生防細(xì)菌對人參連作土壤性質(zhì)及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

關(guān)鍵詞：生防細(xì)菌；人參；理化性質(zhì)；酶活性；細(xì)菌結(jié)構(gòu)

人參（Panax ginseng C. A. Mey.）為多年生宿根草本植物[1]，是我國中醫(yī)藥和大健康產(chǎn)業(yè)的重要資源。人參生長需要高質(zhì)量的土壤，但隨著人參種植年限的增加，土傳病害趨重，人參產(chǎn)量大幅下降[2]，栽過人參的土壤要30年以后才能二次栽參，否則會(huì)表現(xiàn)以須根脫落、參根表皮出現(xiàn)紅褐色和根部腐爛為典型特征的病害，導(dǎo)致人參減產(chǎn)甚至絕收[3]。目前，人參土壤問題尚未被完全解決，因此，探索能夠有效改良人參栽培土壤的措施至關(guān)重要。

殺菌劑是目前生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛的抑制土傳病原菌的方法，在短時(shí)間內(nèi)，殺菌劑能有效控制植物病害，達(dá)到防治病害的目的[4]。但長期使用殺菌劑會(huì)增強(qiáng)病菌的抗藥性，并破環(huán)土壤微生物結(jié)構(gòu)和土壤健康，不能有效解決人參土壤問題，而且殺菌劑易對人體產(chǎn)生危害[5]。近年來，國家對農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和人類健康日益關(guān)注，傳統(tǒng)的殺菌劑已逐步被淘汰，生物防治具有改善根部微生物結(jié)構(gòu)、保護(hù)生態(tài)環(huán)境、保證人畜安全等優(yōu)點(diǎn)，逐步成為植物病害防治的主要策略之一[6‐7]。生物防治中的生防菌是通過對植物根際土壤微生物、內(nèi)生菌群等進(jìn)行篩選，精準(zhǔn)分離出能夠抑制靶標(biāo)病原體的菌類，能夠有效改善土壤環(huán)境，降低作物的發(fā)病率[8]。研究證明，施用生防菌劑能夠提高土壤營養(yǎng)[9]，同時(shí)生防菌劑還能調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分含量和生物酶活性，進(jìn)而影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性，降低土壤中病原菌的相對豐度，從而發(fā)揮防治病害的作用[10]。

良好的土壤是植物生長最基礎(chǔ)和必要的條件[11]。連續(xù)種植引起的土壤問題包括土壤病蟲害增多、抵抗力變?nèi)?、土壤板結(jié)、營養(yǎng)元素不均衡以及土壤性質(zhì)退化等[12]。土壤微生物被認(rèn)為是維持土壤功能穩(wěn)定性和完整性的主要驅(qū)動(dòng)力，顯著影響植物與大環(huán)境的物質(zhì)循環(huán)和能量交換等生態(tài)過程，對土壤健康有不可忽視的作用[13]。隨著人參的連續(xù)種植，人參根部微生物生態(tài)失衡，土壤中的病原微生物數(shù)量增加、養(yǎng)分失衡，導(dǎo)致人參的連作障礙加劇。因此，探索生物防治對人參連作土壤是否具有積極作用顯得尤為重要。本研究以老參地土壤和新林土土壤為對照，分析生防細(xì)菌對人參連作土壤的土壤性質(zhì)、酶活性以及微生物結(jié)構(gòu)的影響，以期為消減人參連作障礙，實(shí)現(xiàn)人參綠色生態(tài)可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地點(diǎn)為吉林省白山市撫松縣抽水鄉(xiāng)五號(hào)基地（42°34′N、127°28′E，海拔586 m），該地屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候。年平均氣溫5 ℃，最高溫度34 ℃，最低溫度-36 ℃，年平均降水量712 mm，無霜期79～150 d，土壤母質(zhì)類型為暗棕壤。試驗(yàn)前已連續(xù)3年種植人參，土壤病害嚴(yán)重。

1.2 試驗(yàn)材料

供試材料為大小相近的3年生健康人參苗，購自吉林省撫松縣萬良鎮(zhèn)人參交易市場；供試菌為實(shí)驗(yàn)室前期從病害嚴(yán)重的人參土壤中篩選出的對人參病原菌具有拮抗作用的3 株芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2023年5月1日在吉林省白山市撫松縣抽水鄉(xiāng)五號(hào)基地開展試驗(yàn)，田間試驗(yàn)共設(shè)置3種處理：①在連續(xù)種植3 年人參的土壤中施加水（CK）；②在連續(xù)種植3年人參的土壤中施加生防細(xì)菌（SZ）；③在新林土土壤中施加水（XT）。將3株菌株分別置于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌液的OD600 達(dá)到1.0時(shí)停止擴(kuò)繁，再按照1∶1∶1的比例將菌液混合，稀釋40倍后，用于SZ處理。每個(gè)處理的地塊面積為30 m2（2 m×15 m），隨機(jī)排列分布，SZ處理采用2 L菌液，CK和XT處理采用清水；每周噴灑1次，持續(xù)4周，每個(gè)處理重復(fù)3次，并于2023年5月1日移栽大小相近的3年生健康參苗。試驗(yàn)基地田間管理均按當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)方法進(jìn)行。

1.4 樣品采集及指標(biāo)測定方法

1.4.1 樣品采集 于2023年10月9日在試驗(yàn)區(qū)進(jìn)行土壤樣品采集。采用“S”形取樣法對每個(gè)處理進(jìn)行取樣，取樣深度為0—20 cm。每個(gè)處理設(shè)置15 個(gè)土壤采樣點(diǎn)，每5 個(gè)土壤采樣點(diǎn)混合成1個(gè)復(fù)合樣本，每個(gè)處理獲得3個(gè)復(fù)合樣品。去除土壤樣品中殘留的人參須根和雜質(zhì)等，一部分自然風(fēng)干，過2 mm篩網(wǎng)，用于土壤酶活性分析；另一部分置于-80 ℃，用于后續(xù)微生物群落分析。

1.4.2 土壤理化性質(zhì)的測定 采用pH計(jì)（FE28，中國上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）測定土壤pH。采用電導(dǎo)率儀（FE38，中國上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）測定土壤電導(dǎo)率（electricconductivity，EC）。采用重鉻酸鉀滴定法測定土壤有機(jī)質(zhì)（organic matter， OM）含量；采用堿解擴(kuò)散法測定土壤水解氮（available nitrogen，AN）含量；采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定土壤有效磷（available nitrogen，AP）含量[14]。

1.4.3 土壤酶活性測定 采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定土壤蔗糖酶（sucrase，SC）活性；采用磷酸苯二鈉比色法測定土壤酸性磷酸酶（acidphosphatase，ACP）活性；采用靛酚藍(lán)比色法測定土壤脲酶（urease，UE）活性[14]。

1.4.4 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增 根據(jù)E.Z.N.A.?soil DNA kit說明書提取土壤樣品的微生物群落總DNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，使用NanoDrop 2000 測定DNA 含量和純度。使用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R （5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’） 對16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用QIIME V1.9.1將細(xì)菌序列以97%的序列相似性聚類到OUT中，基于OUT豐度表分析樣本的群落組成。利用IBM SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），采用Graphpad Prism 9.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對土壤理化性質(zhì)的影響

生防菌劑處理后，SZ處理土壤的pH顯著高于CK 處理，XT 處理的pH 又顯著高于SZ 處理。與CK處理相比，SZ處理顯著降低了土壤的電導(dǎo)率。 SZ處理土壤的有機(jī)質(zhì)含量為36.80 g?kg-1，較CK處理顯著增加9.00%。與CK處理相比，SZ處理顯著增加了土壤的堿解氮含量，但仍顯著低于XT處理。不同處理土壤的有效磷含量也存在顯著性差異，表現(xiàn)為SZgt;CKgt;XT。

2.2 不同處理對土壤酶活性的影響

由圖1可知，生防細(xì)菌處理后，SZ處理的土壤脲酶活性較CK處理顯著增加6.94%，但顯著低于XT處理。與CK處理相比，SZ處理的蔗糖酶活性顯著提高19.42%。3個(gè)處理土壤的酸性磷酸酶活性存在顯著差異，表現(xiàn)為SZgt;XTgt;CK。

2.3 不同處理對土壤細(xì)菌群落的影響

2.3.1 土壤細(xì)菌序列及Alpha多樣性指數(shù) 利用Majorbio平臺(tái)測序，所有土壤樣品共獲得804 319條序列，基于97%的相似性共獲得5 902個(gè)OTU，與樣本文庫的覆蓋度達(dá)99.0%以上。分類學(xué)分析將細(xì)菌群落劃分為39門、124綱、279目、424科、774屬。由表2可知，施入生防菌劑顯著提高了土壤細(xì)菌的Ace指數(shù)和Chao指數(shù)，其中Chao指數(shù)表現(xiàn)為SZgt;CKgt;XT；Ace指數(shù)表現(xiàn)為SZgt;XT、CK。不同處理土壤細(xì)菌的Shannon指數(shù)無顯著差異。

2.3.2 土壤細(xì)菌群落組成 由圖2A 可知，在門水平，共檢測到39 個(gè)門。其中放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、疣微菌門（Verrucomicrobiota）、綠彎菌門（Chloroflexi）為優(yōu)勢細(xì)菌門。放線菌門在XT處理的相對豐度最高，為36.59%；其次是SZ處理，為35.08%；在CK 處理中最低，為34.29%。變形菌門在XT 處理中的相對豐度最高，為23.93%，顯著高于CK和SZ處理。酸桿菌門在SZ處理中的相對豐度最高，為12.36%；其次是CK處理，為11.54%；在XT處理中的相對豐度最低，為8.40%。疣微菌門在CK處理中相對豐度最高，為9.97%；在SZ處理中相對豐度最低，為9.41%。綠彎菌門在CK處理中相對豐度最高，為9.95%；其次是SZ處理，為8.57%；在XT處理中相對豐度最低，為6.85%。

由圖2B可知，在屬水平上，共檢測到744個(gè)屬，其中相對豐度最高的6 個(gè)優(yōu)勢菌屬為Candidatus_Udaeobacter、norank_f__norank_o__Gaiellales、Gaiella、norank_f__Xanthobacteraceae、norank_f__norank_o__Vicinamibacterales、分支桿菌屬（Mycobacterium）。Candidatus_Udaeobacter 在XT處理中相對豐度最高，為8.40%；在SZ 處理中相對豐度最低，為7.08%。norank_f__norank_o__Gaiellales 在XT 處理中相對豐度最高，為6.42%；其次是CK處理，為5.92%；在SZ處理中相對豐度最低，為5.88%。Gaiella、norank_f__norank_o__Vicinamibacterales 在SZ 處理中相對豐度最高；在XT 處理中相對豐度最低。norank_f__Xanthobacteraceae、分支桿菌屬在CK 處理中相對豐度最高；其次為XT處理；在SZ處理中的相對豐度最低。

2.3.3 土壤細(xì)菌β 多樣性分析 主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates，PCo）結(jié)果（圖3）顯示，第1坐標(biāo)軸和第2坐標(biāo)軸分別解釋了65.22%和8.92%的變異，累計(jì)74.14%。不同處理下的細(xì)菌群落分離明顯，表明不同處理之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。

2.3.4 土壤細(xì)菌LefSe 多級物種差異判別分析 根據(jù)分類學(xué)組成，采用線性判別分析（（lineardiscriminant analysis，LDA）分析每個(gè)物種豐度對組間差異的影響，結(jié)果（圖4）顯示，在LDA閾值為3.5的篩選標(biāo)準(zhǔn)下，共發(fā)現(xiàn)28個(gè)類群在不同處理土壤中存在顯著差異。其中在CK處理中有5種，主要包括小月菌屬（Microlunatus）等；在SZ處理中有13種，主要包括嗜鄰聚桿菌綱（Vicinamibacteria）、酸桿菌門等；在XT處理中有10種，主要包括微球菌目（Micrococcales）、厚壁菌門（Firmicutes）等。酸桿菌綱類細(xì)菌在SZ 處理和XT 處理中均顯著富集。

2.4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果（圖5）表明，電導(dǎo)率與慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、小月菌屬、Candidatus_Xiphinematobacter、RB41 呈顯著正相關(guān)，與節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）呈顯著負(fù)相關(guān)；有效磷含量與Candidatus_Xiphinematobacter、RB41 呈顯著正相關(guān)，與Candidatus_Udaeobacter、節(jié)桿菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)；酸性磷酸酶活性與分支桿菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)；脲酶活性與節(jié)桿菌屬呈顯著正相關(guān)，與慢生根瘤菌屬、小月菌屬、Candidatus_Xiphinematobacter、RB41 呈顯著負(fù)相關(guān)；有機(jī)質(zhì)含量與節(jié)桿菌屬呈顯著正相關(guān)，與慢生根瘤菌屬、小月菌屬、Candidatus_Xiphinematobacter、RB41 呈顯著負(fù)相關(guān)；堿解氮含量與節(jié)桿菌屬呈顯著正相關(guān)，與慢生根瘤菌屬、小月菌屬、Candidatus_Xiphinematobacter、RB41 呈顯著負(fù)相關(guān)；pH與節(jié)桿菌屬呈顯著正相關(guān)，與慢生根瘤菌屬、小月菌屬、RB41 呈顯著負(fù)相關(guān)；蔗糖酶活性與節(jié)桿菌屬呈顯著正相關(guān)，與慢生根瘤菌屬、小月菌屬、RB41 呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論

生物防治已成為保護(hù)作物栽培的重要策略，生防菌通過與病原菌生態(tài)位的競爭以及分泌胞外酶降解病原菌細(xì)胞壁等方式來阻止病原菌的入侵，改變微生物群落結(jié)構(gòu)[15]，從而刺激土壤性質(zhì)發(fā)生變化。本研究采用栽培3年人參的土壤進(jìn)行試驗(yàn)，分析生防細(xì)菌對人參土壤環(huán)境的影響。土壤理化性質(zhì)和土壤酶活性是評價(jià)土壤健康程度的重要指標(biāo)。人參連續(xù)種植導(dǎo)致土壤酸化，一般認(rèn)為人參不適合在過酸的土壤中生長[16]。在酸性程度高的土壤中，人參受外界脅迫程度增加，養(yǎng)分吸收能力減弱[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，生防細(xì)菌處理后，土壤pH顯著升高，電導(dǎo)率顯著降低，表明生防細(xì)菌能有效改善土壤酸化和鹽漬化。研究表明，養(yǎng)分含量高的土壤是人參的理想生長環(huán)境[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，生防細(xì)菌處理后，土壤的有機(jī)質(zhì)和速效養(yǎng)分含量均有顯著變化。生防細(xì)菌處理土壤的有機(jī)質(zhì)和堿解氮含量顯著增加，土壤狀況向新林土土壤方向轉(zhuǎn)化。土壤酶參與土壤中各種生物化學(xué)過程，如腐殖質(zhì)的分解與合成、動(dòng)植殘?bào)w和微生物殘?bào)w的分解，在物質(zhì)和能量循環(huán)中發(fā)揮重要作用，是土壤生態(tài)功能和系統(tǒng)代謝的重要?jiǎng)恿?，可作為土壤質(zhì)量評價(jià)的重要指標(biāo)[19‐20]。土壤脲酶在氮循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用，可催化尿素在土壤中水解產(chǎn)生氨[21]。程雪梅等[9]研究發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合菌劑能顯著增加栽培浙貝母土壤的脲酶活性，這與本研究結(jié)果一致。蔗糖酶可催化土壤中的蔗糖分解成果糖和葡萄糖，為植物提供碳源[22]。高吉坤等[23]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌處理可顯著提高黃瓜根際土壤的蔗糖酶活性，促進(jìn)黃瓜根系吸收養(yǎng)分，與本研究結(jié)果一致。土壤酸性磷酸酶在土壤有機(jī)磷礦化過程中發(fā)揮重要作用，影響土壤中磷化合物的含量[24]。本研究表明，生防細(xì)菌處理后土壤的酸性磷酸酶活性顯著提高，有利于人參栽培土壤中磷的分解，顯著增加土壤中的有效磷含量。

微生物多樣性在防治土傳病害中具有重要作用。微生物的生存依附于土壤，而土壤的健康程度又體現(xiàn)在土壤理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)上。余賢美等[25]研究表明，枯草芽胞桿菌Bs-15處理土壤提高了土壤微生物的整體活性以及細(xì)菌豐富度。本研究表明，生防菌劑處理顯著增加了細(xì)菌的ACE指數(shù)和Chao指數(shù)。ACE指數(shù)可評估微生物群落組成的豐富度和均勻度，值越高表示物種越豐富，且各物種分配越均勻；Chao指數(shù)可估算樣品中所含OTU的數(shù)量，數(shù)值越大表示樣本中所含的物種數(shù)量越多。由此表明，施用生防菌劑可顯著增加物種豐富度和多樣性。這可能是由于生防細(xì)菌的引入導(dǎo)致各物種間的營養(yǎng)競爭和空間競爭發(fā)生變化，生態(tài)位的爭奪導(dǎo)致細(xì)菌多樣性和結(jié)構(gòu)的變化。放線菌門是一類廣泛存在于土壤中的微生物，它們可分解有機(jī)物質(zhì)，使得土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)得以釋放，同時(shí)還能夠參與土壤團(tuán)聚作用，增加土壤的穩(wěn)定性和水分保持能力[26]。研究發(fā)現(xiàn)，生防菌劑增加了放線菌門的相對豐度，這與沈婷婷等[10]研究結(jié)果一致。變形菌門被認(rèn)為是一類富營養(yǎng)細(xì)菌，在土壤養(yǎng)分充足時(shí)生長較快，表現(xiàn)出更高的相對豐度[27]，這與本研究結(jié)果不相符，生防細(xì)菌處理后，土壤養(yǎng)分增加，變形菌門的相對豐度下降，這可能是因?yàn)楦郀I養(yǎng)成分不利于變形菌門中部分寡營養(yǎng)類群的生長[28]。生防菌劑提高了酸桿菌門的豐度，這與涂鏡等[8]的研究結(jié)果一致。酸桿菌門是一種嗜酸菌，可在極低的pH 環(huán)境下生長，同時(shí)對很多重金屬都有一定的耐受性[29]，是一種很有潛力的抗災(zāi)害性微生物，可能有改善強(qiáng)酸環(huán)境和重金屬環(huán)境土壤的作用。疣微菌門是1997 年劃分的一個(gè)新的細(xì)菌類群[30]。在本研究中，疣微菌門相對豐度的減少可能與土壤pH和電導(dǎo)率的變化有關(guān)[31]。綠彎菌門是個(gè)深度分支的細(xì)菌類群，參與碳、氮、磷等元素的生物循環(huán)[31]。本研究表明，綠彎菌門相對豐度的變化可能與土壤養(yǎng)分的富集有關(guān)。綜上所述，生防細(xì)菌改變了土壤的理化性質(zhì)和酶活性，提升了土壤生物活性，促進(jìn)了微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的分解與轉(zhuǎn)化，從而使土壤狀況正向演替，因此，生防細(xì)菌有望取代傳統(tǒng)殺菌劑，成為持續(xù)消減人參連作障礙的重要手段。