(zhǔn)株可作為耐藥株分析的參考株，且64個SNPs和InDels為耐藥株特有；12個突變位點可用于建立耐藥株快速檢測方法；利用染色體1中2 014 308位點的A/G多態(tài)性建立熒光定量檢測方法特異性良好，最低能檢測2×101 CFU菌量，可用于臨床樣品是否含有復(fù)方新諾明耐藥株的檢測。本研究建立了一種羊種布魯氏菌復(fù)方新諾明耐藥株的熒光定量檢測方法，為我國布病耐藥株的防控提供科學(xué)依據(jù)，同時也為臨床用藥提供參考。

關(guān)鍵詞： 羊種布魯氏菌；復(fù)方新諾明；全基因組SNPs；MGB探針

中圖分類號：S852.614

文獻標(biāo)志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1465-08

收稿日期：2024-04-16

基金項目：北京市自然科學(xué)基金項目（7222120）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（2023-YWF-ZYSQ-09）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程重大科研任務(wù)（CAAS-ZDRW202410）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程科學(xué)中心重點任務(wù)（CAAS-CSLPDCP-202403）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP）（ASTIP-IAS-15）

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程重大科研任務(wù)（CAAS-ZDRW202410）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程科學(xué)中心重點任務(wù)（CAAS-CSLPDCP-202403）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP）（ASTIP-IAS-15）

作者簡介：楊曉雯（1989-），女，山東濰坊人，研究員，博士，主要從事人獸共患病防控、耐藥及致病機制研究，E-mail： yangxiaowen01@caas.cn；寧文晴（2000-），女，山東濟南人，碩士生，主要從事人獸共患病防控、耐藥及致病機制研究，E-mail： m17662631372@163.com。楊曉雯和寧文晴為同等貢獻作者

*通信作者：侯雪新，主要從事重大傳染病防控及防控設(shè)備研究，E-mail： houxuexin@icdc.cn；丁家波，主要從事獸醫(yī)公共衛(wèi)生及人獸共患病防控研究，E-mail： dingjiabo@126.com

Establishment of a Quantitative Real-time PCR Detection Method for Trimethoprim-

Sulfamethoxazole-resistance Strains of Brucella melitensis

YANG" Xiaowen^{1， 2}， NING" Wenqing^{1， 3}， ZHOU" Shizhong1， YUAN" Yaqin^{1， 4}，

HOU" Xuexin^2*， DING" Jiabo^1*

（1.Key Laboratory of Animal Biosafe Risk Prevention and Control （North） of Ministry of

Agriculture and Rural Affairs， Institute of Animal Science， Chinese Academy of Agricultural

Sciences， Beijing 100193，" China; 2.National Key Laboratory of Intelligent Tracking and

Forecasting for Infectious Diseases， National Institute for Communicable Disease Control

and Prevention， Chinese Center for Disease Control and Prevention， Beijing 102206，" China;

3.College of Veterinary Medicine， Shandong Agricultural University， Tai’an 271001，" China;

4.Key Laboratory of Jiangsu Preventive Veterinary Medicine， Key Laboratory of Avian

Preventive Medicine， Ministry of Education， College of Veterinary Medicine，

Yangzhou University， Yangzhou 225009，" China）

Abstract：" In recent years， strains of Brucella spp. resistant to trimethoprim-sulfamethoxazole have been isolated worldwide. Rapid detection of these resistant strains in samples can guide clinical medication. Currently， there are no rapid detection methods for Brucella trimethoprim-sulfamethoxazole-resistance strains. The aim of this study is to establish a rapid detection method for trimethoprim-sulfamethoxazole-resistance strains of B. melitensis. Based on previous studies， the isolates of B. melitensis with higher minimum inhibitory concentrations were selected. Whole genome sequencing was used to analyze SNPs and InDels， and variation sites were selected for developing a quantitative real-time PCR detection method using MGB modified probes. The results showed that B. melitensis bv.2 strain 63/9 could be the reference genome to analysis resistance strains， and 64 unique SNPs and InDels have been passed. Among them， twelve mutation sites were identified that could be used to establish a rapid detection method for resistant strains. A quantitative real-time PCR detection method developed using the A/G polymorphism at site 2 014 308 of chromosome 1 showed good specificity and could detect as low as 2×101 CFU， making it suitable for detecting trimethoprim-sulfamethoxazole-resistance strains in clinical samples. In conclusion， this study established a quantitative real-time PCR detection method for trimethoprim-sulfamethoxazole-resistance B. melitensis strains， providing a scientific basis for the prevention and control of drug resistant strains in China， and can also serve as a reference for clinical medication.

Keywords： Brucella melitensis; trimethoprim-sulfamethoxazole; whole genome SNPs; MGB modified probe

*Corresponding authors：" HOU Xuexin， E-mail： houxuexin@icdc.cn; DING Jiabo， E-mail： dingjiabo@126.com

布魯氏菌?。˙rucellosis，以下簡稱布病）是由革蘭陰性兼性胞內(nèi)寄生菌——布魯氏菌引起的一種人獸共患病，通常通過直接接觸患病動物或者攝入滅菌不徹底的患病動物制品感染^［1］。近年來，人和動物的布病均呈全球再流行趨勢，該病造成的患者勞動力喪失和動物繁殖障礙每年損失數(shù)十億美元。每年世界范圍內(nèi)布病新增感染病例約為50萬例^［2］，但據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）報道，真正的感染人數(shù)是實際報道的10倍～25倍^［3］。隨著經(jīng)濟的發(fā)展，頻繁的牲畜及畜產(chǎn)品貿(mào)易和旅游增強了布魯氏菌的傳播^［4］。根據(jù)世界動物衛(wèi)生組織（The World Organisation for Animal Health， WOAH）官方公布的數(shù)據(jù)（https：//wahis.woah.org），法國、塞浦路斯、克羅地亞、以色列、澳大利亞等在2019—2022年均有布病疫情報道，這些國家上次報道布病疫情還在10年甚至更久之前。目前，我國的布病疫情處于再流行階段（1995至今），全國32省市自治區(qū)均有病例報道。根據(jù)國家疾病預(yù)防控制局（https：//www.ndcpa.gov.cn/jbkzzx/c100016/common/list.html）公布的數(shù)據(jù)，2023年布病年新增發(fā)病數(shù)為75 858例，較2022年增長6%（71 437例），比2020年（48 455例）增加27 403例，是我國法定報告?zhèn)魅静≈心晷略霾±鲩L最快的人獸共患病。

布病轉(zhuǎn)為慢性的概率高（13%～30%）^［5］，除治療不當(dāng)因素外，可能存在因耐藥株導(dǎo)致慢性布病。我國《布魯菌病診療專家共識》中將復(fù)方新諾明作兒童（8歲以下）、合并心內(nèi)膜炎抗菌治療一線藥物；非復(fù)雜性感染、合并腦膜炎、腦膜腦炎、妊娠抗菌治療二線藥物^［6］，近年來世界范圍內(nèi)均分離到復(fù)方新諾明耐藥株^［7-10］。團隊前期研究結(jié)果表明，我國布魯氏菌分離株復(fù)方新諾明最小抑菌濃度（MIC）較標(biāo)準(zhǔn)株高4倍～16倍^［11］，快速檢測樣品中是否含有復(fù)方新諾明耐藥株有助于指導(dǎo)臨床用藥，增加布病治療效果。目前國內(nèi)外尚無布魯氏菌復(fù)方新諾明耐藥株的快速檢測方法。因此，本研究基于前期研究結(jié)果，針對MIC值較高的菌株進行全基因組測序，分析其全基因組SNPs和InDels，篩選變異位點，建立基于MGB探針法的快速檢測方法，為布魯氏菌耐藥株的防控提供科學(xué)方法和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)

基于前期研究結(jié)果，本研究選擇MIC值較高的3株羊種布魯氏菌復(fù)方新諾明耐藥分離株，由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所保藏、傳代、培養(yǎng)、計數(shù)并滅活。特異性檢測中涉及的大腸桿菌ATCC 25922，雞白痢沙門菌CVCC526，鼠傷寒沙門菌ATCC14028，產(chǎn)單核細胞李氏桿菌ATCC 19115，炭疽桿菌Sterne（疫苗株）、結(jié)合分枝桿菌（疫苗株）、多殺巴氏桿菌（分離株）、蒼白桿菌（分離株）、金黃桿菌屬（分離株）均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物生物安全與公共衛(wèi)生防控團隊保藏、傳代、培養(yǎng)、計數(shù)并滅活。臨床樣品血清學(xué)檢測由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物生物安全與公共衛(wèi)生防控團隊按照《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18646—2018）完成。

羊種布魯氏菌1型16 M、2型63/9和3型Ether標(biāo)準(zhǔn)株的基因組、基因及編碼蛋白序列由NCBI RefSeq數(shù)據(jù)庫（ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/）下載。

1.2 主要試劑和儀器

基因組提取純化試劑盒Wizard Genomic DNA Purification Kit購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司，核酸提取試劑盒DNeasy Blood amp; Tissue Kit購自凱杰生物工程（深圳）有限公司；二代測序MGISEQ-2000RS測序載片（FCL）、MGISEQ-2000RS高通量測序試劑盒、MGIEasy環(huán)化模塊、MGIEasy酶切DNA文庫制備試劑盒、MGIEasy DNA Adapters試劑盒、MGIEasy DNA純化磁珠試劑盒均購自深圳華大智造科技股份有限公司；熒光定量檢測中引物、探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，無菌無酶水購自北京索萊寶科技有限公司，Premix Ex Taq （Probe qPCR）購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自HyClone公司。

本研究中涉及的二代測序儀器MGISEQ-2000（深圳華大智造科技股份有限公司）、Qubit 4 Fluorometer （Invitrogen）、NanoDrop One（Thermo Scientific）、熒光定量PCR儀GENTIER 96（西安天隆科技有限公司）、PCR擴增儀T100 Thermal Cycler（Bio-Rad）、電子比濁儀DensiCHEK Plus（BioMerieux）均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物生物安全與公共衛(wèi)生防控團隊提供。

1.3 基因組提取及測序

按照Wizard Genomic DNA Purification Kit操作說明提取并純化基因組，利用Qubit 4 Fluorometer檢測濃度，適當(dāng)稀釋后取100 ng利用相應(yīng)的試劑盒進行酶切打斷、片段回收、末端修復(fù)、添加接頭、PCR擴增、變性、單鏈環(huán)化后，制備、加載DBN，使用MGISEQ-2000測序儀測序，測序覆蓋度大于200×。

參考前期建立的方法^［12］處理測序原始數(shù)據(jù)獲得clean data。將clean data比對到其他種屬的細菌數(shù)據(jù)庫中，提取比對上的reads，利用SAPdes^［13］進行組裝，組裝后的序列在線比對NCBI Gene 數(shù)據(jù)庫，檢測是否存在獲得性耐藥基因。

1.4 SNPs尋找及篩選

利用SPAdes對clean data進行初步組裝獲得contigs，剔除小于100 bp的contigs后，其余contigs利用MAUVE^［14］將contigs與羊種布魯氏菌1～3型標(biāo)準(zhǔn)株進行全基因組比對并構(gòu)建進化樹，選擇親緣關(guān)系最近的標(biāo)準(zhǔn)菌株作為參考基因組，同時輸出其余兩個標(biāo)準(zhǔn)株的全基因組SNPs。

以上述標(biāo)準(zhǔn)株為參考基因組，參考前期建立的方法^［12］，利用SAMtools和GATK相結(jié)合的方法檢測耐藥株的SNPs和InDels，得分高于1 000的SNPs和InDels用于后續(xù)分析。利用snpEff注釋SNPs和InDels，將注釋結(jié)果為Variants Impact High的SNPs和InDels前后300 bp序列設(shè)計引物、擴增并測序，檢測SNPs和InDels的可信度。篩選耐藥株存在且標(biāo)準(zhǔn)株不存在的、經(jīng)測序驗證可信的SNPs和InDels，且該SNPs和InDels所在的基因在羊種1～3型標(biāo)準(zhǔn)菌株完全相同，符合上述條件的SNPs和InDels用于后續(xù)試驗。

1.5 MGB探針法建立

參考文獻［15］設(shè)置布魯氏菌通用檢測引物及探針。分別設(shè)計針對SNPs和InDels的MGB標(biāo)記的探針，檢測布魯氏菌復(fù)方新諾明敏感和耐藥株。擴增體系為20 μL，包括10 μL Premix Ex Taq （Probe qPCR），5.2 μL無菌無酶水，引物和探針各0.4 μL（4條引物和3條探針，終濃度均為0.2 μmol·L^-1），模板2 μL；二步法擴增檢測，條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s，反應(yīng)為45個循環(huán)，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，每個反應(yīng)結(jié)束時收集相應(yīng)的熒光信號。同時，調(diào)整菌液濃度，10倍梯度稀釋滅活菌液，檢測最低菌量。

1.6 樣品核酸提取及檢測

按照DNeasy Blood amp; Tissue Kit的操作說明，提取經(jīng)虎紅平板凝集試驗、微量凝集試驗均為陽性的布病樣品的核酸，檢測濃度后取2 μL樣品利用本研究建立的方法進行檢測。同時，設(shè)置陽性對照（即將1×105 CFU耐藥株菌液加入胎牛血清中）和陰性對照（胎牛血清）。

2 結(jié) 果

2.1 我國復(fù)方新諾明耐藥株存在特異性SNPs位點

3株羊種布魯氏菌復(fù)方新諾明耐藥株分別命名為RSXT015、RSXT019和RSXT089，經(jīng)過濾后每個菌株均獲得1.00 Gb以上的clean data，組裝后分別獲得較為完整的基因組序列（表1），未發(fā)現(xiàn)測序株中獲得已報道的耐藥基因。組裝后的基因組與完整的羊種布魯氏菌總長度差異較小，用于全基因組序列比對尋找參考基因組可信度較高。

利用耐藥株和標(biāo)準(zhǔn)株的全基因組序列構(gòu)建進化樹如圖1所示。從進化樹可知，3株耐藥株處于同一分支，遺傳差異較小，且均與羊種2型標(biāo)準(zhǔn)株63/9的親緣關(guān)系較高。因此，后續(xù)分析以羊種2型標(biāo)準(zhǔn)株63/9的基因組序列為參考基因組。

與參考基因組比對后發(fā)現(xiàn)，RSXT015菌株存在295個位點的SNPs和InDels，RSXT019存在279個，RSXT089存在298個，3株耐藥株共有185個位點的SNPs和InDels。將共有的185個位點與羊種1和3型變異位點比較，剔除標(biāo)準(zhǔn)株的變異位點后，有64個位點的SNP和InDels在耐藥株中存在且在標(biāo)準(zhǔn)株中不存在（圖2），包括50個SNPs和14個InDels。將64個位點SNP和InDels提取并注釋后發(fā)現(xiàn)，有9個變異位點引起移碼突變，27個變異位點引起錯義突變。共有60個基因受64個變異位點的影響，影響程度較高的有36個基因，27個基因受錯義突變影響。其中，12個受錯義突變影響的基因在羊種1～3型標(biāo)準(zhǔn)株中核酸序列完全一致，可作為后續(xù)建立檢測方法的候選變異位點。

2.2 建立MGB探針法檢測布魯氏菌復(fù)方新諾明耐藥株

本研究選擇染色體1中2 014 308位點，該位點存在A/G多態(tài)性，引起基因BMEA_RS09715中"" 224位氨基酸錯義表達（Thr224Ala）。因此，本研究利用MGB探針法建立羊種布魯氏菌復(fù)方新諾明耐藥株檢測方法，引物探針如表2所示。

特異性檢測。將表2中的引物對和探針對混勻后分別檢測不同種細菌（詳見“1.1”方法），陽性對照2×105 CFU耐藥株，陰性對照為無酶無菌水。擴增后發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌通用引物和探針檢測布魯氏菌不受耐藥株引物對和探針對的影響，僅有蒼白桿菌（分離株）有大于40的Ct值，即引物對和探針對之間互不干擾（圖3A）。同時，耐藥株檢測探針檢測其他種細菌也未存在擴增曲線，表明本研究建立的方法特異性較好。

敏感性檢測。定量滅活的耐藥菌菌液稀釋至1×105～100 CFU·μL^-1，利用表2中的探針對進行檢測，發(fā)現(xiàn)耐藥株引物和探針檢測2×10 ² CFU菌擴增Ct值為34.166，2×101 CFU菌Ct為37.996；布魯氏菌通用引物和探針檢測2×10 ² CFU菌擴增Ct值為33.293，2×101 CFU菌Ct為36.207，兩者差異不顯著（圖3B）。

重復(fù)性檢測。定量滅活的耐藥菌菌液稀釋至1×105 CFU·μL^-1，3 d內(nèi)分別取2 μL按照本研究建立的方法進行檢測，發(fā)現(xiàn)Ct值分別為23.152、23.598、23.270（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差=23.340±0.231），重復(fù)性較好。

臨床樣品檢測。血清學(xué)共檢測120份臨床樣品，其中9份為陽性樣品。將9份陽性樣品及陽性對照按照試劑盒操作說明提取核酸后分別進行熒光定量檢測，布魯氏菌通用引物和探針檢測陽性對照Ct值為32.105，血清學(xué)陽性樣品中核酸陽性5份；耐藥株引物和探針檢測陽性對照Ct值為33.535，未發(fā)現(xiàn)臨床樣品中存在復(fù)方新諾明耐藥株（圖3C）。

3 討 論

我國羊種布魯氏菌分離株復(fù)方新諾明耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重。復(fù)方新諾明是由甲氧芐啶和磺胺甲惡唑按一定比例構(gòu)成的復(fù)方抑菌劑，抑制葉酸合成，從而抑制細菌核酸合成，影響細菌的增殖^［16］。2014年，田國忠等^［17］在重慶市首次發(fā)現(xiàn)我國人源和動物源羊種布魯氏菌分離株復(fù)方新諾明耐藥株；有研究發(fā)現(xiàn)我國煙臺^［18］、長春^［19］、興安盟^［20］、烏蘭察布^［21-22］等地區(qū)存在復(fù)方新諾明耐藥株，趙忠智等^［23］研究證實我國人源布魯氏菌復(fù)方新諾明耐藥株分布在21個省市。復(fù)方新諾明作為我國布病治療中的常用藥物，其耐藥株的存在影響布病的治療效果，鑒于我國布魯氏菌耐藥株的現(xiàn)狀，建議相關(guān)部門加大對布魯氏菌分離株藥物敏感性監(jiān)測。

目前，尚無布魯氏菌復(fù)方新諾明耐藥株的快速檢測方法。研究表明，布魯氏菌中folA和folP基因與復(fù)方新諾明耐藥相關(guān)^［16］。本研究對耐藥株的基因組測序，未發(fā)現(xiàn)folA和folP基因存在突變位點，推測我國分離株存在其他復(fù)方新諾明耐藥機制，獲得的64個突變位點可為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本研究篩選獲得12個候選位點僅有5個位點能夠用于MGB探針檢測，本研究選擇染色體1中2 014 308位點用于建立檢測方法，原因：1）該位點所在的基因在羊種1～3型標(biāo)準(zhǔn)株不存在任何核酸差異，2）以該位點設(shè)計的引物和探針對不影響布魯氏菌通用引物探針的檢測結(jié)果，3）該位點未在復(fù)方新諾明敏感的羊種布魯氏菌分離株存在變異。利用本項目建立的方法檢測血清學(xué)陽性樣品，約有50%的血清學(xué)陽性樣品核酸檢測陽性，但未發(fā)現(xiàn)復(fù)方新諾明耐藥株。這與實際情況相符。該樣品來源養(yǎng)殖場未使用復(fù)方新諾明治療病牛，且后續(xù)樣品分離獲得的布魯氏菌體外藥物敏感性檢測為復(fù)方新諾明敏感（最小抑菌濃度為0.06/1.2 μg·mL^-1，其余數(shù)據(jù)未公布）。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究利用基因組測序分析羊種布魯氏菌復(fù)方新諾明耐藥株全基因組SNPs和InDels并篩選變異位點，利用MGB探針建立熒光定量檢測耐藥株，發(fā)現(xiàn)羊種2型標(biāo)準(zhǔn)株可做為耐藥株分析的參考株，且64個SNPs和InDels為耐藥株特有；其中12個突變位點可用于建立耐藥株快速檢測方法。本研究利用染色體1中2 014 308位點的A/G多態(tài)性建立熒光定量檢測方法特異性、敏感性較好，最低能檢測2×101 CFU菌量，可用于臨床樣品的檢測。本研究為我國布病耐藥株的防控提供科學(xué)依據(jù)，同時也為臨床用藥提供參考。

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（編輯 白永平）