不同存放環境中動物剝制標本表面微生物分析

摘 要：動物剝制標本數量迅速提升，但存放環境對其表面微生物影響的研究較少。文章應用高通量測序技術，對存放于不同環境的動物剝制標本表面微生物進行檢測分析，為動物剝制標本的維護和預防性消殺提供一定的理論依據，以期達到更好的防護效果。

關鍵詞：動物剝制標本；存放環境；高通量測序；真菌；細菌

DOI：10.20005/j.cnki.issn.1674-8697.2025.06.006

動物剝制標本是生物學研究和自然科學普及的重要材料，是自然類博物館的主要藏品之一。隨著我國經濟的快速發展和公眾文化知識需求的迅速增長，公眾對自然科學、生態系統方面的知識需求越來越大，自然類博物館建設工作也取得了迅猛發展。動物剝制標本因造型逼真、生動活潑贏得了觀眾的喜愛，具有極高的收藏、研究、展覽和科普教育價值，成為自然類博物館的優先收藏對象①。受保存條件和陳展環境影響，動物剝制標本表面附著了很多塵埃甚至雜物，特別是蟲卵和真菌、細菌等微生物，它們短暫或永久地殘留在標本上，對標本本身、觀眾和工作人員都有一定的安全隱患②。動物剝制標本表面害蟲、熏殺劑殘留等相關研究已有報道，但對標本表面微生物的相關研究較少。因此，本文以華南農業博物館館藏動物剝制標本為研究對象，分析庫房、展柜和開放性微縮景觀內標本表面真菌和細菌的種類及多樣性，為動物剝制標本和陳展環境預防性保護提供參考。

1 動物剝制標本表面微生物樣品采集及測序

華南農業博物館主建筑于1935年建成，為廣州市文物保護單位。雖全館采用恒溫恒濕系統，但因房屋本身結構問題，偶現溫濕度不穩定情形。文中所使用剝制標本皆由同一標本公司于2016年左右制作、交付，并于2019年7月統一采用溴甲烷熏蒸消殺。2019年10月，部分標本展陳于展柜和開放性微縮景觀內，其余標本存放于庫房，存放環境如圖1所示。庫房溫度設置為20 ℃，展廳溫度設置為20～26 ℃，相對濕度均設置為50%～60%。本文所使用動物剝制標本編號、類別和存放環境如表1所示。

2023年7月，采用無菌植絨棉簽對標本全表面進行輕輕梳理，擦涂標本表面，后將棉簽頭存放于無菌離心管中，液氮速凍后-80 ℃保存。采用轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）序列全長檢測樣品中真菌的多樣性，引物序列③為“F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；R：TCCTCCGCTTATTGATATGC”；采用核糖體16S V3+V4區域基因序列檢測樣品中細菌的多樣性，引物序列為“338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA；806R：GGACTACHVGGGTWTTAAT”，高通量測序由百邁克生物科技有限公司完成。

2 結果和分析

2.1 真菌ITS全長分析

真菌中非編碼區ITS序列具有較高的豐富度和分辨率，且相對變化較大，種間差異明顯，能夠反映出種屬間甚至菌株間的差異，目前已被廣泛應用于真菌多樣性及系統發育分析④。樣品測序并通過Barcode識別后，共獲得113241條序列，每個樣品至少產生11861條，平均數值為12582條。序列過濾后在97.0%的相似度水平下進行聚類、獲得OTUs（即分類操作單元，每個OTU對應于一種代表序列），進行多樣性分類學分析、多樣性分析和功能預測分析。利用維恩圖展示每組樣品之間共有和特有OTUs的數目，直觀地表現樣品間OTUs的重合情況，并結合OTUs所代表的物種，找出不同環境中的共有和特有真菌。從維恩圖（圖2左）可以看出，庫房中動物剝制標本表面真菌的OTU數目為224個，展柜中標本表面真菌的OTU數目為457個，開放性微縮景觀中標本表面真菌的OTU數目為505個。庫房中標本表面真菌的種類明顯少于展柜和開放性微縮景觀，且開放性微縮景觀中的數量最多。相對豐度較高優勢真菌門類主要有子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和羅茲菌門（Rozellomycota），其相對豐度占比分別為57.86%～67.38%、10.03%～21.35%、4.06%～23.80%。Shannon多樣性指數（圖2右）也顯示，庫房中動物剝制標本表面真菌的多樣性最低，開放性微縮景觀中標本表面真菌的多樣性最高，二者差異顯著（p=0.019）。

從不同存放環境中動物剝制標本表面真菌差異物種示意圖（圖3）可以看出，相對豐度較高且不同環境中差異顯著的動物剝制標本表面真菌物種主要有Mycothermus thermophilus（一種嗜熱桿菌）、Melanocarpus albomyces（一種嗜熱真菌）、Aspergillus heterocaryoticus（一種曲霉屬真菌）、Pichia kluyveri 克魯維畢赤酵母、Ophiocordyceps sinensis 蟲草真菌、Coprinellus sclerocystidiosus（一種假鬼傘屬真菌）、Olpidium brassicae（蕓苔油壺菌）、Vishniacozyma carnescens 卡恩斯維希尼克氏酵母、Acrophialophora levis 光滑端梗霉菌、Stolonocarpus gigasporus、Diutina catenulata、Aspergillus sydowii 聚多曲霉菌、Cladosporium endophytica（一種枝孢屬真菌）、Aspergillus costaricensis（一種曲霉屬真菌）、Scopulariopsis alboflavescens（一種帚霉屬真菌）、Fusicolla ossicola、Lophiotrema rubi、Talaromyces sayulitensis（一種籃狀菌屬真菌）、Stachybotrys chlorohalonata（一種葡萄穗霉屬真菌）。從圖3還可以直觀地看出，主要差異真菌物種中，庫房中動物剝制標本表面真菌的相對豐度遠低于展柜和開放性微縮景觀內標本。19個可鑒定到種的優勢真菌中，除Vishniacozyma carnescens、Aspergillus sydowii、Fusicolla ossicola、Talaromyces sayulitensis四種真菌在展柜內標本表面的相對豐度最高外，其余真菌均為在開放性微縮景觀中標本表面相對豐度最高。

通過FUNGuild（Fungi Functional Guild）對標本表面真菌按照營養方式進行分類和表型預測，將可信度為“Highly”和“Probable”的物種挑選出來進行可視化，結果如圖4所示，可直觀看出，不同存放環境中動物剝制標本表面真菌的營養類型差異較大。開放性微縮景觀內標本表面真菌營養類型檢測量最多，展柜內次之，庫房最少。開放性微縮景觀內動物剝制標本表面豐度最高的真菌營養類型（相對豐度＞3%）主要為動物內生真菌、植物病原真菌、糞便腐生真菌、動物病原真菌、動物寄生真菌、木腐生真菌；展柜中標本表面真菌主要營養類型為植物病原真菌、動物病原真菌、動物內生真菌、木腐生真菌、糞便腐生真菌、未鑒定腐生真菌、外生菌根真菌；庫房中標本表面真菌主要營養類型為糞便腐生真菌、未鑒定腐生真菌、植物病原真菌、寄生真菌。庫房內動物剝制標本表面未檢出動物寄生真菌、木腐生真菌、內生菌根真菌、土壤腐生真菌和葉腐生真菌，且糞便腐生真菌、植物病原真菌、植物腐生真菌的檢出種類比另外兩種環境中少。展柜內標本表面獨有某些內生菌根真菌、糞便腐生真菌。開放性微縮景觀中動物標本表面獨有某些內生菌根真菌、植物病原真菌，但也缺少一些動物病原真菌、杜鵑花類菌根、植物腐生真菌。

2.2 細菌16S rRNA V3+V4區域分析

采用Illumina NovaSeq 6000對細菌16S rRNA V3+V4區域多樣性進行高通量測序，測序結束后去除barcode、兩端引物以及部分低質量序列，去噪，雙端序列拼接并去除嵌合體序列，在97.0%的相似度水平下進行聚類、獲得OTUs，并進行多樣性分析、差異分析及功能預測分析等。測序數據顯示，各樣本Raw Tags數據量位于5萬條至8萬條之間，平均數據量約為7.6萬條，且各樣本稀釋曲線均趨于平緩，說明數據量充足。統計數據結果顯示，共檢出47個細菌門，其中主要優勢細菌門為Proteobacteria 變形菌門、Firmicutes 厚壁菌門、Bacteroidota 擬桿菌門、Acidobacteriota 酸桿菌門和Actinobacteriota 放線菌門，這5個細菌門的相對豐度總和占78%以上。此外，Chloroflexi 綠彎菌門、Patescibacteria 互養菌門、Gemmatimonadota 芽單胞菌門和Cyanobacteria 藍菌門相對豐度亦較高，占比均超1%。

不同環境中動物剝制標本表面細菌門水平相對豐度及分布如圖5所示，部分菌門差異較明顯。變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度均超25%；庫房環境最低，為25.03%；開放性微縮景觀最高，為31.47%。厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度均超過20%，庫房環境最高，為31.51%，遠高于展柜（21.19%）和開放性微縮景觀（22.09%）。擬桿菌門（Bacteroidota）的相對豐度庫房環境最高，為15.17%。酸桿菌門（Acidobacteriota）、放線菌門（Actinobacteriota）的相對豐度展柜環境最高，分別為14.73%和9.83%。

使用QIIME2軟件，對樣品Alpha多樣性指數進行評估，計算菌群豐富度指數、多樣性指數和測序深度指數，具體結果數據如表2所示。菌群豐富度指數ACE數據顯示，展柜中標本表面細菌的種類最多，開放性微縮景觀中標本表面細菌的種類最少，但差異未達到顯著水平。Shannon多樣性指數顯示，開放性微縮景觀中動物剝制標本表面細菌菌群的多樣性最高，展柜中次之，庫房中的多樣性最低。本分析中Coverage值均高0.99以上，說明本次分析結果有效反映了測序樣本中微生物的情況。

通過BugBase方法對不同環境中動物剝制標本表面優勢細菌功能及生物可解釋表型進行分析，可將細菌分為Aerobic 好氧型、Anaerobic 厭氧型、Facultatively Anaerobic 兼性厭氧型、Gram Negative 革蘭氏陰性、Gram Positive 革蘭氏陽性、Potentially Pathogenic 潛在致病性、Contains Mobile Elements 移動元件、Forms Biofilms 生物膜形成、Stress Tolerant 脅迫耐受等九個類型。圖6顯示了細菌主要類型及表型，可以看出庫房中細菌以厭氧型、革蘭氏陽性菌相對含量最高，展柜中細菌以好氧型、革蘭氏陰性菌為主，開放性微縮景觀中潛在性致病菌的相對含量最高。開放性微縮景觀中動物剝制標本表面潛在性致病細菌主要為Achromobacter 無色桿菌屬、Dok59、Thermomonas 嗜熱單胞菌屬和Xanthomonadaceae" 黃單胞菌科、Sinobacteraceae" 華桿菌科、Enterobacteriaceae 腸桿菌科。展柜中動物剝制標本表面潛在性致病菌的屬主要為Achromobacter 無色桿菌屬、Dok59、Thermomonas 嗜熱單胞菌屬和Sinobacteraceae 華桿菌科、Methylocystaceae 甲基孢囊菌科、Xanthomonadaceae 黃單胞菌科。庫房中動物剝制標本表面潛在性致病菌主要為Dok59、Thermomonas 嗜熱單胞菌屬和Enterobacteriaceae 腸桿菌科、Xanthomonadaceae 黃單胞菌科、Sinobacteraceae 華桿菌科。

3 討論

3.1 動物剝制標本表面有害物質的檢測及預防

動物標本在動物分類、動物區系、生物多樣性、保護遺傳學等教學、科研和科普教育方面具有重要的價值，特別是精美完整的動物剝制標本，兼具科學、藝術和經濟價值。一些特殊的珍稀動物剝制標本，因極度稀缺而成為寶貴的自然遺產⑤。現今動物剝制標本的保有量和展出量均大幅提升，部分自然類博物館甚至擁有上萬件動物剝制標本。但受制作時間、制作方式、存放環境等因素影響，部分動物剝制標本的保存狀態堪憂，影響了標本使用，可能還會對觀眾造成一定影響。因此，很多學者對動物剝制標本影響較大的溫濕度、光源、重金屬殘留、病蟲害等進行研究。如丁寧系統分析了館藏動物剝制標本病蟲害、殺蟲劑殘留元素等方面情況，提出對博物館自然標本預防性保護的原則及措施的建議⑥。溫彬等人對館藏動物剝制標本脫毛、開裂、蟲蛀等修復工作進行研究⑦。何亮綜述了館藏動植物標本蟲害種類及蟲害滅殺方法⑧。許永賢探析了動物標本制作過程中的有害物質及預防措施⑨。動物剝制標本的損壞是多種因素相互作用的結果。目前很多動物剝制標本長期暴露在外，溫濕度和光照對其影響很大，灰塵也會使標本變得灰暗陳舊，影響觀眾的參觀體驗，且有些灰塵本身就呈酸性或堿性，與空氣中的水汽結合易損害標本，甚至灰塵中還帶有大量的微生物和蟲卵，為標本和觀眾健康帶來潛在的危害⑩。

3.2 文博方面擴增子高通量測序的應用

擴增子高通量測序是一種高靶向性分析特定基因組區域中基因變異的方法，其利用PCR技術擴增基因組的特定區域，進行高通量測序，分析序列中的遺傳變異等信息。核糖體基因主要包括16S rRNA、18S rRNA和轉錄間隔區ITS等，廣泛存在于所有細胞生物體中，且具有一系列由非常保守到高變的區域，可以反映不同樣品在細菌、真菌、古菌等組成的微生物群落之間的差異，對研究不同環境中微生物群落組成及動態變化有重要的指導作用，因此常被用作多樣性調查的標記基因k。馮虎元、武發思團隊等已采用擴增子測序技術在石質文物，尤其是對露天石窟寺表面微生物多樣性和功能的分析，取得一系列進展，為壁畫、彩塑等文物的生物退化與防治和觀眾數量控制提供了科技理論支撐l。王亞麗團隊利用高通量測序技術分析古沉船飽水木材樣品的原核微生物群落多樣性，探討飽水木材的原核微生物降解機制，為出水文物的保護提供新思路m。部分文物已采用擴增子高通量測序方式對表面或內部微生物進行檢測與分析，但尚未見應用于動物剝制標本的報道。

3.3 動物剝制標本表面微生物高通量檢測

本文選用同一家標本制作公司采用相同工藝制作的動物剝制標本，該批標本近乎同時交付、滅菌后分別存放于庫房、展柜和開放性微縮景觀環境中，前期處理相對一致。對樣本ITS序列全長和16S rRNA V3+V4序列進行高通量測序，檢測分析不同存放環境中動物剝制標本表面真菌和細菌分布情況。結果顯示，不同存放環境中，標本表面真菌和細菌的多樣性、種類、功能皆有較大差異；且與預想一致，開放性微縮景觀內標本表面真菌和細菌的種類和多樣性均最高，展柜內次之，庫房中最低。動物剝制標本表面豐度最高的真菌營養類型主要為動物內生真菌、動植物病原真菌、動物寄生真菌和糞便、木腐生真菌等，潛在性致病細菌主要為無色桿菌屬、Dok59、嗜熱單胞菌屬和黃單胞菌科、華桿菌科、腸桿菌科、甲基孢囊菌科。對動物剝制標本進行維護和預防性消殺時，可針對處理主要微生物，以達到更好的防護效果。

雖然相關生物技術發展迅速，但微生物的種類數量異常龐大，人們對其認知依然有限，很多尚未能鑒定到種屬，功能更是未知。如需進一步分析標本表面真菌和細菌的絕對含量和確定主要微生物的確切功能，還須檢測微生物的絕對豐度，并結合微生物培養組學、宏基因組學、宏蛋白組學、代謝組學等技術聯合分析。動物剝制標本表面真菌和細菌與其存放環境息息相關，要定量或定性分析標本表面微生物與博物館觀眾數量間的關聯，還需監測館內空氣微生物的實時濃度、空氣懸浮顆粒物的實時濃度、采集空氣微生物樣本和觀眾數量等。盡管擴增子高通量測序技術在文博方面的應用仍受限制，需不斷創新和發展，但運用新型生物技術為藏品的預防性保護和可持續管理提供科技支撐必將成為未來新趨勢。

注釋

①溫彬，楊敬.館藏動物剝制標本修復及預防性保護研究：以山西博物院為例[J].博物院，2023（2）：128-136；張波.館藏剝制動物標本常見有害殘留物及其檢測技術概述[J].科學教育與博物館，2015，1（2）：150-155；鄭永鋒.自然博物館野生動物標本展陳工作的應用性研究[J].文化產業，2021（20）：128-131；葉楊，張波，張銳，等.館藏剝制動物標本害蟲防治法的研究進展[J].文物保護與考古科學，2015，27（3）：96-107.

②溫彬，楊敬.館藏動物剝制標本修復及預防性保護研究：以山西博物院為例[J].博物院，2023（2）：128-136；丁寧.館藏自然標本的預防性保護：以廣東省博物館為例[J].自然科學博物館研究，2018，3（2）：74-83.

③④吳悅妮，馮凱，厲舒禎，等.16S/18S/ITS擴增子高通量測序引物的生物信息學評估和改進[J].微生物學通報，2020，47（9）：2897-2912.

⑤張廣.館藏動物剝制標本的管理及預防性保護[J].自然科學博物館研究，2023，8（1）：56-64.

⑥丁寧.館藏自然標本的預防性保護：以廣東省博物館為例[J].自然科學博物館研究，2018，3（2）：74-83；丁寧.館藏動物標本殺蟲劑殘留物元素檢測分析[J].文物保護與考古科學，2021，33（2）：74-83；丁寧.嶺南地區博物館藏品蟲害調查報告[J].博物院，2018（2）：94-103.

⑦溫彬，楊敬.館藏動物剝制標本修復及預防性保護研究：以山西博物院為例[J].博物院，2023（2）：128-136.

⑧何亮.動植物標本在陳列環境中的蟲害防治研究[J].自然博物，2017（1）：116-123.

⑨許永賢.探析動物標本制作有害物質及預防[J].中國畜禽種業，2017，13（6）：18-19.

⑩袁超.天津國家海洋博物館館藏剝制動物標本的養護管理工作初探[J].自然博物，2021，6（00）：168-173.

k吳悅妮，馮凱，厲舒禎，等.16S/18S/ITS擴增子高通量測序引物的生物信息學評估和改進[J].微生物學通報，2020，47（9）：2897-2912；武發思，李潔.石質文物微生物研究現狀與展望[J].石窟與土遺址保護研究，2022，1（4）：14-33.

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m王亞麗.微生物分子生態學技術在文物保護中應用的進展[J].文物保護與考古科學，2012，24（3）：108-111；王亞麗.明代古沉船飽水木材的原核微生物多樣性分析[J].生物資源，2021，43（5）：518-525.