高效液相色譜熒光檢測法測定飲用水中微囊藻毒素-LR

摘 """""要：首次建立了一種測定飲用水中微囊藻毒素-LR的高效液相色譜熒光檢測法。樣品經(jīng)HLB柱進行固相萃取凈化后，以V（質量分數(shù)0.1%三氟乙酸甲醇溶液）∶V（水）= 60∶40的混合液為流動相，在流速1.0 mL·min^-1、柱溫40 ℃、進樣量10.0 μL條件下，使用CLC-ODS色譜柱和熒光檢測器進行液相色譜分析。結果表明：微囊藻毒素-LR在激發(fā)波長251 nm和發(fā)射波長296 nm下響應值最高；在質量濃度為1.00～250 μg·L^-1時回歸方程為y=4.066 2x+4.810 8，相關系數(shù)為0.999 9，檢出限為0.008 μg·L^-1，定量限為0.028 μg·L^-1；微囊藻毒素-LR在空白水樣和實際水樣中的平均加標回收率分別為81.75%～90.08%和88.33%～95.89%，其相對標準偏差分別為3.58%～6.82%和3.10%～5.20%。該方法快速、高效、簡單，具有良好的精密度和準確度，適用于飲用水中微囊藻毒素-LR的檢測分析。

關 "鍵 "詞：微囊藻毒素-LR；高效液相色譜；熒光色譜法；飲用水

中圖分類號：TQ450.2+6；X830.2 文獻標志碼：A ""文章編號：1004-0935（2025）03-0528-06

微囊藻毒素（MCs）是由藍藻（水華魚腥藻、銅綠微囊藻、顫藻等）發(fā)生水化時產(chǎn)生的一種環(huán)狀七肽毒素類化合物，其同分異構體較多，且具有強致癌性和持久污染性。微囊藻毒素MC-LR（L代表亮氨酸，R代表精氨酸）是毒性最強、分布最廣的一種構型^[1-6]。由于MCs化學性質穩(wěn)定，很難將其從水體中有效去除，水體中微囊藻毒素的威脅已成為國內(nèi)外普遍關注的衛(wèi)生和環(huán)境問題，世界衛(wèi)生組織和我國《生活飲用水衛(wèi)生標準》均規(guī)定了地表水源地、生活飲用水MCs的質量濃度不得高于"""""1.0 μg·L^-1（以MC-LR為代表）^[7-11]。目前檢測水中微囊藻毒素-LR的方法主要有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜紫外法、氣相色譜法/質譜聯(lián)用、超高效液相色譜法/質譜聯(lián)用等。酶聯(lián)免疫法易出現(xiàn)假陽性，定性定量不準確，且難以區(qū)分毒素類型^[12-14]。檢測微囊藻毒素-LR常采用的高效液相色譜紫外檢測法，其選擇性較差，靈敏度較低，對基質復雜含量較低樣品的檢測結果干擾較大，甚至無法檢測^[15-17]。采用氣相色譜質譜聯(lián)用法進行檢測雖然提高了實驗結果的準確度，但樣品前處理時需要對微囊藻毒素進行衍生化，實驗步驟較多，操作繁瑣，耗時耗力^[18-19]。目前超高效液相色譜質譜法憑借其較高的分離度和""靈敏度已廣泛在醫(yī)療、食品、藥品和環(huán)境等相關科研領域內(nèi)使用，但該方法儀器普及率低，運行維護成本高，尚不能大規(guī)模推廣使用^[20-23]。目前尚無利用高效液相色譜法配合熒光檢測器來測定水環(huán)境中微囊藻毒素-LR的報道，該研究首次通過采用HPLC熒光色譜法測定微囊藻毒素-LR，該方法具有前處理操作簡便快捷、分析靈敏度高等優(yōu)點，因此利用此方法對水中微囊藻毒素-LR含量的檢測具有重要指導意義。

1 "材料與方法

1.1 "儀器與試劑

美國Agilent 1260高效液相色譜儀；中國?？艫utoSPE-06全自動固相萃取儀；中國超藝達PS-60超聲波清洗機；美國MilliporeMilli-Q超純水機；中國天津恒奧HPD-25無油真空泵；天津津騰1 L溶劑過濾器；德國Eppendorf"20～200 μL、30～300 μL和100～1 000 μL手動移液器；美國Waters HLB固相萃取柱；日本島津150 mm×6.0 mm，5.0 μm CLC-ODS色譜柱；中國CNW無水硫酸鈉柱；美國安捷倫0.45 μm針頭過濾器；中國新亞0.45 μm有機系、0.45 μm水系濾膜。甲醇，色譜純，美國TEDIA公司；三氟乙酸（TFA），分析純，中國成都科龍公司；純凈水，屈臣氏集團；標準物質溶液（微囊藻毒素-LR），20 μg·mL^-1，SB05-287-2012，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所。

1.2 "分析方法

1.2.1 "水樣的預處理

量取1 000 mL水樣，并通過0.45 μm的水系膜過濾。

1.2.2 "固相萃取

活化柱子：先用10 mL甲醇（3.0 mL·min^-1）預洗HLB萃取柱，再用10 mL的純水（3.0 mL·min^-1）活化HLB萃取柱。過濾后的1 000 mL水樣""""""（10 mL·min^-1）通過已活化好的HLB萃取柱進行樣品富集。用5 mL水（10 mL·min^-1）淋洗HLB萃取柱后，再用20%甲醇水溶液10 mL（流速為 """"5.0 mL·min^-1）淋洗萃取柱，然后以20 mL·min^-1空氣（20 mL）氣推萃取柱，接著干燥萃取柱，氮吹25 min。再用質量分數(shù)0.1%三氟乙酸的甲醇溶液作為洗脫液2 mL清洗注射泵（流速20 mL·min^-1），接著用10 mL 洗脫液洗脫萃取柱（流速2.0 mL·min^-1），然后氮氣氣推固相萃取柱（10 mL，流速為 """"""20 mL·min^-1），并過無水硫酸鈉干燥柱脫水收集。40 ℃氮吹濃縮定容至1.0 mL，用0.45 μm膜過濾，待測。

1.2.3 "檢測條件

色譜柱為CLC-ODS柱，SHIM PACK150 mm×6.0 mm，5.0 μm；熒光檢測器激發(fā)波長（λ_ex）"為251 nm，發(fā)射波長（λ_em）為296 nm；流動相為0.1%三氟乙酸甲醇溶液和水，其體積比為60∶40，現(xiàn)配現(xiàn)用，使用前過0.45 μm的有機濾膜；柱溫為（40±1） ℃；流速為1.0 mL·min^-1；進樣量為10 μL；采用外標法定量。

2 "結果與討論

2.1 "前處理條件的優(yōu)化

一般通過優(yōu)化固相萃取前處理分離條件（選擇合適的SPE柱和洗脫液以及改變洗脫時流速等），能有效降低基質干擾，顯著提高目標物的回收率。

2.1.1 "SPE萃取柱的優(yōu)化

根據(jù)微囊藻毒素MC-LR的分子特性，一般選用C₁₈或者HLB小柱作為SPE萃取柱來富集凈化水樣中的MC-LR^[24]?？疾炝薈₁₈和HLB小柱對相同空白加標水樣中MC-LR的富集凈化情況，結果表明HLB小柱不僅吸附洗脫效果更好，而且回收率更高更穩(wěn)定。另外HLB小柱還具有較好的pH耐受""性^[25]，故選擇HLB柱作為固相萃取柱。

2.1.2 "洗脫液的優(yōu)化

微囊藻毒素MC-LR易溶于乙腈、甲醇等有機溶劑，但乙腈作為洗脫液時，回收率偏低，基質干擾大，且樣品分析成本高、毒性大；而甲醇提取效果好，并隨著洗脫液中甲醇比例的增加其回收率也越高越穩(wěn)定，雜質干擾越小^[26]。在洗脫液甲醇溶液中加入適量的三氟乙酸，能夠促進MC-LR中多肽羧酸基團質子化過程，同時也減少了MC-LR基本基團和色譜柱硅膠表面之間的相互作用，有利于洗脫^[27]?？疾炝擞?0 mL甲醇、0.05%三氟乙酸的甲醇、0.1%三氟乙酸的甲醇和0.5%三氟乙酸的甲醇分別作為洗脫液的效果。結果表明，質量分數(shù)0.1%三氟乙酸的甲醇溶液作為洗脫液時，MC-LR的平均加標回收率最高。故選用質量分數(shù)0.1%三氟乙酸的甲醇溶液作為洗脫液。

2.1.3 "洗脫時流速的優(yōu)化

對比了不同流速（1.0、2.0、5.0 mL·min^-1）條件下的洗脫效果（10 mL質量分數(shù)0.1%三氟乙酸的甲醇溶液作為洗脫液）。結果表明，洗脫液在流速為2.0 mL·min^-1時，MC-LR的平均加標回收率最高。若洗脫時速度過快，在固液兩相中溶質無法達到平衡，會降低分離度，但洗脫時速度過慢，在溶液中溶質會擴散，進而導致分離度降低。因此，選擇"""2.0 mL·min^-1作為洗脫時的流速。

2.2 "熒光檢測條件的選擇

采用高效液相色譜的熒光檢測器光譜掃描方法對微囊藻毒素-LR的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜分別進行了掃描，進而確定了MC-LR的激發(fā)和發(fā)射波長，分別為λ_ex=251 nm和λ_em=296 nm。在λ_ex=238 nm時不同λ_em波長下的響應值如圖1所示^[28]，在λ_em=296 nm時不同λ_ex波長下的響應值如圖 2所示，在"""""""λ_ex"=251 nm時不同λ_em波長下的響應值如圖 3所示。

2.3 "方法的線性關系和檢出限

準確量取20 μg·mL^-1的微囊藻毒素-LR標準溶液1 mL于10 mL容量瓶中，用色譜純甲醇稀釋至刻度線，混勻備用，此時貯備液中微囊藻毒素-LR 的質量濃度為2.0 μg·mL^-1。將微囊藻毒素-LR的貯備液用色譜純甲醇分別稀釋至1、5、10、50、100、250 μg·L^-1等6個不同質量濃度梯度，待儀器穩(wěn)定后分別上樣測定。10 μg·L^-1微囊藻毒素-LR標準色譜圖如圖4所示。

再分別以不同微囊藻毒素-LR質量濃度（x）作為橫坐標，以其信號響應值色譜峰面積（y）作為縱坐標，繪制MC-LR的標準曲線，結果如圖5所示。由圖5可以看出，MC-LR質量濃度為1～250 μg·L^-1時，其質量濃度與響應值之間的線性關系很好，線性的回歸方程為y=4.066 2x+4.810 8，其相關系數(shù)為0.999 9。該方法檢出限的測定是在樣品中通過添加工作曲線最低質量濃度標準物質并經(jīng)過前處理，然后按照該方法測定，以儀器響應信號的3倍和10倍信噪比（S/N）分別計算方法的檢出限和定量限^[29]。該方法測定的微囊藻毒素-LR的檢出限和定量限分別為0.008、0.028 μg·L^-1，遠低于國標GB 3838—2002中規(guī)定的微囊藻毒素-LR控制的標準限值1 μg·L^-1和國標中規(guī)定的微囊藻毒素-LR的檢出限0.1 μg·L^-1（GB/T 20466—2006）和0.06 μg·L^-1（GB/T 5750.8—2023.16）。

該方法中的微囊藻毒素-LR在遠低于現(xiàn)行國家標準中規(guī)定的質量濃度范圍內(nèi)，其響應值與質量濃度之間仍具有很好的線性關系，且方法檢出限也遠低于國標方法要求，故該方法能夠滿足飲用水中微囊藻毒素-LR的分析測定要求。

2.4 "方法的精密度和準確度

2.4.1 "空白水樣的加標回收實驗

分別量取實驗室的空白水樣各1 000 mL（n=6），向空白水樣中添加適量微囊藻毒素-LR的標準物質，加標后空白水樣中微囊藻毒素-LR的質量濃度分別為0.002、0.050、0.200 μg·L^-1，經(jīng)上述前處理的方法處理定容至1.0 mL后，進行上機分析測定，結果如表1所示。由表1可以看出，微囊藻毒素-LR的平均加標回收率為81.75%～90.08%，其相對標準偏差為3.58%～6.82%，遠高于現(xiàn)行國家標準中微囊藻毒素-LR的加標回收率（60%），且滿足分析檢測的相關技術要求^[30]。

2.4.2 "實際水樣的加標回收實驗

按照上述前處理方法和色譜條件對畢節(jié)市倒天河水庫和利民水庫的水樣分別進行了分析測定，所測樣品均未檢出微囊藻毒素-LR；再分別取利民水庫的水樣各1 000 mL（n=6），添加適量微囊藻毒""素-LR的標準物質，加標后實際水樣中微囊藻毒""素-LR的質量濃度分別為0.002、0.050、0.200 μg·L^-1，經(jīng)上述前處理的方法處理定容至1.0 mL后，進行上機分析測定，結果如表2所示。由表2可以看出，微囊藻毒素-LR平均加標回收率為88.33%～95.89%，其相對標準偏差為3.10%～5.20%。該方法的實際水樣加標回收率較高，優(yōu)于國標，具有很強的實踐可操作性，適用于對飲用水中痕量微囊藻毒素-LR的測定。

3 "結"論

首次建立了一種測定飲用水中微囊藻毒素-LR的熒光檢測高效液相色譜法。實驗結果表明，微囊藻毒素-LR的激發(fā)和發(fā)射波長分別為λ_ex=251 nm和λ_em=296 nm。該方法條件下微囊藻毒素-LR在遠低于現(xiàn)行國家標準中規(guī)定的質量濃度范圍內(nèi)，其響應值與質量濃度之間仍具有很好的線性關系，其檢出限為0.008 μg·L^-1，定量限為0.028 μg·L^-1，遠低于現(xiàn)行國家標準。微囊藻毒素-LR在空白水樣和實際水樣中的平均加標回收率分別為81.75%～90.08%和88.33%～95.89%，相對標準偏差分別為3.58%～6.82%和3.10%～5.20%，加標回收率較高，均優(yōu)于國標。該方法對飲用水中微囊藻毒素-LR的測定具有準確度和靈敏度高、樣品前處理快捷簡便、基質干擾小等優(yōu)點，能夠滿足飲用水中微囊藻毒素-LR的分析監(jiān)測要求，可以適用于測定飲用水中微囊藻毒""""素-LR的質量濃度，具有重要的實際指導意義。

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Determination of Microcystin-LR in Drinking Water by HPLC Fluorescence Chromatography

ZHAO Wenjin¹， LIU Peiyou¹， GU Guifei^"2

（1. Ecological Environment Monitoring Center of Bijie， Bijie Guizhou 551700，"China;

2. Zhouyi Tea Plantation of Bijie， Bijie Guizhou 551700，"China）

Abstract："A high performance liquid chromatography （HPLC） method for the determination of microcystin-LR in drinking water was developed for the first time. Samples were extracted and purified by HLB solid phase extraction column. The SHIM PACK CLC-ODS column was used as chromatography column， and the mobile phase was a mixture of methanol （0.1%TFA）-water （volume ratio 60∶40） at a flow rate of 1.0 mL·min^-1. The column temperature kept 40 ℃， injection volume was 10.0 μL and the fluorescence detector was used to detect the sample. The results showed that MC-LR had the highest response when the wavelength stayed at λ_ex=251 nm/λ_em=296 nm. The regression equation of MC-LR was y=4.066 2x+4.810 8 when the linear range was 1.00–250 μg·L^-1， and the linear correlation coefficient of MC-LR was 0.999 9. The limit of quantitation of MC-LR was 0.028 μg·L^-1， and the detection limit was 0.008 μg·L^-1"in water. The average recoveries"of MC-LR in blank water samples"and actual water samples"were"""81.75%–90.08%"and 88.33%–95.89%， and their relative standard deviations"（RSD） were"3.58%–6.82%"and 3.10%–5.20%. The method is fast， efficient， simple， has good accuracy and precision， and is suitable for the detection and analysis of microcystin-LR in drinking water.

Key words："Microcystin -LR; HPLC; Fluorescence chromatography; Drinking water