蒙古黃芪全基因組SSR分子標記開發與居群遺傳多樣性分析

摘要：為了解析蒙古黃芪［Astragalus membranaceus"（Fisch.）"Bge. var. mongholicus"（Bge.）"Hsiao］的遺傳多樣性及遺傳結構，本研究基于蒙古黃芪全基因組數據進行了SSR分子標記的開發及引物的設計。結果顯示全基因組內共檢索到1349個SSR位點，從單核苷酸重復至六核苷酸重復共有43種重復類型，其中二、三核苷酸重復最多，分別為6.45%和85.69%。通過對SSR分子標記有效性和多態性的篩選，得到15對引物多態信息含量變化范圍為0.076～0.462，具有良好的多態性。利用篩選出的引物對來自7個不同居群共120份蒙古黃芪樣本進行遺傳多樣性的分析，得到Shannon’s信息指數平均值為0.535，Nei’s基因多樣性指數平均值為0.422，渾源居群蒙古黃芪的遺傳多樣性最高，五寨居群蒙古黃芪的遺傳多樣性最低；居群間分化系數平均值為0.164，與AMOVA結果一致，蒙古黃芪的遺傳分化主要發生在居群內；UPGMA聚類分析將不同居群的蒙古黃芪分別聚為一支，具有一定的地域性。通過蒙古黃芪遺傳多樣性分析結果驗證了本研究開發的SSR分子標記可用于核心種質構建、良種選育與不同物種分子鑒定等研究。

關鍵詞：蒙古黃芪；基因組；SSR；遺傳多樣性

中圖分類號：S567.239 """""""文獻標識碼：A """""""文章編號：1007-0435（2025）03-0696-11

Development of Genome-Wide SSR Molecular Markers and Analysis of Population Genetic Diversity in Astragalus mongolicus

GAO Hui-xia¹，"LIANG Yun-hui¹，"YAO Miao-zhuo¹，"ZHANG Peng-fei²，"LIU Ya-ling^1，3*

（1.College of Life Science，"Shanxi Agricultural University，"Taigu，"Shanxi Province 030801，"China；"2.College of Horticulture，"Shanxi Agricultural University，"Taigu，"Shanxi Province 030801，"China；"3.Shanxi Key Lab. for Modernization of TCVM，"College of Veterinary Medicine，"Shanxi Agricultural University，"Taigu，"Shanxi Province 030801，"China）

Abstract：To elucidate the genetic diversity and structure of Astragalus membranaceus"（Fisch.）"Bge. var. mongholicus"（Bge.）"Hsiao，"this study developed SSR （Simple Sequence Repeat）"molecular markers and designed primers leveraging the whole-genome sequence data. The outcomes revealed a total of 1349 SSR loci within the genome，"encompassing 43 distinct repeat types spanning from mononucleotide to hexanucleotide，"with dinucleotide （6.45%）"and trinucleotide （85.69%）"repeats being the most prevalent. After rigorous screening for efficacy and polymorphism，"15 primer pairs were selected，"exhibiting a polymorphism information content range of 0.076 to 0.462，"indicating robust polymorphism. These optimized primers were then utilized to analyze the genetic diversity of 120 A. mongholicus"samples from seven distinct populations. The average Shannon's diversity index was 0.535，"and the average Nei's gene diversity was 0.422. Notably，"the Hunyuan population demonstrated the highest genetic diversity，"whereas the Wuzhai population exhibited the lowest. The average fixation index among populations was 0.164，"concurring with AMOVA results，"suggesting that the primary genetic differentiation occurred within populations. UPGMA cluster analysis segregated the A. mongholicus"samples from different populations into distinct clusters，"reflecting geographical patterns. This study validated the utility of the developed SSR markers for applications such as core germplasm development，"elite cultivar breeding，"and molecular identification of related species.

Key words：A. mongholicus；Genome；SSR；Genetic diversity

黃芪為豆科黃芪屬植物蒙古黃芪［Astragalus membranaceus"（Fisch.）"Bge. var. mongholicus"（Bge.）"Hsiao］和膜莢黃芪［Astragalus membranaceus"（Fisch.）"Bge.］的干燥根^［1］，具有補氣固表、利水消腫等功效，已有2000多年的藥用歷史^［2］。蒙古黃芪為主流品種，除作藥用還被廣泛應用于食品保健方面^［3］。隨著市場需求量的不斷增大，各地野生蒙古黃芪資源被無序采挖，加之生長環境不斷遭到人為破壞導致其資源利用量持續減少^［4］，現如今僅有少部分野生資源分布在山西、陜西、河北等地區^［5-6］。為了緩解野生資源利用量的壓力，人工栽培蒙古黃芪的面積及產量逐年增加，但市場調查發現，在栽培過程中存在種源混雜嚴重的現象^［7］，加重了蒙古黃芪種間基因交流或遺傳漂變的發生，造成原始種質“道地性”的喪失，影響到優良種質基因的篩選和育種工作的順利進行。因此，研究蒙古黃芪遺傳多樣性與遺傳結構，為其資源保護與可持續利用提供科學依據。

簡單重復序列（Simple sequence repeats，"SSR）是一段由單核苷酸至六核苷酸基元串聯重復組成的DNA序列，長度通常為200 bp之內，廣泛存在于真核生物基因組中。SSR序列具有共顯性、高多態性、易于操作等優點，已成功應用于苦蕎［Fagopyrm tataricum （L.）"Gaertn.］^［8］、防風［Saposhnikovia divaricatanbsp;（Turcz.）"Schischk.］^［9］、紫蘇［Perilla frutescensnbsp;（L.）"Britt.］^［10］等多種藥用植物遺傳多樣性分析、親緣關系鑒定以及指紋圖譜的構建等方面^［11-12］。在蒙古黃芪的SSR開發與應用中，賀潤麗等^［13］利用蒙古黃芪轉錄組數據開發了19對SSR分子標記，可以準確反映20份蒙古黃芪和膜莢黃芪樣本間的差異；劉亞令等^［14］利用同科植物甘草的10對SSR引物對380份蒙古黃芪和膜莢黃芪的遺傳多樣性和遺傳分化進行了分析，并發現蒙古黃芪的遺傳多樣性高于膜莢黃芪。相較于使用轉錄組數據開發SSR分子標記，全基因組序列覆蓋范圍更廣，不僅可以在基因表達區進行開發，還可以在非編碼區域開發得到更具特異性和穩定性的標記，更好地反映物種的遺傳變異^［15-16］。因此，本試驗基于蒙古黃芪全基因組數據進行SSR位點的開發與引物設計，并對來自7個不同居群共120份蒙古黃芪樣本進行遺傳多樣性的分析，為后續蒙古黃芪分布格局的解析、種質資源的保護及分子輔助育種等研究提供有效的分子標記工具。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗蒙古黃芪樣本采自山西、寧夏、內蒙古、甘肅、河北與陜西6個省份，共7個居群120份樣本（表1）。將采集的新鮮嫩葉于干燥硅膠中保存，帶回實驗室進行蒙古黃芪基因組DNA的提取。

1.2 DNA的提取

將干燥的蒙古黃芪葉片放入高通量組織研磨儀中進行研磨，采用改良的CTAB法^［17］提取基因組DNA，利用核酸蛋白儀檢測DNA樣本的濃度，測定A₂₆₀/A₂₈₀的值。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣本的質量。

1.3 基因組SSR位點開發及引物設計

蒙古黃芪樣本質檢合格后，首先利用磁珠富集、純化大片段DNA（大于15 k）。隨后，對片段化的DNA進行損傷及末端修復，純化后使用SQK-LSK109試劑盒中進行連接反應，完成文庫構建。使用Qubit對構建好的DNA文庫進行定量檢測。接著，將純化后的文庫使用PromethION P48測序儀進行測序。然后使用Oxford Nanopore GUPPY（version 4.0.2）軟件將高通量測序得到的原始圖像數據文件經堿基識別后轉化為fast5原始數據，結果以FASTQ文件格式存儲。隨后，使用Oxford Nanopore GUPPY（version 3.0）軟件對原始數據進行質量評估，過濾掉測序質量值Qlt;7的低質量reads，得到有效數據。最后，使用NextDenovo軟件進行組裝得到完整的蒙古黃芪基因組序列。

使用MISA（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）對蒙古黃芪基因組序列進行SSR位點的分析與檢索，參數設定為：單核苷酸重復10次，二核苷酸重復6次，三核苷酸至六核苷酸各重復5次，復合型SSR中2個簡單完整型SSR之間的距離小于100 bp。使用Primer 3.0（https：//Primer3.ut.ee）對SSR位點進行篩選并設計對應的引物，引物設計原則：GC含量在40%～60%之間，Tm值在50℃～60℃之間，上下游引物Tm差值不超過5℃，產物大小在500 bp之內，引物長度在18～23 bp之間。隨機選取均勻分布于蒙古黃芪染色體并且產物大小在500 bp之內的20對SSR引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 SSR-PCR擴增

PCR擴增反應體系的總體積為10 μL，其中10×PCR Buffer（含Mg²⁺）1 μL，上下游引物各0.25 μL，2.5 mmol·L^-1"dNTP 0.8 μL，5 U·μL^-1"Taq酶0.25 μL，模板DNA 3 μL，ddH₂O 4.45 μL。擴增的程序為：95℃預變性5 min；94℃變性40 s，55℃退火50 s，72℃延伸45 s，35個循環；72℃再延伸10 min。

擴增后的產物采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。

1.5 數據處理

采用人工方式進行讀帶，將電泳條帶轉化為0/1矩陣，使用PowerMarkerV3.25軟件計算SSR引物的多態性信息含量（PIC）、等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Shannon’s信息指數（I）、期望雜合度（He）、觀察雜合度（Ho）。使用GenAlex 6.503軟件計算蒙古黃芪不同居群的等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Shannon’s信息指數（I）、Nei’s基因多樣性（H）、期望雜合度（He）、觀察雜合度（Ho）、居群內近交系數（Fis）、總居群近交系數（Fit）、居群間遺傳分化系數（Fst）、基因流（Nm）等遺傳多樣性參數；使用GenAlex 6.503軟件蒙古黃芪居群進行分子方差檢驗（AMOVA）；使用STRUCTURE軟件進行遺傳結構的分析，將居群分組數設定為2～7，每個K值運算重復10次，將結果在StructureSelector（https：//lmme.ac.cn/StructureSelector/）中可視化進行蒙古黃芪最佳居群分組數的預測；使用MEGA 7.0^［18］軟件中的UPGMA（非加權算術平均值聚類法）進行聚類分析，繪制居群聚類圖。

2 結果與分析

2.1 蒙古黃芪全基因組中SSR位點的分布

2.1.1 基因組中SSR在染色體上的分布特點 本試驗對蒙古黃芪全基因組數據進行SSR位點的檢索（表2），得到19 822條序列共存在1349個SSR位點。SSR位點發生頻率為5.83%，出現頻率為6.81%，平均分布距離為15 421 bp。其中有1011條序列僅包含1個SSR位點，144條序列包含1個以上SSR位點，以復合物形式存在的SSR位點有97個。蒙古黃芪全基因組8條染色體序列總長度約為1.40 Gb，其中Chr3包含SSR位點最多為318個，Chr6包含SSR位點最少為97個（圖1）。

2.1.2 SSR位點的重復類型與重復次數 蒙古黃芪基因組中共得到六種不同的SSR位點重復類型（圖2），主要集中在二、三核苷酸重復類型上。其中單核苷酸重復為77個，占全部SSR比例為5.71%；二核苷酸重復為87個，所占比例為6.45%；三核苷酸重復最多為1156個，所占比例為85.69%；四核苷酸重復最少為2個，所占比例為0.15%；五核苷酸重復為5個，所占比例為0.37%；六核苷酸重復為22個，所占比例為1.63%。

所有SSR類型重復次數中，5次重復的最多有634個，所占比例為47.00%；其次6次重復為333個，所占比例為24.68%；14次重復的最少有7個，所占比例為0.52%；≥15次重復為47個，所占比例為3.48%。總體上，當重復次數為5時，SSR位點數量為最多，隨著重復次數的增大，SSR位點數量呈現遞減趨勢。在單核苷酸重復中，10次重復的SSR數量最多（44個），所占比例為57.14%；二核苷酸重復中，6次重復的數量最多（41個），所占比例為47.13%；三核苷酸重復中，5次重復的數量最多（613個），所占比例為53.03%；四核苷酸重復中，僅有6次重復和11次重復，數量均為1；五、六核苷酸重復均為5次重復最多，數量和所占比例分別為3，18和60%，81.82%。

圖1 SSR位點在蒙古黃芪染色體上的分布情況

Fig.1 Distribution of SSR loci on chromosome of A. mongholicus

圖2 SSR位點重復次數

Fig.2 Repeat times of SSR loci

2.1.3 SSR位點基元重復類型及數量 對蒙古黃芪基因組SSR核苷酸重復基元的類型進行分析，結果如圖3所示。在1349個SSR位點共有43種重復基元類型，從單核苷酸重復基元至六核苷酸重復分別為77，87，1156，2，5和22。單核苷酸重復類型為A/T（68個，出現頻率為5.04%），C/G（9個，0.67%）（圖3A）；二核苷酸重復類型為AC/GT（10個，0.74%），AG/CT（58個，4.30%），AT/AT（19個，1.41%）（圖3B）；三核苷酸重復類型有10類（圖3C），其中AAC/GTT（235個，17.42%），AAG/CTT（262個，19.42%）重復類型為最多；四核苷酸重復類型為ACAT/ATGT（2個，0.22%）；五核苷酸重復類型有5類（圖3D），六核苷酸重復類型有22類（圖3E），重復數目均為1個，出現頻率均為0.07%。

2.2 蒙古黃芪基因組DNA提取

本試驗利用CATB法對7個不同居群共120份蒙古黃芪樣本的基因組DNA進行了提取，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖4），結果顯示樣品條帶清晰明亮，符合SSR-PCR擴增體系對DNA質量的要求。

2.3 蒙古黃芪SSR引物多態性檢測與篩選

2.3.1 SSR引物多態性篩選 本實驗將合成的20對SSR引物對120份蒙古黃芪基因組DNA進行SSR-PCR擴增，通過6%聚丙烯酰胺凝膠電泳對引物進行多態性的篩選（圖5）。結果得到20對引物中有15對引物可擴增出目標條帶，且條帶清晰明亮，具有較好的重復性和豐富的多態性，可用于后續蒙古黃芪植物遺傳多樣性試驗中（表3）。剩余5對引物為不能擴增出條帶或條帶單一不具有多態性。

2.3.2 SSR引物多態性信息 本實驗利用PowerMarkerV3.25軟件計算SSR引物的Na，Ne，I，Ho，He，PIC（表4）。結果得到15對SSR引物序列包含多態性位點的Na變化范圍為1.714～2.000，平均值為1.933個；Ne變化范圍為1.099～1.923，平均值為1.655；I變化范圍為0.178～0.670，平均值為0.535；Ho變化范圍為0.059～0.789，平均值為0.371；He變化范圍為0.088～0.478，平均值為0.368；PIC變化范圍為0.176～0.498，平均值為0.405，有14對引物呈現中度多態性，1對引物呈現低度多態性。表明本試驗篩選得到的15對引物具有良好的多態性。

2.4 蒙古黃芪遺傳多樣性分析

2.4.1 蒙古黃芪遺傳多樣性分析 使用GenAlex 6.503對7個居群120份蒙古黃芪樣本進行遺傳多樣性的分析（表5）。不同居群的蒙古黃芪的Na范圍為1.733～2.000，均值為1.933；Ne范圍為1.564～1.739，均值為1.655；I范圍為0.485～0.573，均值為0.535；H范圍為0.384～0.456，均值為0.422；Ho范圍為0.318～0.467，均值為0.371；He范圍為0.339～0.418，均值為0.381。由此可得，蒙古黃芪遺傳多樣性水平最高的居群為渾源，最低的居群為五寨。其中，野生蒙古黃芪不同居群I的均值為0.559，栽培蒙古黃芪不同居群I的均值為0.526，表明野生蒙古黃芪遺傳多樣性高于栽培居群。

2.4.2 蒙古黃芪遺傳分化分析 使用GenAlex 6.503對7個居群120份蒙古黃芪樣本進行遺傳分化分析。結果如表6所示。Fis的范圍為-0.674～0.805，均值為0.008，表明蒙古黃芪居群雜合子不足，特別是位點HQ-19表現雜合子不足最明顯；Fit的范圍為-0.624～0.880，均值為0.148，同樣表明蒙古黃芪居群雜合子不足；Fst的范圍為0.015～0.391，均值為0.164；Nm的范圍為0.389～16.362，均值為3.880，表明蒙古黃芪居群間遺傳分化較小，基因流水平較高。

2.4.3 蒙古黃芪AMOVA分析 使用GenAlex 6.503軟件對7個居群的蒙古黃芪進行AMOVA分析，結果表明（表7），蒙古黃芪居群間的遺傳變異率為13%，居群內遺傳變異率為87%。居群間遺傳變異率小于居群內遺傳變異率，說明蒙古黃芪的遺傳變異主要發生在居群內。

2.4.4 蒙古黃芪遺傳結構分析 使用STRUCTURE軟件基于貝葉斯模型對7個居群蒙古黃芪進行遺傳結構分析，當ΔK值達到最大時對應的K值為模擬的最佳居群數。將分組數設定為2～7，每個K值運算重復10次，得到K值與ΔK值的關系曲線圖（圖6），結果表明當K=4時，ΔK=2.820達到最大值，此時可以將7個蒙古黃芪居群分為4組（圖7），每個居群都有四種顏色的參與，說明蒙古黃芪基因具有復雜的遺傳背景，每個居群樣本都顯示有較為強烈的基因漸滲。

2.4.5 蒙古黃芪不同居群聚類分析 使用GenAlex 6.503計算蒙古黃芪不同居群間的遺傳距離，利用MEGA 7.0構建UPGMA系統發育樹。結果表明（圖8），7個不同居群的蒙古黃芪樣本優先按照地理進行聚類，不同居群的樣本之間出現少量混雜。與STRUCTURE結果一致，7個居群分為四組，第一組為隴西居群和子洲居群聚為一支；第二組為渾源居群與隆德居群聚為一支；第三組為主要為內蒙古居群先與承德居群聚為一支，再與五寨居群聚為一支，其中有7個隴西樣本、5個子洲樣本、4個渾源樣本和1個隆德樣本混雜；第四組為內蒙古居群中2個樣本聚為一支。

3 討論

本試驗基于蒙古黃芪全基因組測序數據進行SSR位點的檢索，共得到1349個SSR位點分布在1155條序列中，發生頻率為5.83%，出現頻率為6.81%，平均分布距離為15 421 bp。蒙古黃芪基因組SSR數量低于丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）^［19］、罌粟（Papaver somniferum"L.）^［20］等植物，可能是由于物種的基因組大小和結構以及在SSR開發過程中設定的篩選標準不同。蒙古黃芪基因組大小為1.40 Gb，設定SSR篩選標準為1～6核苷酸重復依次為10，6，5，5，5，5，而丹參基因組大小為2.40 Gb，設定2～6核苷酸重復依次為6，4，3，3，2，罌粟基因組大小為2.22 Gb，設定1～6核苷酸重復依次為10，6，4，3，3，3。另外，物種獨特的遺傳背景導致基因組發生不同程度的突變也會對包含的SSR位點信息造成不同程度的改變。

本試驗通過對蒙古黃芪基因組中SSR位點信息進行分析，發現SSR位點重復類型較為豐富，1～6核苷酸均有分布，二、三核苷酸重復最多，分別占總SSR位點的6.75%，85.69%，表明蒙古黃芪可能起源較晚但進化水平較高，與綠豆［Vigna radiata"（L.）"Wilczek］^［21］、黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）^［22］、三七［Panax notoginseng （Burk.）"F. H. Chen］^［23］等物種相似。二、三核苷酸重復頻率相較四、五、六核苷酸重復頻率高，可能是由于二、三核苷酸形成相對容易，結構穩定且存在突變偏好性，從而導致重復積累的數量較多。SSR核苷酸重復基元結構共有43種，其中，優勢基元主要為A/T，AG/CT，AAG/CTT，與蒙古黃芪轉錄組數據中SSR堿基偏好性相同^［24］，也與楊梅（Myrica rubar"Sieb. et Zucc.）^［25］、甘草（Glycyrrhiza uralensis"Fisch.）^［26］、天麻（Gastrodia elata"Bl.）^［27］等物種的結果一致，均以A/T為主要重復單元，堿基重復類型偏好性可能由以下因素造成：一是基因組DNA中CpG島的甲基化，通過脫氨基作用，甲基化的胞嘧啶C很可能轉變為胸腺嘧啶T^［28］；二是G/C堿基的穩定性，難以解鏈導致A/T堿基偏好性；三是自然選擇、遺傳背景、地理分布等因素，這些因素都有可能對物種基因組的結構產生一定的影響，從而導致特定的SSR重復基元類型占據主導地位^［29-30］。

利用篩選出的15對SSR引物對7個不同居群共120份蒙古黃芪樣本進行遺傳多樣性分析，得到蒙古黃芪的I，h高于巴戟天（Morinda officinalis F. C."How）^［31］、廣金錢草［Desmodium styraci folium （Osb.）"Merr.］^［32］、紫花苜蓿（Medicago sativa L.）^［33］等藥用植物，表明蒙古黃芪的遺傳多樣性較為豐富。其中，野生蒙古黃芪居群的平均遺傳多樣性高于栽培居群，說明野生蒙古黃芪具有更豐富的遺傳變異類型和更強的適應環境變化能力^［34］。另外，子洲地區的野生蒙古黃芪居群遺傳多樣性略低于隆德和內蒙古地區的栽培居群的遺傳多樣性，可能是因為隆德和內蒙古地區在栽培過程中種源復雜導致其遺傳多樣性略高^［35］。蒙古黃芪的Fst為0.164，居群間分化較小。AMOVA分析同樣表明蒙古黃芪居群間遺傳分化主要來源于居群內，Nm為3.880，與劉亞令^［36］、王敖^［37］等研究一致，即蒙古黃芪居群間遺傳分化水平較低，基因流水平較高，這可能與蒙古黃芪具有自交不親和的特性有關^［38］。同時蒙古黃芪所處自然環境相對一致，在一定程度上也降低了居群間遺傳分化。對蒙古黃芪居群結構分析發現，不同居群間的樣本出現少量混雜的現象，這可能是由于蒙古黃芪在栽培過程中種源的不確定及種苗引種栽培或運輸等過程中促進基因在不同居群間流動，從而降低了地理因素對居群遺傳結構的影響，導致不同居群的部分樣本相互混雜。

4 結論

本試驗基于蒙古黃芪基因組進行SSR分子標記位點的開發，共得到1349個SSR位點。選取20對SSR引物合成后進行篩選，得到15對多態性良好的SSR引物。利用篩選出的引物對來自7個不同居群共120份蒙古黃芪樣本進行遺傳多樣性及遺傳結構的分析，結果得到蒙古黃芪具有較豐富的遺傳多樣性，其中渾源居群的遺傳多樣性最高，五寨居群的遺傳多樣性最低；AMOVA分析表明蒙古黃芪遺傳分化主要發生在居群內；UPGMA聚類分析表明蒙古黃芪優先以地理聚類。蒙古黃芪遺傳多樣性分析結果驗證了本研究開發的SSR分子標記可用于蒙古黃芪核心種質構建、良種選育與物種鑒定等研究。

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（責任編輯""付宸）

引用格式：高慧霞， 梁云慧， 姚妙卓，"等.蒙古黃芪全基因組SSR分子標記開發與居群遺傳多樣性分析[J].草地學報，2025，33（3）：696-706

Citation：GAO Hui-xia， LIANG Yun-hui， YAO Miao-zhuo， et al.Development of Genome-Wide SSR Molecular Markers and Analysis of Population Genetic Diversity in"Astragalus mongolicus[J].Acta Agrestia Sinica，2025，33（3）：696-706

基金項目：國家自然科學基金（32070378）；山西農業大學生物育種工程項目（YZGC136）；山西省現代農業產業技術體系建設專項資金（2021-11）資助

作者簡介：高慧霞（2001-），女，漢族，河南項城人，碩士研究生，主要從事藥用植物遺傳學研究，E-mail："ghxokng@163.com；*通信作者Author for correspondence，"E-mail："lylzpf@126.com