小黑麥葉綠體基因組密碼子偏好性分析與基因功能相關性分析

摘要：為揭示小黑麥（Triticale）的密碼子使用偏好性及其影響因素，用CodonW 1.4.2和在線軟件CUSP（Codon Usage and Synonymous Condon Usage Profile）對小黑麥葉綠體基因組中52個編碼序列（Coding sequence，CDS）特征進行分析。結果表明：小黑麥葉綠體基因組密碼子第三位主要偏向以A/U為主；有效密碼子數（Effective number of codon，ENC）值在37.64～61.00之間，平均值為47.31，大于45的有42個；密碼子適應指數（Codon adaptation index，CAI）在0.12～0.33之間，平均值為0.17，說明小黑麥葉綠體基因組密碼子偏好性較弱；16個均以A/U結尾的密碼子被篩選為最優密碼子。中性繪圖、ENC-GC_3s和偏倚性繪圖分析（Parity Rule 2，PR2-plot）結果表明多數功能基因的密碼子使用偏好性受自然選擇壓力影響為主。小黑麥葉綠體基因組中與光合作用密切相關的基因可能受到了突變和選擇的強烈作用，使這些基因的密碼子使用頻率具有共同特征，表現為密碼子使用模式與基因功能有較大的相關性。

關鍵詞：小黑麥；葉綠體基因組；密碼子偏好性；最優密碼子

中圖分類號：S544.9 """""""文獻標識碼：A """""""文章編號：1007-0435（2025）03-0707-12

Correlation Between Codon Usage Patterns and Gene Functions in the Chloroplast Genome of Triticale

TIAN Tian，"ZHANG Yin-xia，"DU Wen-hua^*

（College of Grassland Science，"Gansu Agricultural University/Key Laboratory of Grassland Ecosystem，"Gansu Agricultural University，"Ministry of Education/Pratacultural Engineering Laboratory of Gansu Province/Sino-U.S. Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability，"Lanzhou，"Gansu Province 730070，"China）

Abstract：To investigate the codon usage bias and its influencing factors in triticale （Triticale），"CodonW 1.4.2 and the online tool CUSP （Codon Usage and Synonymous Condon Usage Profile）"were used to analyze the characteristics of 52 coding sequences （CDS）"in the chloroplast genome of triticale. The results showed that the third codon position in the triticale chloroplast genome predominantly favored A/U bases. The effective number of codons （ENC）"ranged from 37.64 to 61.00，"with an average of 47.31，"and 42 sequences had ENC values greater than 45. The codon adaptation index （CAI）"ranged 0.12-0.33，"with an average of 0.17，"indicating a weak codon usage bias in the triticale chloroplast genome. Sixteen codons ending in A/U were identified as optimal codons. Neutral plotting，"ENC-GC3s analysis，"and PR2-plot analysis （Parity Rule 2）"revealed that the codon usage bias of most functional genes was mainly influenced by natural selection. Genes in the triticale chloroplast genome closely related to photosynthesis were likely subjected to strong mutation and selection pressures，"resulting in shared codon usage patterns among these genes. This suggests a significant correlation between codon usage patterns and gene functions.

Key words：Triticale；Chloroplast genome；"Codon usage bias；"Optimal codon

葉綠體是一種半自主細胞器，通過光合作用將太陽能轉化為生物能，參與了許多其他化合物的合成^［1-4］，葉綠體基因組是其實現活躍的代謝功能的必要條件^［3-4］。單個葉綠體基因組的詳細表征與比較葉綠體基因組學可以作為功能基因組研究的基礎^［5］，也可以指導葉綠體基因工程的試驗^［6-7］。葉綠體基因轉化具有外源基因表達效率高、穩定遺傳、定點整合以及沒有位置效應現象等優點^［8-9］，可以用來開發分子標記、系統發育分析、種群水平研究、基因分型和定位等研究^［10］。密碼子是生物體遺傳信息和蛋白質翻譯之間轉化的橋梁，在實現遺傳信息的傳遞和表達上起到了至關重要的作用。蛋白質翻譯過程中，翻譯為同種氨基酸的不同密碼子稱為同義密碼子，同義密碼子在組合頻率上也有所差異，這種現象稱為密碼子偏好性（Codon usage bias，"CUB）^［11］。同義密碼子偏好性可能是由進化過程中基因上的不同因素造成的^［12］，是基因表達的一種微調方式^［13］。分析目標基因或受體植物的基因密碼子使用模式，可以為構建植物成熟穩定的葉綠體轉基因系統奠定基礎^［14-15］。研究表明，密碼子偏好性由自然選擇和突變共同決定，前人提出了“選擇-突變-漂移”假說和“中性理論”假說^［16］，前者認為密碼子的使用偏倚性是由最優密碼子的選擇壓力和非同義密碼子的突變-漂移所決定，后者認為同義密碼子的突變是中性選擇，與選擇壓力無關^［17-18］。除此之外，GC含量的高低、上下游依賴性核苷酸的組成、種群大小以及基因表達水平和長度等因素也會對密碼子的偏倚性產生影響^［11］。同時，密碼子的使用偏好會影響mRNA折疊、翻譯延伸和蛋白折疊，從而對基因的表達水平產生不同程度的影響^{［13，19］}。

小黑麥（Triticale）是由小麥屬（Triticum）和黑麥屬（Secale）經過屬間雜交和染色體數加倍而人工育成的新品種^［20］。小黑麥雜種優勢強，具有產量高、品質好以及抗逆性強等優勢，是繼苜蓿、飼用玉米后的在西北地區的優質飼草作物^［21］。同時，小黑麥越冬性能好，在高寒農牧交錯區能夠錯季種植，保證了應季作物的正常播種，同時減少了冬春季節農田裸露帶來的環境問題^［22-25］。小黑麥六倍體葉綠體基因組已完成測序（GenBank登錄號："ON422331.1），但其密碼子偏好性研究尚未有見報道。明確小黑麥葉綠體基因的密碼子偏好性是開展小黑麥葉綠體基因工程的基礎之一，此工程在改良植物性狀和提高抵抗病蟲害等方面具有重要作用^［26］。培育高產、抗病性強、抗逆性強的小黑麥一直是遺傳改良的目標，但受到小黑麥遺傳背景復雜、倍性多樣和傳統育種周期長等問題的限制。分子育種一定程度上可以緩解這些問題，但外源基因的表達水平不穩定，會受到密碼子偏好性的影響^［27］。另外，規律間隔成簇短回文重復序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）基因編輯技術中，Cas9蛋白的表達量在基因編輯中起著關鍵作用。Cas9主要通過sgRNA的引導定位到目標DNA序列進行特異性切割DNA雙鏈從而在DNA斷裂時引入突變實現基因的敲除、插入或替換，因此，Cas9的定位效率直接影響到編輯效率，而Cas9的定位效率與其表達量有關^［28-30］。Ma等人^［31］研究發現，影響Cas9定位效率的因素主要有以下幾點：1）不同啟動子驅動的sg RNA靶向的位點突變率相似；2）高GC含量（高于50%）具有更高的編輯效率；3）所有堿基都具有相似的編輯效率。這一發現擴大了有效基因組編輯目標的選擇范圍，不限于U3啟動子的A和U6啟動子的G的常規靶標^［28］。研究表明，密碼子的使用模式會影響基因的表達^［13］，Shan等^［32］對密碼子進行優化了Cas9，靶向水稻OsPDS基因的突變率達14.5%～20%，Zhang等^［33］使用了兩種密碼子類型的Cas9（h Sp Cas9，p Sp Cas9）研究靶向水稻除草劑抗性基因BEL基因，結果表明，p Sp Cas9比h Sp Cas9的編輯效率高了7.42倍，差異可能與p Sp Cas9轉基因植物中較高水平的Cas9蛋白積累相關。因此，Cas9的表達量影響其定位效率，從而影響基因編輯效率。而當前尚未有任何報道關于Cas9在小黑麥葉綠體基因組密碼子偏好性中的關系。因此，通過研究小黑麥葉綠體基因組密碼子的使用特征，確定最優密碼子，并探討植物葉綠體基因組的密碼子使用模式與基因功能的相關性，該研究結果能夠為提高基因在小黑麥中表達、預測及外源受體的選擇提供一定參考，同時，在小黑麥基因編輯的研究中，能夠為提高小黑麥Cas9表達從而提高編輯效率提供一定的研究價值。

1 材料與方法

1.1 序列獲取

從NCBI數據庫下載小黑麥的葉綠體基因組序列（GenBank登錄號："ON422331.1）87條，剔除長度小于300 bp的序列、去除重復序列、去除非ATG作為起始密碼子的序列、刪掉異常終止密碼子和CDS內部存在終止密碼子的序列后，得到52條序列用于后續分析。

1.2 密碼子組成分析

用CodonW 1.4.2對小黑麥葉綠體基因組的52條CDS序列進行同義密碼子相對使用度（Relative usage of synonymous codons，RSCU）、密碼子適應指數（Codon adaptation index，CAI）、密碼子偏好指數（Codon bias index，CBI）和最優密碼子使用頻率值（Frequency of optimal codons，FOP）分析；使用在線軟件CUSP（http："http://emboss.toulouse.inra.fr/cgi-bin/emboss/cusp）統計得到的52條序列的密碼子數量（Codon Number，CN）、密碼子不同位置堿基的GC含量，包括第1位GC含量（GC₁）、第2位GC含量（GC₂）、第3位GC含量（GC₃）以及GC總含量（GC_all），同時計算出GC₁和GC₂的平均值（GC₁₂）利用R語言進行相關性分析。

1.3 中性繪圖

以GC₃為橫坐標，GC₁和GC₂的平均值GC₁₂為縱坐標繪制中性圖。若密碼子偏好性僅受到突變的影響，則基因分布于對角線上；若受到選擇壓力的影響更大，則基因分布于對角線周圍^［34］。同時，可通過橫縱坐標GC₃和GC₁₂的相關性來判斷密碼子偏好性受到的影響因素，若兩者顯著相關，回歸系數（對角線斜率）較大且接近于1，則密碼子受到的影響因素主要為突變，反之（回歸系數接近于0）則為選擇壓力^［35］。

1.4 ENC-plot分析

有效密碼子數（Effective Number of Codon，ENC）用于度量同義密碼子的偏倚性，當ENC值=20時，表示每個氨基酸只使用一個密碼子，為極端偏好；ENC值=61，表示密碼子偏向隨機使用，不存在使用偏好。以公式（1）為標準曲線^［36］，即期望值，每點代表一個基因。

公式：

（1）

每個基因與標準曲線（即期望值）之間的距離為判斷影響密碼子偏倚性因素的標準。當ENC實際值與期望值相差較大，即距離標準曲線較遠時，偏倚性受選擇壓力的影響，反之（即ENC實際值距離標準曲線較近時）則主要由堿基組成決定，即受突變的影響較大。為了更好地反映ENC實際值與期望值之間的差異，可以通過計算ENC比值頻率分布，以-0.05～0.05的范圍為界對差異進行量化分析。在此范圍內則接近期望值，即密碼子偏好性受到突變的影響較大；在此范圍外則影響密碼子偏好性的主要因素為選擇壓力。

1.5 PR2-plot繪圖分析

以A₃/（A₃+T₃）為縱坐標，以G₃/（G₃+C₃）為橫坐標，繪制PR2偏倚平面圖，每個基因的堿基組成在一個平面上表示，中心點表示密碼子無偏好性使用時的狀態（A=T，C=G），而其他各點與中心點的矢量距離表示偏倚的方向和程度^［37］，以此來判斷突變壓力和自然選擇是否影響了DNA雙鏈上核苷酸的組成。如果4種堿基的使用頻率相似，則基因坐落于中線或靠近中心點，表示密碼子偏好性只受到突變的影響；反之坐落于中心點四周或遠離中心點，表示同時受到了突變和自然選擇的影響。

1.6 最優密碼子的確定

為了得到小黑麥葉綠體基因的最優密碼子，以ENC值為參考指標，篩選前后各10%的基因構建高低基因表達庫，通過Codon W1.4.2計算其RSCU值，并計算高低表達庫之間的差值（△RSCU），將△RSCU≥0.08且RSCUgt;1的密碼子篩選出，確定為最優密碼子^［38］。

2 結果與分析

2.1 密碼子組成分析

小黑麥葉綠體基因組總長為135 899 bp，從中得到87個CDS（不含假基因），經篩選而得到52個CDS序列用于后續分析。結果如表1所示，52個CDS的總密碼子數為17 152。總GC含量分布范圍為32.55%～49.20%，平均值為38.91%。GC₁，GC₂和GC₃含量分布范圍分別在32.75%～56.28%，29.87%～55.56%，22.22%～48.28%之間，平均值為GC₁（46.83%）gt;GC₂（39.62%）gt;GC₃（30.28%），表明密碼子分布的不均勻性，GC含量較低，主要以A/U結尾。其中，GC₂和GC_all的差異不大（39.62%和38.91%），而GC₃最小（30.28%），所有GC含量均在50%以下，說明小黑麥葉綠體基因組密碼子向A/U偏倚。

根據偏倚性分析結果（表1），ENC在37.64～61.00之間（平均值為47.31），其中有42個基因的ENC值大于45，表明小黑麥葉綠體基因組密碼子偏好性相對較弱。CAI范圍為0.12～0.33，平均值為0.17，趨近于0，表明小黑麥葉綠體基因組密碼子偏好性弱。CBI取值為-0.21～0.24，均值為-0.09，則最優密碼子使用次數小于密碼子平均使用次數；FOP取值為0.27～0.56，均值為0.35，則最優密碼子占同義密碼子數量的比值較小。以上結果表明小黑麥葉綠體基因組密碼子使用偏好性較弱。

各參數相關性分析表明（圖1），GC_all與GC₁，GC₂以及GC₃呈極顯著相關關系（Plt;0.01），GC₁和GC₂呈顯著相關關系（Plt;0.05），但GC₃和GC₁，GC₂相關性差，表明小黑麥葉綠體基因組密碼子第1，2位堿基組成上較相似，而與第3位存在較大差異。ENC與GC₃呈極顯著相關關系，而與GC₂呈極顯著負相關關系，與GC₁沒有相關性，表明密碼子第2位和第3位對ENC具有偏性影響。密碼子數CN與ENC，GC₁，GC₂，GC₃以及GC_all均無相關性，說明小黑麥密碼子堿基受偏性影響較小。

密碼子總體ESCU分析表明（圖2），Leu，Ser和"Arg分別由6個密碼子編碼，Val，Pro，Thr，Ala和Gly分別由四個密碼子編碼，其余除了Met和Trp兩種氨基酸分別由一個密碼子編碼以及Lie由3個密碼子編碼之外，剩余所有的氨基酸均由兩個密碼子編碼。

由圖3可知，編碼Ile的密碼子AUU數量最多，有711個；編碼Ter的密碼子UGA最少，僅有12個。小黑麥葉綠體基因組中密碼子RSCUgt;1的有33個，其中29個以A/U結尾，RSCU＜1的有31個，具有明顯的A/U偏向性。

2.2 中性繪圖分析

通過中性繪圖來判斷小黑麥葉綠體基因組密碼子偏好性的主要影響因素，結果如圖4。GC₁₂的取值范圍在0.3577～0.5348之間，GC₃取值范圍在0.2222～0.4828之間，僅有1個基因在對角線位置下方，其余所有基因均位于對角線位置上方，說明主要的影響來源是自然選擇；GC₁₂與GC₃回歸系數為0.119，相關系數R為0.0671，相關性弱，另外，GC含量僅為47.43，進一步表明自然選擇是主要的影響因素。同時，涉及保守假設性葉綠體ORF、核糖體大亞基蛋白和翻譯起始因子3種功能中的4個基因位于對角線附近甚至下方，說明在一定程度上，個別基因受到突變的影響較大。

2.3 ENC-plot分析

ENC-plot繪圖（圖5）分析發現，實際ENC值與期望值存在較大差異，除了涉及NADH脫氫酶亞基、核糖體大亞基蛋白和核糖體小亞基蛋白3種功能中的4個基因ENC值接近期望值（標準曲線）以外，其他基因的ENC值均高于或低于期望值，即大多數與標準曲線的距離較遠，說明自然選擇是密碼子偏好性的主要影響因素。后續通過統計小黑麥葉綠體基因ENC比值頻率以更為準確地反映差異，結果表明（圖6），僅有11個基因分布于-0.05～0.05之間，占比21.15%，其余41個基因（占比78.85%）全部在此范圍外，距離ENC標準期望值較遠，進一步說明小黑麥葉綠體基因組密碼子偏好性的主要影響因素是選擇壓力。

2.4 PR2-plot繪圖分析

通過PR2-plot分析密碼子偏倚性，當突變為唯一影響因素時，四種堿基在圖中的表現為均衡，即集中于中心點，而當有選擇壓力同時存在時，根據影響大小而不同程度偏離中心點，向四周不均勻排布。小黑麥葉綠體基因組PR2-plot分析結果表明（圖7），涉及保守假設性葉綠體ORF和RNA聚合酶亞基兩種功能中的2個基因接近于中心點，偏向程度小，表明其密碼子偏好性受到突變的影響較多。其他大多數基因均坐落于平面圖的下方，尤其以右下方基因數量最多，說明在堿基出現的頻率上G₃gt;C₃，T₃gt;A₃；RuBisCO酶大亞基全部基因落于左下方，即密碼子偏倚性為C₃gt;G₃，T₃gt;A₃。圖中可看出各基因分布不均勻，以平面圖左下和右下居多，說明4種堿基的使用頻率存在一定的差異，且同時受到突變和選擇的多重因素的影響。

整體而言，多數基因在A₃/U₃偏倚表現出了功能相關性：光合系統I亞基、光合系統II亞基、細胞色素c基因、NADH脫氫酶亞基、成熟酶等基因的密碼子都更偏好使用U₃；RNA聚合酶亞基的眾多基因中，僅有一個未表現出明顯的A₃/U₃偏倚，其余基因都更偏好使用U₃；核糖體小亞基蛋白的眾多基因中，多數都更偏好使用A₃。然而，在C₃/G₃偏倚方面，整體上未表現出明顯的基因功能相關性。小黑麥葉綠體基因組密碼子偏好性受到了突變和選擇的共同影響，而這種影響可能與相應基因的功能是相關的。

2.5 最優密碼子的確定

通過構建高、低表達基因庫，將△RSCU≥0.08且RSCU≥1的密碼子選出作為最優密碼子，共得到GCU，AGA和CGU等16個最優密碼子（GCU，AGA，CGU，CAA，GGU，CAU，AUU，UUA，AAA，UUU，CCU，AGU，UCU，ACA，ACU，GUU），全部以A/U結尾（表2），這與GC₃、RSCU分析結果一致。

3 討論

研究在獲得了小黑麥的完整葉綠體基因組序列之后，探究了52個CDS的密碼子使用特征及其與基因功能的關系。首先，將小黑麥葉綠體基因組中的蛋白編碼序列作為一個整體進行分析而不考慮其功能基因時，密碼子組成特征分析表明，GC含量較低，且GC₁（46.83%）gt;GC₂（39.62%）gt;GC₃（30.28%），說明密碼子分布不均，偏向于A/U結尾，這與前人在高粱（Sorghum bicolor"L.）、葦狀羊茅（Festuca arundinacea"Schreb）、大麥（Hordeum vulgare"subsp. vulgare）以及多年生黑麥草（Lolium perenne"L.）等23種禾本科（Gramineae）植物中的研究結果一致^［39-40］。根據RSCU分析結果，小黑麥葉綠體基因組的編碼氨基酸的密碼子中，偏好使用和非偏好使用的密碼子種類幾乎持平，但總體偏好使用的密碼子多以A/U結尾，結果與此前研究所報道的雙子葉植物葉綠體密碼子使用偏好特征一致^{［14，41-42］}，符合“高等植物密碼子傾向于使用A/U結尾”的假設^［43］，說明植物葉綠體密碼子的總體使用模式在進化過程中比較保守。密碼子使用特征的數據主要應用于優化或重新設計基因，以便在異源系統中獲得高表達或最佳表達，本研究確定了小黑麥葉綠體基因組的16個最優密碼子，在進行基因工程研究時，針對最優密碼子的優化將有利于調控相關基因的表達^［38］。

將密碼子與基因功能相聯合分析時，不同功能的基因使用的密碼子具有較大的區別。研究表明，CAI值越高，基因的密碼子使用偏好性越強，在生物體內的表達水平越高^［44］。小黑麥葉綠體基因組的52個CDS中，各基因的CAI值在0～1.0之間，平均值為0.17，密碼子適應指數CAI總體偏小，說明該基因組的密碼子使用偏好性總體偏弱。相較而言，小黑麥的rpl16，rps8，ycf68，ndhG和rpl20等基因的密碼子使用偏好性較弱，而psbB，rps3，psbD，rbcL和psbA等基因的密碼子使用偏好性較強，說明psbB，rps3，psbD等基因可能在小黑麥的葉綠體中表達水平較高。事實上，光合作用功能是葉綠體的最重要的功能^［3］，這意味著與光合作用相關的psbB，rps3，psbD等基因必然有較高的表達水平。

對于各基因，ENC的值介于20（當每個氨基酸只使用一個密碼子時存在極端偏差）和61（當所有密碼子都被隨機使用時）之間，小黑麥葉綠體CDS的ENC保持在較高水平（均值為47.31gt;45.00），說明密碼子使用的偏好性總體較弱^［45］，與CAI的分析結果一致。值得注意的是，ENC值高達61的inFA屬于翻譯起始因子，通過與核糖體、mRNA和tRNA的相互作用，幫助識別起始密碼子并啟動蛋白質合成，但在小黑麥的葉綠體基因組上所有密碼子都被隨機使用，說明該基因表達量低，起到特定識別的能力較弱。中性繪圖、ENC-GC_3s和PR2-plot均顯示絕大多數功能基因的密碼子使用的偏好性受突變和自然選擇壓力的共同影響，且以自然選擇的影響為主。生物現有同義密碼子使用模式的形成是突變、自然選擇和基因翻譯效率的遺傳漂變之間平衡的結果^［46-47］，小黑麥葉綠體基因組中與光合作用密切相關的重要功能基因必然會受到突變和選擇的強烈作用，也許正是這些原因導致了小黑麥葉綠體基因組上與光合作用相關基因的密碼子使用常表現出更鮮明的共同特征。

本研究結果可以為小黑麥葉綠體基因組在基因工程中的應用提供依據。密碼子使用模式及其影響因素的分析結果表明，小黑麥葉綠體基因，尤其是與光合作用密切相關的基因，可能是因受到選擇突變和選擇的強烈影響，其密碼子使用模式與基因功能的有較大的相關性。將來的研究可以通過結合生物信息學和系統生物學等技術手段，進行大規模的葉綠體基因組密碼子偏好性研究，以探究葉綠體基因組密碼子偏好性與基因表達調控之間的關系，從而揭示更多的密碼子使用模式規律和生物學意義，以便更好地了解葉綠體基因表達的分子機制和密碼子使用模式在生物演化中的作用和意義。

4 結論

通過對小黑麥葉綠體基因組密碼子偏好性特征及其影響因素進行多角度分析，篩選出16個最優密碼子，明確了密碼子偏好性較弱，但對A/U具有明顯的偏倚性，造成偏倚性的主要因素為選擇壓力。研究表明小黑麥葉綠體基因組密碼子使用模式與功能基因之間具有較大的相關性，尤其是光合作用相關基因的密碼子使用模式上，更偏向于使用A₃/U₃。研究結果可為小黑麥基因工程提供理論基礎，特別是在提高基因表達量的設計上或能提供研究基礎。

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（責任編輯""閔芝智）

引用格式：田甜， 張銀霞， 杜文華.小黑麥葉綠體基因組密碼子偏好性分析與基因功能相關性分析[J].草地學報，2025，33（3）：707-718

Citation：TIAN Tian， ZHANG Yin-xia， DU Wen-hua.Correlation Between Codon Usage Patterns and Gene Functions in the Chloroplast Genome of"Triticale[J].Acta Agrestia Sinica，2025，33（3）：707-718

基金項目：農業生物育種重大專項（2023ZD0402605-02）；國家自然科學基金（32260339）；甘肅省高等學校產業支撐計劃（2022CYZC-49）；甘肅省重大專項（21ZD4NA012）；西藏重大專項（XZ202101ZD003N）資助

作者簡介：田甜（1997-），女，苗族，貴州銅仁人，博士研究生，主要從事草地生物多樣性研究，E-mail：1138115730@qq.com；

* 通信作者"Author for correspondence，E-mail：duwh@gasu.edu.cn