白術疫病拮抗菌與化學殺菌劑復配及其協同增效作用

關鍵詞：白術疫病；拮抗菌；復配；協同增效作用；芽孢桿菌

白術（Atractylodes macrocephala）是我國主要中藥材作物[1]，隨著其在田間的連年種植，白術生產上的病蟲害問題逐年加重，嚴重影響了其品質與產量。白術以根莖入藥，疫霉引起的白術疫病主要危害植株根莖部，尤其是連作地塊發病嚴重，病害一旦發生會迅速蔓延，致使植株全部死亡[2]。防治植物疫病的常用化學藥劑有50% 烯酰嗎啉可濕性粉劑、25% 精甲霜靈可濕性粉劑、72%霜脲·錳鋅可濕性粉劑、69%烯酰·錳鋅可濕性粉劑、58%甲霜·錳鋅可濕性粉劑等，可在病害發病初期進行防治[3-5]。焦芹等[6]發現，氟噻唑吡乙酮能有效防治煙草黑脛病，10%氟噻唑吡乙酮可分散油懸浮劑2 000 倍液的田間防效為93.82%；高續恒[7] 發現，氰霜唑、吲唑磺菌胺、Y14079 和唑嘧菌胺對荔枝霜疫霉、大豆疫霉等病原卵菌表現出較好的抑制活性。在生物防治方面，目前用于防治疫霉病害的生防細菌主要是芽孢桿菌、鏈霉菌等[8]，秦菁菁等[9]篩選到貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis） SEC-197，它對辣椒疫霉的平板抑制率為74.85%，盆栽試驗對辣椒疫病的防效為70.42%，該菌株可形成生物膜，具有分泌蛋白酶、纖維素酶、溶解有機磷和無機磷、產鐵載體以及固氮的能力。章舸等[10]發現，鏈霉菌H-3 對煙草疫霉引起的煙草黑脛病有一定防效，以22.5 kg·hm-2 劑量施用其固體發酵物時田間防效為70.42%。王榮波等[11]篩選到枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis） BS193，平板對峙試驗中其對6 種植物病原卵菌的相對抑制率均在50% 以上，對辣椒疫霉的抑制率為66.70%。范啟鈴[12]篩選到枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis） GXHZ16，平板對峙試驗中對煙草疫霉菌的抑制率為65.79%。Syed-Ab-Rahman 等[13]篩選到拮抗細菌解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）UQ154、貝萊斯芽孢桿菌UQ156 和不動桿菌屬（Acinetobacter sp.） UQ202， 它們都具有抗辣椒疫霉活性，且能促進植物生長。

本研究室前期從河北安國市的白術連作地塊的典型病株上分離得到白術疫病病原菌（Phytophthora sansomeana） AMPH-1，該菌株為首次報道的白術病害致病疫霉[14]，可引起一些植物病害[15‐16]，如可引起豌豆根腐病[17‐18]。本實驗室前期選用多種化學藥劑對AMPH-1進行室內毒力測定，篩選出50% 烯酰嗎啉、68% 精甲霜錳鋅與代森錳鋅的抑菌效果較好[14]，另外還篩選到拮抗鏈霉菌BZX-23、BZX-31、BZX-104 及拮抗芽孢桿菌BZX-2、BZX-11，對AMPH-1 抑菌率分別為71.60%、71.34%、76.97%及80.68%、74.83%[19]。在此基礎上，本研究對上述不同拮抗細菌、鏈霉菌之間進行復配，并將其與化學殺菌劑復配，分析各種復配劑對抑制白術疫病病原菌AMPH-1的協同增效作用，旨在降低中藥材生產上化學農藥的施用量，延緩病菌抗藥性，保障白術中藥材產業的安全生產，為中藥材疫病等病害的防治提供更多安全、有效的防控策略。

1 材料與方法

1.1 供試材料

拮抗鏈霉菌包括玫瑰黃鏈霉菌（Streptomycesroseoflavus） Men-myco-93-63、加利利鏈霉菌（Streptomyces galilaeus） BZX-23、包比鏈霉菌（Streptomyces bobili） BZX-31、苜蓿鏈霉菌（Streptomyces alfalfae） BZX-104；拮抗芽孢桿菌包括貝萊斯芽孢桿菌 BZX-2、枯草芽孢桿菌 BZX-11、解淀粉芽孢桿菌 X-119；病原菌為白術疫病病原菌 AMPH-1，以上菌株均由河北農業大學植物保護學院生防室保存和提供。

化學殺菌劑包括80%代森錳鋅（上海滬聯生物藥業（夏邑）股份有限公司）、68% 精甲霜錳鋅（先正達（蘇州）作物保護有限公司）、50%烯酰嗎啉（上海生農生化制品股份有限公司）。

1.2 拮抗菌發酵液復配抑制疫霉的平板對峙試驗

采用平板對峙法測定各拮抗菌及其組合對AMPH-1的抑制效果。根據拮抗菌菌屬類別，設置單菌處理（T1～T7）及組合處理（T8～T12），如表1所示，其中組合處理是將各拮抗菌發酵液等比例混合。將AMPH-1 菌餅（8 mm）接種在PDA 培養基中央，在菌餅相距25 mm處等距點樣拮抗菌或拮抗菌混合液10 μL，以等量空白液體培養基為對照，3 次重復；21 ℃培養4 d 后，測量并計算抑菌率。

抑菌率=（對照組病原菌菌絲直徑-處理組病原菌菌絲直徑）/對照組病原菌菌絲直徑×100% （1）

1.3 拮抗菌發酵液與化學殺菌劑復配抑制疫霉的平板對峙試驗

1.3.1 化學殺菌劑對AMPH-1 的室內毒力測定 利用生長速率法[20]測定80%代森錳鋅、68%精甲霜錳鋅、50%烯酰嗎啉3種化學殺菌劑對AMPH-1的半數效應濃度（median effect concentration，EC50）。3 種殺菌劑按表2 劑量制備成含藥培養基，將疫霉AMPH-1 菌餅放置在PDA 培養基中央，以含等量無菌水的平板為對照，3 次重復，21 ℃培養4 d 后，十字交叉法測量疫霉AMPH-1的菌絲直徑，計算殺菌劑對疫霉AMPH-1 的抑菌率。

1.3.2 化學殺菌劑對芽孢桿菌BZX-2、BZX-11、X-119生長的影響 ①含藥平板法：將1.979 μg·mL?1的烯酰嗎啉與PDA按照1∶9比例混勻，制備含藥培養基，將芽孢桿菌BZX-2、BZX-11、X-119 發酵液逐級稀釋至10?5 和10?6 CFU·mL?1，各取100 μL涂布，以等量無菌水平板為對照，3次重復，28 ℃培養24 h后觀察統計菌落數。

②稀釋涂板法：芽孢桿菌BZX-2、BZX-11、X-119單獨發酵培養24 h后，取24 mL發酵液加入1 mL烯酰嗎啉后繼續培養24 h，以加入等量無菌水為對照，培養條件均為28 ℃、200 r·min?1，將最終培養液用無菌水逐級稀釋至10?6 CFU·mL?1 涂板培養，24 h后觀察統計菌落數。

1.3.3 芽孢桿菌與烯酰嗎啉復配對AMPH-1的平板抑制試驗 根據EC50確定最適藥劑及其使用劑量，采用生長速率法[20]測定BZX-2+BZX-11+X-119混合拮抗菌發酵液與最適藥劑復配后對AMPH-1的抑制效果，分別以 BZX-2+BZX-11+X-119 混合液（CK1）和最適藥劑（CK2）為對照，設置拮抗菌混合發酵液（BZX-2+BZX-11+X-119）與最適藥劑分別按照3∶1（TF3∶1）、2∶1（TF2∶1）、1∶1（TF1∶1）、1∶2、（TF1∶2）、1∶3（TF1∶3）比例混合。

按上述處理將芽孢桿菌BZX-2、BZX-11、X-119發酵液等比例混合稀釋至100倍液后，與最適藥劑按照3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3比例混合，制備含藥培養基（按照10%比例混合液添加至PDA混合均勻），AMPH-1 的接種和抑菌率計算方法同1.3.1。

1.4 拮抗菌發酵液復配防治白術疫病的溫室試驗

挑選健康飽滿的白術種子，75% 乙醇處理2 min，0.1%升汞溶液處理60 s，無菌水沖洗3次，將白術種子進行催芽處理，待生長30 d后選取長勢一致的幼苗，分別采用灌根接種BZX-2+BZX-11+X-119混合液和BZX-2發酵液，間隔7 d后再次接種，以接種等量無菌水為對照。灌根48 h后刺傷幼苗莖基部接種疫霉AMPH-1孢子懸浮液（每克土含孢子1×108 CFU·mL?1）。共計3個處理，每處理4次重復，每重復8株，實時觀察白術幼苗發病情況。統計發病率和防效，計算公式如下。

1.5 數據分析

采用 SPSS 17.0 軟件進行方差分析，采用Duncan 氏新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同拮抗菌復配對疫霉的抑制效果

采用平板對峙法測定不同拮抗菌及其復配對AMPH-1的抑制效果，如圖1所示。各組拮抗菌處理對AMPH-1的抑制效果存在顯著差異，抑菌率表現為T3

2.2 拮抗菌發酵液與化學殺菌劑復配對疫霉的抑制效果

2.2.1 化學殺菌劑對疫霉的室內毒力測定 3種化學殺菌劑50%烯酰嗎啉、68%精甲霜錳鋅、80%代森錳鋅對AMPH-1的抑制效果及其EC50值如表3、圖2所示。3種藥劑對AMPH-1菌絲生長均有抑制作用，50%烯酰嗎啉、68%精甲霜錳鋅、80%代森錳鋅的EC50 值分別為1.979、7.899、104.671 μg·mL?1。根據3種藥劑的EC50值，選取50%烯酰嗎啉與芽孢桿菌組合BZX-2+BZX-11+X-119處理發酵液進行后續的復配試驗。

2.2.2 化學殺菌劑對BZX-2、BZX-11、X-119 生長的影響 由表4 可知，3 株芽孢桿菌BZX-2、BZX-11、X-119 在含藥培養基上培養48 h 后與對照平板無顯著差異；而單獨培養24 h 后再與烯酰嗎啉共同培養24 h 后，烯酰嗎啉對BZX-2、X-119 生長無影響，但對BZX-11 有一定的抑制作用，與對照相比，BZX-11的菌落數有所下降。

2.2.3 BZX-2+BZX-11+X-119與烯酰嗎啉復配對疫霉的抑制效果 BZX-2、BZX-11、X-119混合液與烯酰嗎啉復配對疫霉AMPH-1的抑制效果如圖3所示。復配處理對AMPH-1的抑制效果顯著優于CK1 和CK2，其中，BZX-2+BZX-11+X-119 發酵混合液與烯酰嗎啉按照1∶2比例混合后對疫霉的抑制效果最好，抑菌率達68.61%，顯著優于其他處理。

2.3 拮抗菌發酵液復配對AMPH-1 的溫室防效

拮抗菌發酵液復配對白術疫病的溫室防效如表5所示，拮抗菌BZX-2+BZX-11+X-119發酵液復配處理的白術疫病發病率低于清水對照，防效達72.72%，顯著優于單獨施用BZX-2 發酵液處理。

3 討論

本研究以篩選到的對白術疫病病原菌AMPH-1有拮抗效果的生防細菌和鏈霉菌為研究對象，比較不同拮抗菌發酵液單獨處理對疫霉的抑菌率，分析各拮抗菌發酵液的耐受性，發現鏈霉菌發酵液均不耐高溫、強堿，抑菌效果低于芽孢桿菌，因此選用芽孢桿菌BZX-2、BZX-11、X-119 菌株與化學藥劑復配進行疫病防治研究，結果表明，芽孢桿菌BZX-2、BZX-11、X-119菌株與烯酰嗎啉的相容性較好，且不同拮抗菌復配的處理中BZX-2+BZX-11+X-119組合對疫霉的抑制效果最好，抑菌率達75.45%，但低于單獨X-119處理，將BZX-2+BZX-11+X-119拮抗菌混合液與烯酰嗎啉按1∶2比例復配時對疫霉病菌的平板抑制效果最好，達68.61%，比單獨使用烯酰嗎啉和單獨使用拮抗菌處理分別顯著提高16.83% 和13.59%；溫室試驗發現，3株拮抗芽孢桿菌單獨發酵后等比例混合對白術疫病的溫室防效最好，達72.72%，比單獨施用拮抗菌提高45.45%。

目前，生產上對中藥材病害的防治以化學防治為主，但化學農藥的長期使用容易引起病菌抗藥性的增加，且農藥殘留等問題也會影響著中藥材的安全生產，為降低農藥施用量和延緩病菌抗藥性的產生，將生防菌與化學藥劑協同使用成為中藥材病害防控中的新策略，有助于實現減藥增效和保障藥材安全性。在拮抗菌復配、拮抗菌與化學藥劑復配方面，李苗苗等[21] 將芽孢桿菌B. velezensis GY1、B. amyloliquefaciens GY10、B. subtilis GY12 發酵后混合施用，對煙草疫霉P. parasitica 的平板抑制效果為86.90%，溫室防效為74.53%，均明顯優于單獨施用生防菌處理。黑雅婭等[22]將阿維菌素與婁徹氏鏈霉菌S. rochei ZZ-9復配防治南方根結線蟲，48 h 時校正死亡率達54.44%，復配后防效顯著提高，降低了農藥用量。本研究在進行拮抗菌相容性試驗時發現，3株拮抗芽孢桿菌BZX-2、BZX-11、X-119 互不相容，但將這3株芽孢桿菌發酵液復配后防治白術疫病，其溫室防效優于施用單株拮抗菌的防效，表現出協同增效作用。另外，將拮抗菌與烯酰嗎啉復配的室內平板對峙試驗，抑菌效果也表現出協同增效作用，但尚需進一步進行田間試驗的驗證。