小麥GPAT家族全基因組鑒定及表達分析

摘要：甘油-3-磷酸酰基轉移酶（glycerol-3-phosphateacyltransferase，GPAT）在植物生長發育和逆境反應中發揮重要作用，是催化甘油三酯合成的關鍵酶。對小麥的GPAT基因進行家族鑒定，并對其基因結構、理化性質、保守基序、順式啟動元件等進行分析。結果顯示，共在小麥中鑒定出65個GPAT家族成員，其中在1、3號染色體上分布較多，其余染色體上分布較少。理化性質分析結果表明，GPAT成員的氨基酸長度為364 aa（TaGPAT3）～581（TaGPAT45）aa，分子量為40.17 ku（TaGPAT1）～64.11（TaGPAT45） ku，等電點為6.19（TaGPAT11）～9.60（TaGPAT26）。TaGPAT蛋白可以分為3個亞家族，其中GroupⅠ和GroupⅡ成員具有7～13個內含子，GroupⅢ成員具有0～4個內含子。通過進行表達模式分析發現，大多數TaGPAT基因在小麥組織和逆境脅迫下表達量較低，值得關注的是，TaGPAT5在不同植物組織中以及冷和干旱脅迫下表達量均較高。以上結果可為小麥基因功能的研究提供參考，也對拓寬小麥的遺傳基礎具有重要的理論和應用意義。

關鍵詞：小麥；GPAT基因家族；生物信息；表達模式分析

中圖分類號：S188；S512.101" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0253-09

收稿日期：2024-01-03

基金項目：連云港市財政局專項資金項目（編號：QNJJ2314、QNJJ2101）；連云港市“521高層次人才培養工程”科研項目（編號：LYG06521202395）。

作者簡介：師毅君（1994—），女，甘肅白銀人，碩士，研究實習員，主要從事小麥遺傳育種研究。E-mail：shiyijunhappy@163.com。

通信作者：樊繼偉，研究員，主要從事小麥高產抗病育種研究。E-mail：fantrta@163.com。

甘油三酯是生物體內的重要分子，它的合成涉及多個酶的催化反應。在脂質合成代謝途徑中，甘油-3-磷酸?；D移酶（glycerol-3-phosphateacyltransferase，GPAT）是合成三酰甘油（triacylglycerol，TAG）的限速酶，參與多種脂質合成［1］。具體來說，GPAT合成途徑分為原核途徑和真核途徑［2］，其中原核途徑在葉綠體中催化甘油-3-磷酸（glycerol-3-phosh pate，G3P）形成磷脂酸（phos-phatidic acid，PA）［3-4］；真核途徑主要在內質網上進行，該反應過程又稱為Kennedy途徑，是磷脂合成的主要途徑。GPAT和溶血磷脂酸?；D移酶（LPA acyl transferase，LPAAT）催化G3P的sn-1、sn-2反應形成PA［5-6］，再經二酰甘油?；D移酶（DGA acyl transferase，DGAT）催化形成TAG［7］。GPAT在許多植物中均有表達，其中在擬南芥上的研究較為深入［8-9］，GPAT家族含有10個成員，可分為3類，其中一類為可溶性蛋白ATS1，定位于葉綠體，參與原核途徑脂質合成［10］，另一類是位于內質網的GPAT9，直接參與真核途徑［1，11-12］，還有一大類包括膜結合蛋白GPAT1～GPAT8，研究表明，GPAT1～GPAT8參與胞外脂質合成途徑，僅存在于陸生植物中［13］。

GPAT在植物脂質合成以及對鹽堿、冷熱等非生物脅迫反應中具有獨特的功能［14］，研究發現，ATS1在擬南芥細胞質中的表達增強甘油脂的合成，并提高植株耐磷脅迫能力［15］。郝靜芳發現，玉米GPAT6、GPAT9基因的過表達提高種子TAG含量，同時GPAT6、GPAT7正向調控植株的耐鹽性［16］，而小麥GPAT6的過表達致擬南芥對鹽堿脅迫抗性降低［17］。鹽地堿蓬葉綠體GPAT可通過提高擬南芥不飽和脂肪酸的含量，增強其耐鹽性［18］。在有機肥中添加G3P可調控西瓜GPAT基因表達和酶活性，對鹽脅迫有緩解效應［19］。龍眼ERF6基因可通過激活GPAT家族基因表達參與龍眼體胚對高溫脅迫的響應［20］。低溫脅迫下番茄GPAT基因的過表達可增強植株的耐冷性和耐鹽性，抑制表達可增強耐熱性［21］。草菇的耐低溫能力與GPAT基因的表達水平呈正相關［22］，在水稻［23］、百合［24］、連翹［25］中也有相似的結果。

GPAT基因家族在擬南芥［10］、棉花［26］、玉米［27］、青稞［28］、大麥［29］等植物中都已得到了系統鑒定，目前關于小麥GPAT基因雖有研究［17］，但未發現其基因家族的系統鑒定。本研究對小麥GPAT家族基因進行鑒定，分析其結構和系統進化，并基于Wheat Expression數據庫［30］分析小麥根、莖葉、穗、籽粒對非生物脅迫的響應特征，以期為進一步解析GPAT基因在小麥生長發育和非生物脅迫下的功能以及抗逆育種研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 小麥GPAT家族成員鑒定及理化特性

從植物參考基因組數據庫Ensembl Plants（https：//plants.ensembl.org/index.html）中下載小麥以及擬南芥的基因組數據，從Uniport-swissport（https：//www.uniprot.org/）中下載擬南芥GPAT蛋白序列，在Pfam網站（http：//pfam-legacy.xfam.org/）上下載GPAT蛋白的保守結構域PF01553，使用TBtools（https：//github.com/CJ-Chen/TBtools）軟件［22］進行BLASTP和HMMER搜索，并將結果去冗余后提交到NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）數據庫進行鑒定，保留包含有完整結構域的基因。通過Expasy（https：//www.expasy.org/）分析家族成員的分子量、等電點等理化性質，并用Wolfpsort（https：//wolfpsort.hgc.jp/）來預測其亞細胞定位信息。

1.2 小麥GPAT系統進化及序列特征分析

使用軟件MEGA 11.0［31］的內置muscle對小麥和擬南芥的所有GPAT基因進行多序列對比分析，使用NJ法構建GPAT基因家族的系統進化樹（Bootstrap=1 000），并通過ITOL（https：//itol.embl.de/）進行美化。通過MEME（http：//meme-suite.org/）預測蛋白質保守結構域（motif設為10）。利用TBtools軟件提取內含子、外顯子信息，并將上述結果進行可視化。

1.3 小麥GPAT啟動子順式作用元件預測

提取小麥GPAT基因上游2 000 bp序列，利用Plant CARE在線軟件進行順式作用元件預測，并用TBtools軟件將結果可視化。

1.4 小麥GPAT染色體定位和基因復制分析

利用基因組注釋信息獲取小麥染色體全長和TaGPAT基因位置，通過TBtools內置軟件MCScanX分析小麥基因組具有重復關系的基因對，并利用Advanced circos［32］進行可視化展示。

1.5 小麥GPAT表達模式分析

為分析GPAT基因在小麥不同組織和逆境脅迫下的表達模式，從Wheat Expression數據庫中下載表達量數據，并用TBtools進行可視化。

2 結果與分析

2.1 GPAT家族成員鑒定及理化特性

根據擬南芥GPAT的蛋白序列進行比對搜索，去除結構域不完整的成員，最終確定小麥有65個GPAT家族成員（表1）。TaGPAT基因家族編碼的蛋白序列長度為364（TaGPAT3）～581（TaGPAT45）aa，分子量為40.17（TaGPAT1）～64.11（TaGPAT45）ku，等電點為6.19（TaGPAT11）～9.60（TaGPAT26），其中7個家族成員位于酸性位置，其余均位于堿性位置，說明大多數蛋白屬于堿性蛋白質。大多數成員位于質膜中，其余成員分別定位于葉綠體（15個）、內質網（8個）、線粒體（2個）、細胞質（3個）和液泡（3個）。

2.2 系統進化樹和結構域的保守性分析

為研究GPAT基因家族成員的親緣關系，利用MEGA 11.0對65個小麥TaGPAT和10個擬南芥AtGPAT基因家族成員構建系統進化樹，結果（圖1）表明，GPAT蛋白被聚為3個亞家族，其中GroupⅠ的成員為6個，占8%；GroupⅡ的成員為9個，占

12%；GroupⅢ的成員為60個，占80%，且被分為3類（Ⅲ-a為25個，Ⅲ-b為6個，Ⅲ-c為29個）。

通過對基因結構進行分析，可以了解植物的遺傳特征和生物功能，明確生長、發育、抗逆和進化等方面的規律，利用MEME對小麥TaGPAT成員進行motif預測，結果（圖2-a）顯示，長度為15～50 aa。同一分支家族成員的motif構成相似，GroupⅠ和GroupⅡ僅含有少數motif，而GroupⅢ包括所有motif。其中，GroupⅠ中有5個GPAT蛋白鑒定到motif3；GroupⅡ中的所有GPAT蛋白均含有motif4；GroupⅢ中的大多數GPAT蛋白鑒定到全部motif，僅TaGPAT45、TaGPAT48缺失motif6。由此表明各個亞家族蛋白基序差距較大，在進化過程中可能出現內部分化。

同時由圖2-b可知，GPAT家族成員中存在6個保守蛋白結構功能域，其分組與系統發育樹分析結果相近，這表明同一分支GPAT基因的保守結構域具有相似性和一致性。其中，GroupⅠ和GroupⅡ家族成員的蛋白結構域較為保守，在GroupⅠ家族成員中發現PLN02349和LPLAT_LPCAT1-like結構域，在GroupⅡ家族成員中鑒定到PLN02833、LPLAT_LPCAT1-like結構域；在GroupⅢ家族成員中發現PLN02588、PLN02177和PLN02499結構域。

基因結構分析結果（圖2-c）顯示，所有基因均具有完整的CDS，只有50個基因含有UTR，而UTR的缺失可能對基因功能有一定影響。同一分支的GPAT基因含有相似的外顯子和內含子數量，表明他們在進化過程中關系較近，其中GroupⅠ和GroupⅡ內基因的內含子較多，從7～13不等，小麥中TaGPAT10的內含子最多，由13個內含子組成；GroupⅢ內基因的結構較為簡單，插入的內含子較少，大部分在0～4個之間。

2.3 順式作用元件預測

基因的表達調控與其啟動子順式作用元件關系密切，對小麥GPAT基因的順式作用元件進行預測發現，小麥GPAT基因包含5種激素響應元件、3種脅迫響應元件和4種生長調控響應元件（圖3）。在激素響應元件中，數量最多的是茉莉酸反應元件，有386個，存在于60個TaGPAT基因中；其次是脫落酸反應元件有311個，僅有1個TaGPAT基因不包含此類元件，說明TaGPAT家族基因可能調控茉莉酸和脫落酸代謝途徑。生長素反應元件存在于41個TaGPAT基因中，其中38個TaGPAT基因包含赤霉素反應元件、 28個TaGPAT基因包含水楊酸

反應元件，僅TaGPAT6和TaGPAT61中5種激素響應元件都存在。脅迫響應元件分布差異較大，其中干旱響應元件存在于35個TaGPAT家族成員中，低溫響應元件和防御響應元件也少量存在，僅TaGPAT44同時包含3種脅迫響應元件。在生長調控元件中光響應元件數量最多，有587個，所有的TaGPAT基因均含有此類元件。厭氧誘導元件、缺氧誘導元件、分生元件均被少量檢測到。此外，小麥GPAT基因中包含較多的茉莉酸、水楊酸、干旱響應元件，說明其可能在激素信號調控和干旱脅迫應答中發揮功能。

2.4 染色體定位和基因復制事件分析

根據小麥GPAT基因的染色體定位結果（圖4）發現，TaGPAT家族成員在1號染色體定位到的基因最多，其中ABD基因組內共18個成員，1A、1B和1D基因組內均有6個成員。在6、7號染色體上定位到的基因最少，ABD基因組內均僅有4個成員，其中6B和7B基因組內定位到2個成員，6A、6D、7A、7D基因組內均僅有1個成員。同時在小麥的3個亞基因組（A、B和D）中發現，TaGPAT家族成員數量幾乎一致，35.4%的TaGPAT基因（23個）在A基因組中，B、D基因組中均含有32.3%的TaGPAT基因，為21個。表明TaGPAT基因可能隨著進化出現了基因復制，這是生物進化的主要驅動力之一，被視為新基因功能和生物復雜性的重要來源。物種內共線性分析發現，小麥中存在76 037個共線性區域，62個TaGPAT同源基因對，這些同源基因對可能由片段復制產生，是TaGPAT基因家族擴張的重要途徑。

2.5 表達模式分析

為進一步揭示GPAT基因的潛在作用，利用小麥4個不同組織的表達量數據分析65個GPAT基因的差異表達情況。結果見圖5-a，TaGPAT的表達量在４個組織中出現明顯差異，其中9個TaGPAT基因（TaGPAT3～TaGPAT8、TaGPAT17～TaGPAT19）在所有組織中表達量較高，表明這些基因參與植株整個生長發育過程，其余大部分TaGPAT在所有組織中的表達水平較低。此外，TaGPAT15僅在根中高度表達，TaGPAT9在莖葉中的表達量較高，進一步說明TaGPAT在小麥生長發育中具有功能差異。

對小麥在冷、熱、干旱和旱熱共脅迫下的表達量進行分析，結果見圖5-b，共檢測到5個TaGPAT基因（TaGPAT5～TaGPAT8、TaGPAT12）在所有脅迫下表達量較高，其中TaGPAT5、TaGPAT9、TaGPAT12在冷脅迫下相對表達量上調，TaGPAT7、TaGPAT8在冷脅迫下的相對表達量升高不明顯，而在熱和旱熱共脅迫下相對表達量明顯提升。在干旱脅迫下，TaGPAT4、TaGPAT5和TaGPAT8表達量較高，此外，TaGPAT4、TaGPAT5在冷和干旱脅迫下表達量較高。以上研究表明，GPAT基因積極參與了小麥對溫度、干旱脅迫的響應。

3 討論與結論

GPAT廣泛參與植物脂類合成、生長發育、逆境響應等多個生物學過程。目前， 關于GPAT基因家

族在麥類作物中已開展大量的研究，其中二倍體的大麥和青稞GPAT家族成員的數量分別為22、21個，四倍體野生二粒小麥和硬粒小麥GPAT家族成員的數量均為33個［33］。在本研究中，共鑒定出65個小麥GPAT家族成員，研究發現，隨著多倍化和基因擴增，GPAT家族成員的數量出現了增長，這可能與增加基因多樣性、適應不同生態位和促進種內、種間的協同進化有關［34］。根據系統發育樹的結構，小麥TaGPAT家族成員被分為3組（Ⅰ～Ⅲ），分別有5、8、52個成員，組內成員具有同源性和相似結構，暗示同一分支上的成員基因功能可能相近。另外發現，GPAT家族成員在1、3號染色體上分布較多，其余染色體上分布較少，說明GPAT在進化過程中出現分布不均勻的情況?；蚬簿€性反映了物種的遺傳相似性和進化關系，通過物種內共線性分析發現，65個TaGPAT基因組成了62個同源基因對，這與家族成員隨基因組多倍化擴增可能存在著密切關系［35］。

本研究中，通過分析不同組織中的GPAT表達量發現，65個GPAT基因分為2組不同表達模式，其中9個TaGPAT基因在所有組織中表達量較高，另一組TaGPAT基因表達量較低，這與大麥HvGPAT和玉米ZmGPAT的分組表達相似［27，29］。根中的TaGPAT15高度表達，這和HvGPAT21、ZmGPAT2、ZmGPAT3的表達情況相似，說明這些基因對根部生長發育具有調控作用。TaGPAT9在莖葉中的表達量較高，與HvGPAT3、ZmGPAT11、ZmGPAT12的表達情況相似，說明其在莖葉生長中發揮作用。非生物脅迫表達分析發現，5個TaGPAT基因在所有脅迫下表達量較高，其中TaGPAT5、9、12在冷脅迫下相對表達量上調，與HvGPAT4、HvGPAT8、HvGPAT14、HvGPAT20在大麥冷脅迫下發揮的作用相似，其中TaGPAT5和HvGPAT4基因在旱脅迫下同樣有表達量上升的趨勢。綜上所述，說明小麥GPAT基因參與多種非生物脅迫響應，本研究通過對小麥GPAT基因家族進行鑒定不僅可為拓寬小麥遺傳基礎提供依據，也可為未來的抗逆作物育種研究提供理論基礎。

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