植入式醫療器械用光敏聚酰亞胺的生物相容性評估

摘要：評估2種市售聚酰亞胺（PI）和1種光敏聚酰亞胺（PSPI）的生物相容性，以探索其在生物微系統和神經假體應用中的潛力。采用ISO 10993生物相容性標準，對杜邦-卡頓箔HN、HD微系統PI 2611和富士膠片光敏聚酰亞胺7020進行體外評估。材料經過固化、滅菌處理后，使用掃描電子顯微鏡觀察細胞在材料上的生長情況，并通過MTS測定法測定細胞活力。同時，利用納米壓痕技術研究材料在細胞培養過程中的力學性能和穩定性。MTS測定結果表明，與聚乙烯陰性對照和常規PI相比，PSPI無細胞毒性。成纖維細胞在PSPI基質上的粘附、形態和鋪展均優于PI 2611。施旺細胞在PI和PSPI上的形態相似。

關鍵詞：光敏聚酰亞胺；生物相容性；細胞培養；成纖維細胞；施旺細胞

中圖分類號：TQ323.7文獻標志碼：A文章編號：1001-5922（2025）02-0088-04

Biocompatibility assessment of photosensitive polyimides for implantable medical devices

MA Xinghua1，YUE Li1，SUN Yinyan1，JIANG Tingting1，WANG Yuxiang2

（1.Department of Equipment，3201 Hospital，Hanzhong 723000，Shaanxi China；

2.Shenzhen Mindray Biomedical Electronies Co.，Ltd.，Shenzhen 518000，Guangdong China）

Abstract：To evaluate the biocompatibility of 2 commercially available polyimides（PI）and 1 photosensitive poly?imide（PSPI）to explore their potential for biomicrosystem and neuroprosthetic applications.In vitro evaluation of DuPont-Kardon foil HN，HD microsystem PI 2611，and Fujifilm photosensitive polyimide 7020 using ISO 10993 biocompatibility standards.After the material was solidified and sterilized，the growth of cells on the material was observed using a scanning electron microscope，and cell viability was determined by MTS assay.At the sametime，nanoindentation technology was used to study the mechanical properties and stability of materials during cell cul?ture.The MTS assay results showed that PSPI was non-cytotoxic compared to polyethylene negative control and con?ventional PI.Fibroblast adhesion，morphology，and spreading on the PSPI matrix were superior to PI 2611.The mor?phology of Schwann cells on PI and PSPI is similar.

Key words：photosensitive polyimide；biocompatibility；cell culture；fibroblast；schwann cells

近年來的許多研究都反映了光敏聚酰亞胺的良好的生物相容性且對細胞沒有毒性。Myllymaa使用BHK-21成纖維細胞在體外評估旋涂PSPI和常規PI膜的細胞毒性[1]。PSPI測試為在200°C（PI-2771-200）和350°C（PIM-2771-350）的溫度下固化。固化溫度對ζ電位值有顯著影響（p＜0.001），但對表面能（p＝0.091）或粗糙度（p＝0.717）沒有影響[2-5]。MTS增殖測定和活/死染色的結果表明，PSPI幾乎與傳統PI和聚乙烯（陰性對照）一樣無細胞毒性。張昊博、邵樹仁等使用阻擋放電對PMDA-ODA的聚酰亞胺膜的表面進行了改性[6-8]，以優化其與人類真皮成纖維細胞培養物相互作用時的生物特性。發現了在氣體放電中處理薄膜的最佳模式。Herth E本提出了一種使用生物相容性聚酰亞胺材料制備出高性能的RFID射頻傳感器[9]。并在電磁分析中進行了模擬，以優化性能和尺寸。該研究報道的材料和制造技術可以擴展到實現基于聚酰亞胺薄層或其他生物相容性材料的其他類型的柔性和可拉伸傳感器，用于生物醫學和RFID應用[10-13]。

1試驗材料和方法

1.1試驗材料

兩種PI材料：杜邦Kapton1HN（擠出薄膜）和杜邦可紡PI 2611。光敏聚酰亞胺（Duri mide 7020，Fuji?Film）。所有前體溶液都儲存在冰箱中，并按供應使用。在使用之前，將溶液在室溫下放置4 h以解凍。旋涂機用于在硅片上均勻涂布PI和PSPI溶液；高壓釜進行材料的滅菌處理；掃描電子顯微鏡（SEM）觀察細胞在材料表面的粘附與形態；MTS細胞活力測定儀用于定量評估細胞增殖與活力；納米壓痕儀則用于研究材料在細胞培養過程中的力學性能和穩定性。

1.2試驗方法

1.2.1薄膜制備

將薄膜旋涂到通過在丙酮中超聲處理預先清潔的硅片上，在異丙醇中漂洗并暴露于紫外線臭氧中5 min。然后將薄膜在熱板上在65℃下軟烘焙5 min，然后在110℃下烘焙5 min和65℃下烤5 min。通過在氮氣中固化1 h來聚合軟烘焙樣品。測試150～450℃的固化溫度。最后，將PI和PSPI膜從Si晶片上剝離。固化薄膜的厚度約為20μm。

1.2.2熱重分析

通過TGA（TA Instruments Q500 TGA，美國）以10℃/min的升溫速率在氮氣下從室溫到600℃對PI和PSPI膜中的溶劑殘留進行評估。樣品的質量損失百分比記錄為溫度的函數。

1.2.3細胞培養

L929小鼠成纖維細胞在添加有10%（v/v）胎牛血清（FCS）和1%（v/v）L-谷氨酰胺的Dulbeccos’Modified Eagles Medium（DMEM）（Sigma，英國）中，在37℃、5%CO2氣體培養箱中培養1～4 d，具體取決于細胞融合情況。使用含有0.5 mg/mL胰蛋白酶和0.2 mg/mL乙烯二氨基四乙酸（EDTA）（Sigma，英國）的溶液收獲細胞用于傳代或試驗。

使用胰蛋白酶-EDTA將成纖維細胞從75 cm2T形燒瓶中分離，并將分離的細胞重懸在幾毫耳（體積隨細胞總數而變化）的細胞培養基中。進行細胞計數，必要時用培養基稀釋細胞懸浮液[14]。將細胞懸浮液加入24孔細胞培養板中，隨后將1 mL細胞培養基移液到孔中得到5×104個細胞/孔的細胞濃度。培養物在37℃下用5%CO2氣體孵育3 d。

1.2.4樣品提取

在這部分研究中，根據ISO 10993，通過將成纖維細胞暴露于材料提取物來模擬任何材料從基質中浸出的短期效果。每個樣品的3塊（12×3×12 mm）在120℃下高壓滅菌20 min。通過將樣品置于細胞培養基（DMEM，含有10%血清）中，37℃下經24 h，獲得提取物。將得到的液體提取物倒在培養的細胞單層上，取代營養細胞到那時的培養基。通過這樣做，向細胞提供了含有來自標本的可提取物的新鮮營養培養基，將培養物在37℃下用5%CO2氣體孵育2 d。

1.2.5電鏡試驗

細胞懸浮液接種在聚酰亞胺膜表面（5×104個細胞/孔）上。在允許細胞附著和擴散的一天后，沖洗樣品以去除外來碎屑、未附著的細胞和/或蛋白質，并主要固定在0.1M PIPES緩沖液中的4%戊二醛中。然后將樣品在0.1M HEPES緩沖液中洗滌并孵育過夜以除去未反應的初級固定劑。然后將樣品置于1%四氧化鋨（OsO4）的二級固定劑中2 h，在分級乙醇系列中脫水，并在臨界點干燥（Polaron E3000 CPD，Bal-Tec，法國）。在濺射薄金層（Poleon E5000 Sputter Coater）之后，在掃描電子顯微鏡（Philips XL30 FEG）上使用5 kV的加速電壓檢查聚酰亞胺膜上的成纖維細胞。在不同的表面上隨機拍攝顯微照片，對于每個樣品，用來自不同點的細胞重復測試至少3次。

1.2.6機械試驗

使用配備金剛石壓頭尖端的超低載荷壓痕系統（MTS，美國）測量PI和PSPI薄膜的機械性能，并使用標準熔融二氧化硅進行尖端幾何校準。采用連續剛度測量（CSM）技術記錄樣品的楊氏模量作為壓痕深度的函數[15]。手動選擇每個試樣上的壓痕位置，并對每個試樣進行一系列10個壓痕，以獲得平均楊氏模量。所有樣品均為20μm，長度為10 mm，寬度為5 mm。為了研究水對聚酰亞胺力學性能的影響，將樣品在37℃的100 mLPBS中浸泡。溶液每7 d更新一次，持續6月。將樣品浸入PBS中進行納米壓痕，以研究原位效應。

1.2.7 MTS測定

為了評估細胞活力，應用了基于非放射性MTS的細胞增殖測定法（CellTiter 96%的水溶液試劑）。MTS比色測定基于活細胞將3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑鎓溴化物還原為可溶于細胞培養基中的有色甲酰胺產物的選擇性能力。通過記錄492 nm處的吸光度來測量產生甲贊的量，該吸光度與活細胞的數量成正比。簡單地說，在細胞培養后，取出培養基，并用磷酸鹽緩沖的sa線（PBS）洗滌細胞3次。取出PBS后，立即用移液管將200μL MTS溶液移到每個含有1 ml DMEM的孔中。在37℃下用5%CO2氣體孵育1 h后，分別對所有孔上清液進行抽吸，并在492 nm（OD）的多孔板讀數器（BMG LABTECH FLUO star OPTIMA）上測量，減去492 nm處無細胞空白體積的吸光度。使用吸光度和細胞濃度之間的線性相關性來確定細胞數量。對3個單獨實驗的結果取平均值。

2結果與討論

2.1機械性能分析

楊氏模量隨PBS浸泡時間的變化如圖1所示。

所有聚酰亞胺的楊氏模量約為3～6 GPa。觀察到，浸泡在PBS中的所有樣品在前2周內的模量都有所下降，然后在剩余的浸泡時間（24周）內趨于平穩。PSPI 7020顯示出機械楊氏模量下降的百分比最小（△E/E）（5.4%），其次是PI 2611（7.3%），而KHN表現出最大的百分比下降（7.7%）。因此，PSPI 7020表現出最好的整體耐水性，機械性能變化很小。KHN表現出影響較大。

2.2細胞毒性試驗

本研究采用ISO標準生物評價醫療器械體外細胞毒性試驗方案ISO-10993-5，采用MTS法研究了PI和PSPI提取產物加入L929小鼠成纖維細胞后的體外細胞毒性[16]。所有PI和PSPI樣品在400℃下完全固化1 h。圖2顯示了用每個樣品提取物培養后L929成纖維細胞的數量。細胞也在聚乙烯提取物中培養，作為陰性對照。我們觀察到，所有樣品提取物中的L929成纖維細胞活力與在聚乙烯提取物中培養的細胞沒有顯著差異。因此，完全固化的PI和PS?PI膜對成纖維細胞生長沒有顯示出顯著的細胞毒性。

2.3掃描電子顯微鏡觀察

使用SEM成像來監測細胞形態、粘附和在各種基質上的擴散。在樣品上播種24 h后檢測兩種細胞類型：來自細胞系的小鼠L929成纖維細胞和大鼠原代雪旺細胞。懸浮液中未連接的細胞通常呈球形。在這種圓形狀態下，細胞的表面積體積比嚴重降低，細胞增殖停止，營養物質供應減少[17]。因此，細胞的不擴散是所謂的細胞粘附材料的不希望有的特性。以SEM檢查24 h后在測試表面上附著和鋪展的成纖維細胞和施旺細胞的形態（圖3和圖4）。

圖3顯示培養24 h后PI和PSPI膜上的成纖維細胞。在Kapton HN上觀察到最高密度的細胞。細胞表現出正常的成纖維細胞形態，并良好地粘附在Kapton HN的表面。細胞具有細長和多邊形的特征，表明它們能夠附著并開始在表面擴散。在PSPI 7020上，成纖維細胞緊密粘附在表面，擴散良好，生長在平坦的單層中，沒有明顯的凹陷，并表現出廣泛的絲狀延伸（絲足類）和片狀延伸（細胞質的延伸平坦區域），這兩種都是健康細胞的指標。在PI 2611上，盡管單個細胞在樣品表面擴散，但只有少數細胞粘附在表面。細胞具有更為圓形的形態，幾乎沒有絲擴張的活力差的跡象。這表明PI膜上有成纖維細胞。

如圖4所示，所有測試的候選材料都為纖維細胞的附著和擴散提供了同樣好的表面。從本研究中，可以得出結論，Kapton HN和PSPI 7020的表面同樣有利于細胞的擴散，然而，PI 2611的表面不太受成纖維細胞的青睞。研究表明，細胞在材料上的行為與材料的性質及其表面性質有關。所有這些參數也會影響最終的蛋白質吸附，從而影響細胞粘附，在選擇合適的基質和包封材料時必須考慮這些參數。

測試樣品的固化溫度對細胞擴散和附著的形態有顯著影響。PI 2611分別在200℃和400℃下固化，SEM觀察顯示成纖維細胞觀察到的不同細胞行為（如圖5所示）。

圖5說明了固化潛在植入材料對成纖維細胞生長和l增殖的影響。PI 2611樣品在200℃或400℃下固化。在這種膜上培養的成纖維細胞顯示出較差的粘附性和生存能力。相反，在完全固化的PI（在400℃下）上培養的細胞在表面擴散，產生幾個絲狀偽足。細胞在材料表面上的高粘附性通常指示良好的細胞殘基活力。400℃固化而不是200℃固化所去除的化學物質是造成差異的原因。

3結語

聚酰亞胺（PI）和光敏聚酰亞胺（PSPI）在ISO 10993生物相容性標準的評估中，展示出了良好的生物相容性。尤其是PSPI，其在MTS測定法的細胞活力測試中表現出無細胞毒性，這是與常規PI和聚乙烯陰性對照的顯著差異。此外，成纖維細胞在PSPI基質上的粘附、形態和鋪展均優于在PI 2611上，這表明PSPI可能為細胞生長提供了更加有利的環境。在細胞外觀的研究中，施旺細胞在每個PI和PSPI上的外觀相似，進一步證實了PSPI的生物相容性。

雖然上述結論仍需要更多的試驗和長期的研究來進一步確認，但初步數據表明，PSPI作為一種新型的生物材料，在生物微系統和神經假體等應用領域具有巨大的潛力。

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（責任編輯：張玉平）