膜芯片技術(shù)在肉類(lèi)食品摻假檢測(cè)中的應(yīng)用

關(guān)鍵詞：膜芯片，肉類(lèi)食品，摻假檢測(cè)

0引言

近些年來(lái)，肉類(lèi)食品摻假事件屢見(jiàn)不鮮，一些不法商販用低價(jià)肉冒充高價(jià)肉甚至用非食用肉類(lèi)偽裝成食用肉類(lèi)，不僅損害了消費(fèi)者的利益，還可能帶來(lái)嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題[1]。2013年的“馬肉風(fēng)波”

震驚整個(gè)歐洲，瑞典、英國(guó)、法國(guó)等國(guó)家發(fā)現(xiàn)部分超市售賣(mài)的牛肉漢堡中摻雜了馬肉成分。在我國(guó)，肉類(lèi)食品的摻假現(xiàn)象也十分普遍，目前市面上主要的摻假手段有用價(jià)格相對(duì)低廉的豬肉、鴨肉偽造牛羊肉，用馬肉冒充驢肉，用豬血、雞血冒充鴨血等，普通消費(fèi)者僅憑感官或經(jīng)驗(yàn)很難加以辨別。

分子生物學(xué)技術(shù)為肉類(lèi)食品的鑒定開(kāi)辟了新的途徑，如PCR、熒光PCR、基因芯片等技術(shù)在動(dòng)物源性成分的鑒別中都有廣泛應(yīng)用[2-5]。膜芯片技術(shù)是一種以硝酸纖維素膜或尼龍膜為支持物的可視基因芯片技術(shù)，該技術(shù)利用反向斑點(diǎn)雜交原理，將一組特異性寡核苷酸探針固定于支持膜表面，待測(cè)樣品PCR產(chǎn)物經(jīng)變性形成的單鏈DNA與膜芯片上的探針雜交，經(jīng)化學(xué)顯色即可形成肉眼可見(jiàn)的雜交信號(hào)點(diǎn)[6-8]。該方法可在一個(gè)支持膜上固定多個(gè)探針，因此可一次性對(duì)樣品中多種動(dòng)物源性成分進(jìn)行檢測(cè)。

本研究參照GB/T35917—2018《常見(jiàn)動(dòng)物源性成分快速測(cè)定膜芯片法》[9]，采用動(dòng)物源性成分膜芯片檢測(cè)試劑盒對(duì)市售的畜禽肉、速凍調(diào)理肉制品、動(dòng)物血制品等肉類(lèi)食品中11種動(dòng)物源性成分（包括豬、黃牛、羊、雞、兔、驢、貂、狐、鼠、牦牛、鴨）進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)簽比對(duì)進(jìn)行符合性判定，從而了解肉類(lèi)食品摻假情況，為肉類(lèi)食品質(zhì)量安全監(jiān)管提供依據(jù)，并為膜芯片技術(shù)在多種肉類(lèi)食品摻假檢測(cè)中的應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

肉類(lèi)食品樣品25份，為2021年至2024年從中小型餐館、食堂等抽檢的樣品，包括牛肉及其制品6份、羊肉及其制品7份、豬肉及其制品4份、鴨血制品4份、雞肉制品3份、混合肉制品1份。

QC-AN-003肉糜中豬源性成分定性分析質(zhì)控樣品（中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心）。

血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）；11種動(dòng)物源性成分膜芯片檢測(cè)試劑盒（四川華漢三創(chuàng)生物科技有限公司）。

1.2主要儀器與設(shè)備

Quintix224-1CN電子天平（精度0.1mg，德國(guó)Sartorius公司）；Scientz-48高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；V4DS025渦旋振蕩器（德國(guó)IKA公司）；TUS-200P恒溫金屬浴振蕩器（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；5424R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；NanodropOneC超微量分光光度計(jì)（美國(guó)ThermoFisher公司）；Veriti定性PCR儀（美國(guó)ABI公司）；MFS-8基因膜芯片檢測(cè)工作站（四川華漢三創(chuàng)生物科技有限公司）；Tacta手動(dòng)移液器（德國(guó)Sartorius公司）。

1.3方法

1.3.1樣品處理與DNA提取

從樣品的不同部位分多點(diǎn)取樣，共約1.0g，置于2mL圓底離心管中，加入不銹鋼珠，用高通量組織研磨器進(jìn)行研磨處理，鴨血制品如解凍后為液體狀態(tài)可不需研磨。稱(chēng)取研磨后的樣品30mg，鴨血制品可直接吸取200μL，用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒按操作說(shuō)明提取基因組DNA。提取后的基因組DNA用超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度和A260/A280比值，DNA濃度應(yīng)大于100ng/μL，A260/A280比值應(yīng)在1.8～2.0之間，適宜于PCR擴(kuò)增。

1.3.2多重PCR擴(kuò)增

按膜芯片檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制多重PCR反應(yīng)體系（總體積為20μL）：多重PCR反應(yīng)預(yù)混液（2×MultiplexPCRMasterMix）10μL，DNA模板5μL，無(wú)核酸酶水5μL。同時(shí)，用含有11種動(dòng)物源性成分的基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，用不含有這11種動(dòng)物源性成分的基因組DNA為陰性對(duì)照，用無(wú)核酸酶水為空白對(duì)照，作為試驗(yàn)過(guò)程的質(zhì)量控制。

PCR反應(yīng)參數(shù)：50℃、2min，1個(gè)循環(huán)；95℃、10min，1個(gè)循環(huán)；95℃、30s，55℃、30s，68℃、15s，30個(gè)循環(huán)；68℃、5min，1個(gè)循環(huán)；4℃，保存。

1.3.3膜芯片雜交

將多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于95℃變性5min后，置于4℃保存?zhèn)溆谩２捎没蚰ば酒瑱z測(cè)工作站進(jìn)行自動(dòng)雜交。按試劑盒說(shuō)明書(shū)，將已變性的PCR產(chǎn)物加入500μL雜交液（R2）中配制雜交體系液，將堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素（AP-Streptavidin）按1：250比例加入酶標(biāo)液（R4）中配制酶標(biāo)體系液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

將配制好的雜交體系液、酶標(biāo)體系液以及雜交清洗液（R3）、酶標(biāo)清洗液1（R5）、酶標(biāo)清洗液2（R6）、顯色液（R7）、膜芯片放入儀器指定位置，加載雜交程序，自動(dòng)運(yùn)行雜交過(guò)程：雜交（45℃、30min）；雜交清洗（52℃、5min）2次；酶標(biāo)（42℃、15min）；酶標(biāo)清洗1（42℃、3min）1次；酶標(biāo)清洗2（37℃、3min）2次；顯色（37℃、10min）。

1.3.4結(jié)果判讀

檢測(cè)結(jié)果可用肉眼直接判讀，顯藍(lán)色斑點(diǎn)為陽(yáng)性雜交信號(hào)，雜交點(diǎn)未顯色為陰性雜交信號(hào)，也可用膜芯片掃描儀進(jìn)行識(shí)別分析，結(jié)果應(yīng)與肉眼判讀相一致。膜芯片探針?lè)植既鐖D1所示，內(nèi)參為18SrRNA基因探針，PC為陽(yáng)性雜交對(duì)照，NC為陰性雜交對(duì)照。PC和NC用于監(jiān)測(cè)雜交過(guò)程是否正常，PC點(diǎn)顯色、NC點(diǎn)不顯色表明雜交過(guò)程正常，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。

2結(jié)果與分析

2.1試驗(yàn)質(zhì)量控制

試驗(yàn)過(guò)程的質(zhì)量控制檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。空白對(duì)照為無(wú)核酸酶水，內(nèi)參和11種成分均未顯色；陽(yáng)性對(duì)照為含有11種動(dòng)物源性成分的基因組DNA，內(nèi)參和所有11種成分均有顯色；陰性對(duì)照為不含11種動(dòng)物源性成分的基因組DNA，本實(shí)驗(yàn)采用狗肉基因組DNA作陰性對(duì)照，只有內(nèi)參顯色，11種成分均未顯色。以上結(jié)果表明試驗(yàn)過(guò)程質(zhì)量控制符合要求。

2.2實(shí)際樣品檢測(cè)

對(duì)25份不同類(lèi)別肉類(lèi)食品中的11種動(dòng)物源性成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。有2份樣品檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)簽明示不符。在6份牛肉及其制品中，有1份樣品（編號(hào)1）未檢出黃牛成分，而檢出鴨、羊成分，表明該樣品是以鴨肉、羊肉冒充牛肉。在7份羊肉及其制品中，有1份樣品（編號(hào)7）檢出鴨、羊成分，表明該樣品用鴨肉摻假。4份豬肉及其制品只檢出豬成分，4份鴨血制品只檢出鴨成分，3份雞肉制品只檢出雞成分，1份混合肉制品檢出豬、雞、鴨成分，以上樣品檢測(cè)結(jié)果均與標(biāo)簽明示相符，沒(méi)有摻假成分。部分樣品的膜芯片顯色結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.3質(zhì)控樣品檢測(cè)

對(duì)肉糜中豬源性成分質(zhì)控樣品（QC-AN-003）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。質(zhì)控樣品為雞肉基質(zhì)中添加豬肉的混合肉，結(jié)果檢出豬成分，與證書(shū)相一致，表明該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3討論

本研究利用膜芯片技術(shù)對(duì)本地區(qū)抽檢的25份肉類(lèi)食品中11種動(dòng)物源性成分進(jìn)行檢測(cè)，被測(cè)樣品包含生鮮肉、速凍調(diào)理肉制品和鴨血制品，肉源類(lèi)別涵蓋了常見(jiàn)的牛、羊、豬、雞、鴨5種類(lèi)別。將檢測(cè)結(jié)果與產(chǎn)品標(biāo)簽明示比對(duì)判定摻假情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2份牛、羊肉樣品與明示不符，存在以鴨肉冒充、摻假的情況。

本研究所采用的膜芯片技術(shù)以多重PCR為基礎(chǔ)，在一張膜芯片上集成了豬、黃牛、羊、雞、兔、驢、貂、狐、鼠、牦牛、鴨等11種動(dòng)物源性成分的探針，從而實(shí)現(xiàn)樣品中11種成分的同時(shí)檢測(cè)。研究結(jié)果表明該技術(shù)在多種不同類(lèi)別的肉類(lèi)食品樣品中都有較好的應(yīng)用效果，而且實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)通量高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于多種肉類(lèi)食品摻假成分的快速篩查，為肉類(lèi)食品的質(zhì)量安全監(jiān)管提供有效的技術(shù)保障。