大豆低聚肽和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對熱煮后虹鱒魚肉品質(zhì)及蛋白質(zhì)理化特性的影響

關鍵詞：虹鱒魚；大豆低聚肽；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶；熱煮；蛋白質(zhì)

近年來，隨著人們消費方式的改變及冷鏈物流技術的進步，我國預制菜行業(yè)快速發(fā)展[1]。據(jù)統(tǒng)計，2022年預制菜市場規(guī)模為4 196億元，其中水產(chǎn)預制菜行業(yè)規(guī)模為1 047 億元，同比增長22.3%，預計未來市場仍會保持較高的增長速度，至2026年市場規(guī)模將達2 576億元[2]。

魚肉作為水煮魚、酸菜魚等水產(chǎn)預制菜的重要原料，其品質(zhì)直接決定了產(chǎn)品的質(zhì)量和銷量[3]。與豬肉、牛肉等其他畜禽肉相比，魚肉肉質(zhì)無粗筋絡，纖維組織結(jié)構(gòu)不緊密，在熱煮過程中，肌肉組織會收縮失水、硬度增加，肌肉分層分節(jié)，導致結(jié)構(gòu)松散，品質(zhì)降低，影響消費者對產(chǎn)品的接受程度[4]，因此亟需研究魚肉在熱煮過程中的質(zhì)構(gòu)保持技術，提升產(chǎn)品加工品質(zhì)。研究表明，淀粉、磷酸鹽和蛋白質(zhì)等物質(zhì)可以改善魚肉的熱穩(wěn)定性，提高熱加工特性[5-10]。

虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）因肉質(zhì)細嫩、味道鮮美、營養(yǎng)價值高而著稱，是世界重要養(yǎng)殖魚類之一，兼具較高的經(jīng)濟價值和食用價值，是發(fā)展前景廣闊的高產(chǎn)、高效、優(yōu)質(zhì)品種[11‐12]。隨著消費者對健康水產(chǎn)品的認可和對優(yōu)質(zhì)蛋白需求的增長，虹鱒魚的銷量將持續(xù)增加[13]。目前，虹鱒魚加工存在產(chǎn)品形態(tài)單一、工藝技術落后、附加值低等問題，不能滿足市場對高品質(zhì)水產(chǎn)品的需求[14]。

本研究以虹鱒魚為原料，通過分析大豆低聚肽（soy oligopeptide，SOP）和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TGase）處理對煮后虹鱒魚肉品質(zhì)（質(zhì)構(gòu)、保水性、微觀結(jié)構(gòu)等）和蛋白質(zhì)理化特性（肌原纖維蛋白、巰基和羰基含量等）的影響，探討提高魚肉耐煮性的方法，以期為魚肉預制菜加工品質(zhì)保持技術提供參考，也為虹鱒魚資源的開發(fā)利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

虹鱒魚購于山東省日照市場，體質(zhì)量（1 000±100）g。

1.2 試驗試劑

2，2- 聯(lián)喹啉-4，4- 二甲酸二鈉（bicinchoninicacid，BCA）法蛋白定量試劑盒、蛋白質(zhì)羰基含量測定試劑盒、總巰基含量測定試劑盒、非蛋白巰基含量測定試劑盒均購自江蘇艾迪生生物科技有限公司；其他化學試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 試驗儀器

S-4800N型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；Victor-Rivo5s多功能酶標儀，美國珀金埃爾默公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外分析光譜儀，美國尼高力儀器公司；T-4.5質(zhì)構(gòu)儀，美國博勒飛有限公司；9052B-1電熱鼓風干燥機，上海福馬試驗設備有限公司；C21-RT2126多功能電磁爐，中國美的集團股份有限公司；CR21N 高速冷凍離心機，日本日立公司；FD-1-50真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康醫(yī)學設備有限公司；ZNCL-DLS 磁力加熱鍋，上海科升有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 魚肉預處理 將虹鱒魚去皮采肉，切成大小相近的魚片（約5 cm×4 cm×2 cm）后均分成3組，1組作為對照組（CK），另外2組分別在質(zhì)量體積分數(shù)1%的大豆低聚肽（SOP）和0.5%的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶水溶液（TGase）中浸泡5 min，然后于100 ℃水中煮10 min備用。

1.4.2 質(zhì)構(gòu)測定 測定儀器為博勒飛T-4.5質(zhì)構(gòu)儀，測試參數(shù)為：TPA模式，TA 44探頭，測試速度為1 mm·s-1。分別測定樣品的硬度、內(nèi)聚性、彈性、彈性指數(shù)、咀嚼性以及咀嚼指數(shù)。每組試驗重復5 次，取平均值。

1.4.3 保水率測定 參考Zhang等[15]的方法測定保水率（water holding capacity，WHC）。將等量樣品放入塞有1/3棉花的離心管中，2 000 r·min-1離心20 min，測定離心前后質(zhì)量，計算保水率（%），公式如下。

式中，m0 為空離心管質(zhì)量；m1 為離心前離心管和樣品的總質(zhì)量；m2為離心后離心管和樣品的總質(zhì)量。

1.4.4 超微結(jié)構(gòu)測定 將樣品冷凍干燥后固定、鍍金，通過掃描電鏡分析樣品的超微結(jié)構(gòu)。

1.4.5 傅里葉紅外光譜（Fourier transform infraredspectrometer，F(xiàn)T-IR）檢測 將樣品放于紅外光譜儀上進行溴化鉀壓片法檢測。紅外檢測掃描的波數(shù)范圍設定為4 000～500 cm-1，分辨率定為4 cm-1，掃描次數(shù)限定為16次。

1.4.6 肌原纖維蛋白含量測定 參考逯曉燕等[16]的方法稍作修改。稱取6 g樣品，加入冰浴冷卻的10 mmol·L-1 Tris-HCl緩沖液（5 mmol·L-1苯甲基磺酰氟，pH 7.2）30 mL，低溫條件下12 000 r·min-1分次均質(zhì)2 min，以防過熱，再將勻漿液于4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min，去除上清液，沉淀加入10倍體積的鹽溶液（0.6 mol·L-1 氯化鈉，10 mmol·L-1Tris-HCl 緩沖液，5 mmol·L-1 苯甲基磺酰氟，pH7.2）均質(zhì)混勻，冰水浴靜置30 min 后于4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min，收集上清液，即為肌原纖維蛋白溶液，按照試劑盒說明書測定蛋白含量。

1.4.7 表面疏水性測定 參考陳臘梅等[17]的方法并稍作修改。取1.0 mL 蛋白溶液，加入200 μL1 mg·mL-1溴酚藍溶液，混合均勻，置于暗處震蕩反應30 min，4 000 r·min-1離心20 min。將上清液稀釋10倍后，測定595 nm處的吸光度（A）。蛋白溶液的表面疏水性以溴酚藍的結(jié)合量（μg）表示。

1.4.8 蛋白質(zhì)巰基、羰基含量測定 參照試劑盒（ADS-W-YH006-96、ADS-W-KY015-96、ADS-WKY021）說明書測定蛋白質(zhì)羰基含量、總巰基含量和非蛋白巰基含量。

1.4.9 化學作用力測定 參照栗俊廣等[18]的方法并略加改進。取4.0 g 魚肉樣品加入20 mL0.6 mol·L-1 氯化鈉（S1）中10 000 r·min-1 下均質(zhì)2 min，4 ℃放置1 h；然后4 ℃、12 000 r·min-1 離心20 min，上清液4 ℃保存。S1 的沉淀加入20 mL0.6 mol·L-1氯化鈉和1.5 mol·L-1 尿素（S2），后續(xù)處理同上。S2的沉淀加入20 mL 0.6 mol·L-1氯化鈉和8 mol·L-1尿素（S3），后續(xù)處理同上。S3的沉淀加入20 mL 0.6 mol·L-1氯化鈉、8 mol·L-1尿素和2-巰基乙醇（S4），后續(xù)處理同上。收集各上清液，測定蛋白含量，經(jīng)S1、S2、S3及S4提取后的上清液中蛋白含量分別對應離子鍵、氫鍵、疏水鍵和二硫鍵含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)并計算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 SOP 和TGase 對虹鱒魚肉品質(zhì)的影響

2.1.1 對魚肉質(zhì)構(gòu)特性的影響 魚肉在熱煮時會發(fā)生蛋白質(zhì)變性，內(nèi)源性熱活化蛋白酶誘導肌原纖維蛋白分解而發(fā)生凝膠劣變，肌纖維束受到嚴重破壞，結(jié)構(gòu)斷裂，肌肉形成松散的組織結(jié)構(gòu)[19‐20]。由表1可知，不同處理下虹鱒魚肉的質(zhì)構(gòu)特性（硬度、內(nèi)聚性、彈性、彈性指數(shù)、咀嚼性以及咀嚼指數(shù)）存在差異。與對照組相比，SOP 和TGase處理魚肉的彈性、彈性指數(shù)、咀嚼性和咀嚼指數(shù)顯著提高，且SOP處理魚肉的硬度、內(nèi)聚性顯著高于CK。由此表明，SOP處理虹鱒魚肉的質(zhì)構(gòu)特性優(yōu)于TGase處理。

2.1.2 對魚肉保水率的影響 保水性是指肉制品受外力作用時保持其原有水分的能力。肌肉中的水分以結(jié)合水、不易流動水和自由水3種形式存在[21]。其中不易流動水主要存在于肌肉肌原纖維及膜之間，肌肉的保水性主要指的是不易流動水，它取決于肌原纖維蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)所帶靜電荷的多少[22]。當?shù)鞍踪|(zhì)處于膨脹膠體狀態(tài)時，網(wǎng)格空間大，保水性就高；反之處于緊縮狀態(tài)時，網(wǎng)格空間小，保水性就低[23]。當肉加熱時，其保水性明顯降低，加熱程度越高，保水性下降越明顯[24]。因此肉制品的保水性是衡量產(chǎn)品優(yōu)劣的重要指標之一。由圖1可知，TGase和SOP處理虹鱒魚肉的保水率較CK有所提高，但差異不顯著，說明TGase和SOP可略微改善魚肉肌原纖維蛋白的持水能力，提高魚肉的保水率，且TGase的改善效果優(yōu)于SOP。

2.1.3 對魚肉微觀結(jié)構(gòu)的影響 不同處理下虹鱒魚肉的微觀結(jié)構(gòu)如圖2所示。CK處理在熱煮過程中，表面破損較嚴重，凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)松散，孔徑較大，這可能是由于高溫條件下魚肉中蛋白質(zhì)過度聚集，破壞了凝膠網(wǎng)絡的穩(wěn)定性。與CK相比，SOP和TGase處理顯著改善了魚肉的致密性，其表面結(jié)構(gòu)較完整，凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)更緊密，且孔徑較小，說明SOP和TGase誘導了魚肉中蛋白質(zhì)的交聯(lián)，形成更加致密緊實的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，增強了凝膠保水性，該結(jié)果與質(zhì)構(gòu)分析和保水性結(jié)果一致。不同處理間相比，TGase處理的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)致密性更好。

2.1.4 紅外光譜分析 不同處理的FT-IR光譜中的特征峰如圖3所示。PK1（3 000～3 700 cm-1）代表O-H 的吸收峰或N-H 拉伸振動；PK2（2 850～2 950 cm-1）代表C-H拉伸振動，這是飽和脂肪烴的特征；PK3（1 640 cm-1附近）是C=O拉伸振動的吸收峰，屬于酰胺I帶；PK4（1 546 cm-1附近）代表N-H彎曲振動和C-N拉伸振動吸收，屬于酰胺Ⅱ帶；PK5（1 220～1 330 cm-1）是N-H平面內(nèi)振動和C-N拉伸振動的吸收峰屬于酰胺Ⅲ帶；PK6（1 100 cm-1）是表征C-C或C-O拉伸振動的吸收峰[25‐26]。

與CK相比，TGase處理在PK1處的吸收峰強度增強，這表明，TGase的加入導致分子內(nèi)和分子間氫鍵的增加，而SOP不會在肌原纖維凝膠內(nèi)引起分子間氫鍵的增強；SOP和TGase處理在PK2處的吸收峰強度增加，表明C-H拉伸振動增強；SOP和TGase 處理的PK3的峰面積增加，這表明SOP 和TGase可使C=O拉伸振動增強；SOP和TGase處理的PK5和PK6的峰面積減小，表明SOP和TGase可與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的氨基等官能團相互作用，從而使峰面積減小，這一結(jié)論與前人研究一致[27]。3個處理魚糜凝膠的FT-IR峰一致，無明顯變化，表明SOP和TGase對蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)無顯著影響。

2.2 SOP 和TGase 對虹鱒魚肉蛋白質(zhì)理化特性的影響

2.2.1 對肌原纖維蛋白含量的影響 肌原纖維蛋白是一種具有重要生物學功能的結(jié)構(gòu)蛋白，可以極大地影響肉制品的結(jié)構(gòu)特征、品質(zhì)和凝膠特性[28]。在熱加工過程中蛋白質(zhì)會受熱變性，肌肉組織發(fā)生變形，肌束膜受熱破損，從而導致肌原纖維蛋白的流失[29]。由圖4 可知，SOP 和TGase處理的肌原纖維蛋白含量高于CK 處理，表明SOP和TGase的添加可以較好地保持魚肉品質(zhì)，降低肌原纖維蛋白的流失和變性，且SOP的效果優(yōu)于TGase。

2.2.2 對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響 蛋白質(zhì)表面疏水性是表征蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸殘基分布數(shù)量的重要指標，可反映蛋白質(zhì)的變性程度。當?shù)鞍踪|(zhì)發(fā)生熱變性時，其內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露在蛋白質(zhì)與水相接觸面，導致蛋白質(zhì)的表面疏水性增加[30‐31]。表面疏水性越高說明蛋白變性程度越高。由圖5 可知，與CK 相比，SOP和TGase處理的肌原纖維蛋白表面疏水性顯著降低，表明SOP和TGase的添加可以降低魚肉肌原纖維蛋白的變性程度，且TGase的效果優(yōu)于SOP。這是由于TGase誘導肌原纖維蛋白交聯(lián)形成了更致密的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，蛋白分子表面疏水性氨基酸殘基的暴露程度更低。

2.2.3 對蛋白質(zhì)巰基、羰基含量的影響 魚肉經(jīng)熱煮處理后，肌原纖維蛋白和總巰基含量減少，表面疏水性增大，羰基含量增加[32]。熱變性使蛋白質(zhì)分子逐漸展開，內(nèi)部巰基暴露氧化生成二硫鍵，造成總巰基含量下降，而蛋白肽鏈斷裂造成羰基累積，導致羰基含量升高[33-35]。由圖6可知，SOP和TGase處理的蛋白質(zhì)巰基含量均顯著高于CK 處理，且TGase 處理的蛋白質(zhì)羰基含量顯著高于CK 處理，表明SOP 和TGase 的添加可緩解熱煮過程中蛋白質(zhì)表面水分子保護層被破壞，避免蛋白質(zhì)疏水性氨基酸的暴露[36]，且TGase的效果優(yōu)于 SOP。

2.2.4 對蛋白質(zhì)化學作用力的影響 離子鍵、氫鍵、疏水鍵、二硫鍵等是維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學作用力，其變化可反映蛋白質(zhì)的變性程度，離子鍵是較弱的鍵合力，在加熱過程中容易被破壞[33]。二硫鍵是連接蛋白質(zhì)不同肽鏈或同一肽鏈中，2個不同半胱氨酸殘基的巰基化學鍵在蛋白質(zhì)分子中起著穩(wěn)定肽鏈二級、三級空間結(jié)構(gòu)的作用，其數(shù)目越多，蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性就愈高[18]。疏水相互作用和二硫鍵是維持魚糜凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的主要作用力[37]。由表2可知，與CK相比，SOP和TGase處理的離子鍵略高于，且疏水鍵和二硫鍵均顯著高于CK處理，表明SOP和TGase的添加可增加蛋白質(zhì)的交聯(lián)程度，穩(wěn)定空間網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。

3 討論

本研究表明，SOP 和TGase 可改善熱煮后虹鱒魚肉的品質(zhì)，提高魚肉的耐煮性，但二者作用方式及對蛋白質(zhì)理化特性的影響略有差別。SOP作為一種功能性螯合劑，可以通過自身的凝膠化作用有效改善熱煮后魚肉的質(zhì)構(gòu)特性，還可通過其親水性氨基酸殘基與蛋白質(zhì)表面的親水基團相互作用，穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，限制蛋白質(zhì)肽鏈的展開，從而降低肌原纖維蛋白的流失和變性。TGase是一種蛋白質(zhì)交聯(lián)劑，可使多肽發(fā)生分子內(nèi)和分子間的共價交聯(lián)，誘導形成更致密的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，從而改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，避免蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸殘基的暴露，顯著提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、保水能力和凝膠能力等[38]。Yang等[39]研究發(fā)現(xiàn)，TGase 可以作為交聯(lián)劑，提高拉氏南美南極魚魚肉的凝膠網(wǎng)絡強度，與本研究結(jié)果相似。