廢棄黑木耳菌糠多糖的提取工藝優化

OptimizationofExtractionProcessof PolysaccharidesfromWaste Black FungusBran

CHU Panpan， LIU Yingjie，LIU Chengwei， HOU Tianjing （Lyuliang University Departmentof BiologicalandFood Engineering，Lyuliang，Shanxi O33OOo，China）

Abstract：Inordertooptimizetheextractionconditionsofpolysaccharidesfromwasteauriculariaauriculariabantheauriculariaau riculariabranwasusedasthematerialandtheyieldofpolysaccharidewasusedastheindex.Hotwaterextractionmethodandenzyme-ssistedextractionmethodwereusedtoextractpolysaccharidesfromauriculariaauriculariabran，andtheoptimalextraction processf polysaccharidefromauriculariaauriculariabranwasobtaindbysinglefactortestandresponsesurface method.Theresults showedthatthotialprosscodiiosofotateretationereasfls：soldqdati：4etrctioti3tue 81 ，so that polysaccharide yield was 5.251% .The importance order of influencing factors was C （extraction temperature）gt;A （solidliquid ratio） gt; B（extraction time）.Theoptimal conditions of enzyme assistedextractionwere：pH value4.4，solid-liquid ratio 1：15， temperature ，time4h，so thatpolysaccharideyieldwas 13.642% .TheimportanceorderofinfluencingfactorswasA （pH） D （time） gt; C（extractiontemperature）gt;B（solid-liquidratio）.Theresults showed thattheenzyme-assisted extraction method wassuperior tothehotwaterextractionmetodinextractingpolysaccharidesfromfungusbranInconclusion，itisfeasibletoextractpolysahrides from black fungus bran，which points out the direction of resource utilization of waste edible fungus bran.

Keywords：blackfungusban；olacchadeield；otwaterextractiometod；zeaistederactomeod；tractiotolg

廢棄黑木耳菌糠是種植黑木耳產生的剩余固體培養基，不僅含有大量的多糖粗纖維、木質素等成分，還含有豐富的蛋白質、氨基酸、維生素和微量元素。我國每年產生數量龐大的廢棄黑木耳菌糠，由于缺乏大規模處理方法，黑木耳菌糠被隨意丟棄于田野間，造成了嚴重的環境污染和資源浪費。因此，如何實現黑木耳菌渣廢棄物的資源化綜合利用，是一項亟待解決的問題。

廢棄黑木耳菌糠內含有豐富的菌絲體，這些菌絲體是提取食用菌多糖的寶貴資源。通過利用這些廢棄菌糠，可以有效降低食用菌多糖的提取成本，從而為食用菌多糖在農業領域的大規模應用創造條件。國內外研究學者針對黑木耳多糖的提取方法研究較多，但從黑木耳菌糠中提取多糖鮮見報道。目前，關于從食用菌或食用菌菌糖中提取多糖的方法主要包括熱水提取法2-7、酸堿提取法8-生物酶提取法[I0-I]、超聲波提取法[12-13]、微波提取法[14]、復合提取法[15-@等。其中，熱水提取法最為傳統，通常是借助熱水的熱力作用使細胞內部發生質壁分離，細胞中的水溶性物質得以穿過細胞壁并分散到外部溶劑中。此方法工藝簡便、設備需求較低，適用于工業化生產，但是操作過程需高溫環境和較大的料液比，這會導致能源消耗增加，耗時較長，提取率相對較低。生物酶提取法是通過酶（單一酶或復合酶）的水解作用破壞細胞壁結構，增強細胞外膜的通透性，使多糖完全暴露并溶解在各種溶劑中，提高多糖提取率。生物酶法提取在時間、溫度和能耗方面有著顯著的優勢，提取效率高，但存在酶的成本較高，易失活以及工藝條件要求相對苛刻等問題。

因此，筆者以黑木耳菌糠為試驗材料，采用熱水浸提法和酶輔助提取法提取黑木耳菌糠多糖。通過單因素試驗和響應面法優化，研究不同因素對黑木耳菌糠多糖提取效果的影響，確定兩種黑木耳菌糠多糖提取工藝的最佳條件。以多糖得率為指標，對黑木耳菌糠多糖的兩種提取方法進行比較評價，以期為廢棄食用菌菌糠的資源化利用指明方向。

1材料與方法

1.1材料與試劑

試驗材料：黑木耳菌糠，購自心言生物科技有限公司。

試驗試劑：木聚糖酶，酶活力為 購自上海源葉生物科技有限公司；纖維素酶，酶活力為 50U·mg，購自上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2主要儀器與設備

儀器與設備：HH-S8A電熱恒溫水浴鍋，購自北京科偉永興儀器有限公司；L550高速離心機，購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；VIS-723N可見分光光度計，購自北京瑞利分析儀器有限公司； FE28pH 計，購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；1000Y高速多功能粉碎機，購自浙江鉑歐電器有限公司；RE-3000A旋轉蒸發儀，購自上海亞榮生化儀器廠：DHG-9145A電熱鼓風干燥箱，購自上海凱鵬儀器設備廠。

1.3試驗方法

1.3.1葡萄糖標準曲線的繪制及黑木耳菌糠多糖得率的計算采用苯酚-硫酸法繪制葡萄糖標準曲線。線性回歸方程為 。

黑木耳菌糠多糖得率的計算公式如下：

式中，C為標準曲線得到的黑木耳菌糠多糖的質量濃度， 為黑木耳菌糠粉末質量， g；N 為溶液最終的稀釋倍數；V為定容后的體積， mL 。

1.3.2 熱水浸提法提取黑木耳菌糠多糖 （1）提取方法。黑木耳菌糠 烘干 → 粉碎過 0.25mm 篩 → 加蒸餾水，以一定料液比加熱提取 離心 取上清液， 旋轉蒸發濃縮 條件下，用4倍體積 95% 乙醇沉淀 離心 10min ，留沉淀 → 沉淀使用Sevag試劑除蛋白，干燥后即得黑木耳菌糠粗多糖。

（2）單因素和響應面法優化試驗設計。試驗分別對料液比 、提取時間分別為 （1、2、3、4、5h） 、提取溫度（60、70、80、90、 ）進行單因素試驗。在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken方法，以料液比、提取時間、提取溫度3個因素作為自變量，分別用 來表示。以多糖的得率設為響應值，進行響應面試驗優化設計，以期得到最佳的試驗條件和最高的多糖得率。

1.3.3酶輔助提取法提取黑木耳菌糠多糖 （1）提取方法。黑木耳菌糠 烘干 → 粉碎過0.25mm 篩 → 木聚糖酶、纖維素酶酶解 離心 取上清液， 旋轉蒸發濃縮 →4 倍體積95% 乙醇， 沉淀 離心10min一沉淀使用Sevag試劑除蛋白，干燥后即得黑木耳菌糠粗多糖。

（2）酶的篩選。試驗以黑木耳菌糠作為原料，分別測試木聚糖酶和纖維素酶的單一作用以及將二者按照1：1比例復配的效果。試驗中，在固定料液比為1：20、酶的添加量為底物的 1%.pH 值為4、提取溫度為40℃條件下，對黑木耳菌糠酶解 2h ，計算黑木耳菌糠多糖得率。

（3）單因素試驗及響應面法優化試驗設計。試驗分別對木聚糖酶與纖維素酶配比（1：3、1：2、1：1、2：1、 值（2、3、4、5、6）、料液比（1：10、1：20、1：30、1：40、1：50）加酶量 （0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5% ）、提取溫度 提取時間（1、2、3、4，5h ）進行單因素試驗。在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken方法，固定了加酶量，并以pH料液比、提取溫度、提取時間4個關鍵因素作為自變量，分別用 A，B，C，D 來表示。以多糖的得率設為響應值，進行響應面試驗優化設計，以期得到最佳的試驗條件和最高的多糖得率。

1.3.4數據分析與處理本研究趨勢圖利用Origin-Pro 2024軟件完成，響應面設計利用Design-Expert8.0.6軟件完成，方差分析利用IBMSPSSStatistics26軟件完成，每組試驗均進行3次平行試驗。

2 結果與分析

2.1熱水浸提法提取黑木耳菌糠多糖工藝優化

2.1.1不同因素對熱水浸提法提取黑木耳菌糠多糖得率的影響由圖1可知，隨著料液比的增加，黑木耳菌糠多糖得率逐漸上升。當料液比為1：20時，黑木耳菌糠多糖得率達到峰值，隨后黑木耳菌糠多糖得率逐漸下降。隨著提取時間的延長，黑木耳菌糠多糖得率逐漸上升。當提取時間為 3h 時，多糖的得率達到峰值，隨后黑木耳菌糠多糖得率逐漸下降。隨著提取溫度的升高，黑木耳菌糠多糖得率呈上升趨勢。當提取溫度為 時，黑木耳菌糠多糖得率達到峰值，隨后黑木耳菌糠多糖得率逐漸下降。

2.1.2響應面法優化黑木耳菌糠多糖提取工藝結果（熱水浸提法）對熱水浸提法提取黑木耳菌糠多糖工藝進行響應面分析，試驗設計見表1、試驗結果見表2。

表1熱水浸提法提取黑木耳菌糠多糖工藝影響因素優化響應面試驗設計

運用Design-Expert8.0.6軟件，以A（料液比）B（提取時間）C（提取溫度）為因素，多糖得率Y為響應值，得到17組試驗條件與響應值之間的二次多項回歸方程。方程公如下：

Y=5.22+0.33A+0.20B+0.34C-0.52AB-0.20AC-

由表3可知，模型的 值為0.9945，決定系數R2=0.9875，證明該模型可以反映各因素之間的關系，擬合程度較高，試驗誤差小，能很準確地反映實際值，可以對熱水浸提法提取黑木耳菌糠多糖最優工藝進行分析和預測。模擬項中， 具有極顯著性（ Plt;0.01 ）。 F 值越大，表明該因素對多糖提取效果的影響越顯著。由分析可得，影響因素大小排序為C（提取溫度） （料液比）gt;B（提取時間）。

由圖2可知，陡峭的坡面可以反映出各因素值變化對多糖得率的顯著影響。同樣，等高線的密集程度也揭示了影響的顯著性。圖形顏色的快速變化，進一步印證了這一點。當等高線形狀更接近于橢圓時，它暗示了2個因素間存在強烈的交互作用，故其因素間具有顯著的交互作用，以料液比與提取溫度間交互作用最突出。

響應面優化后，得出熱水浸提法最佳工藝條件為料液比1：14.10、提取時間 3.06h 、提取溫度 ，預測值為 5.262% 。修正后的工藝條件為料液比1：14、提取時間 ，提取溫度 ，并進行驗證試驗，重復3組平行試驗。試驗結果顯示，按照最佳工藝測得黑木耳菌糠多糖得率平均值為5.251% ，此平均值接近理論值 5.262% ，試驗結果與預測值相接近，說明該模型可靠。

2.2酶輔助提取法提取黑木耳菌糠多糖工藝優化

2.2.1 酶的篩選 由圖3可知，添加木聚糖酶和纖維素酶后，黑木耳菌糠多糖得率分別為 7.714% 和6.941% ；添加木聚糖酶和纖維素酶進行1：1復配后，黑木耳菌糠多糖得率為 8.808% ，其為最優。因此，單因素試驗選擇兩種酶復配添加。

2.2.2不同因素對酶輔助提取法提取黑木耳菌糠多糖得率的影響如圖4所示，木聚糖酶與纖維素酶配比為1：3＼～1：1時，黑木耳菌糠多糖得率呈上升趨勢。當酶配比為1：1時，多糖得率達到峰值，之后隨著酶配比的變化，多糖得率呈下降趨勢。原因可能是隨著木聚糖酶量的增加，黑木耳菌糠中的木聚糖發生降解，生成小分子木糖或寡聚糖。

酶的活性受環境 pH值影響顯著，這種影響會進一步作用于黑木耳菌糠多糖得率。當pH值為2時，溶液的酸度過大，酶的催化活性受到抑制，黑木耳菌糠多糖的得率較低；當pH值為4時，黑木耳菌糠多糖得率達到峰值，隨著pH值的增大，黑木耳菌糠多糖得率逐漸減小。

隨著料液比的增加，黑木耳菌糠多糖得率呈上升趨勢，料液比為1：20時，黑木耳菌糠多糖得率到達峰值，之后隨著料液比的升高，黑木耳菌糠多糖得率呈下降趨勢。原因可能是在一定的加酶量下，料液比達到某一數值后，酶促反應達到最大限度，或是反應體系黏度的變化使酶促反應速度降低

加酶量不同導致黑木耳菌糠多糖提取效果也不同。其中，當加酶量為 1.0% 時，黑木耳菌糠多糖得率達到最高值，為 7.732% ，之后隨著加酶量的升高，黑木耳菌糠多糖得率逐漸下降。原因可能是酶解產物與酶結合為復合體，使酶不能與底物結合充分，從而產生競爭性抑制，酶解速率下降，導致多糖得率下降。

提取溫度對黑木耳菌糠多糖得率影響較為顯著。隨著提取溫度的升高，黑木耳菌糠多糖得率上升，提取溫度為 50% 時，黑木耳菌糠多糖得率達到峰值，之后隨著提取溫度的升高，黑木耳菌糠多糖得率逐漸下降。

隨著提取時間的延長，酶降解完全，黑木耳菌糠多糖得率逐漸上升，提取時間為 時，黑木耳菌糠多糖得率達到峰值，之后趨于下降。由于反應時間的延長，底物不斷被消耗，多糖得率趨于平衡，達到飽和狀態。

Fig.4Influenceof diferentfactorsontheyieldofauriculariaauricularesiduepolysaccharidesextractedbyenzyme-asisted extraction method

2.2.3響應面法優化黑木耳菌糠多糖提取工藝結果（酶輔助提取法）對酶輔助提取法提取黑木耳菌糠多糖工藝進行響應面分析，試驗設計見表4、試驗結果見表5。

由表6可知，運用Design-Expert8.0.6軟件，以pH（A）料液比（B）提取溫度（C）、提取時間（D）

為因素，多糖得率（Y）為響應值，得到29組試驗條件與響應值之間的二次多項回歸方程。方程公式如下：

Y=13.54+0.32A-0.15B+0.15C+0.17D+0.042AB+ 0.79AC+0.22AD-0.27BC+0.25BD-0.017CD-1.16A2- 1.67B2-0.38C2-0.91D2

Tab.5Experimentalresultsofoptimizationof influencingfactorsintheresponsesurfacemethodologyforextractingauriculari auricula residuepolysaccharides by enzyme-assisted extractionmethod

模型的 值為0.9816，決定系數 R20.9631 證明該模型可以反映各因素之間的關系，擬合程度較高，試驗誤差小，能很好地反映實際值，可以對熱水浸提法提取黑木耳菌糠多糖最優工藝進行分析和預測。模擬項中， 有極顯著性中 （Plt;0.01 ）。 F 值越大，表明該因素對多糖提取效果的影響越顯著。由分析可知，影響因素大小排序為pH）gt;D（提取時間） （提取溫度） 1gt;B （料液比）。

由圖5可知，料液比與時間、料液比與提取溫度的曲面平緩，等高線近圓形，交互作用較弱；提取溫度與 $＼mathrm{＼pH}$ 、提取溫度與提取時間的3D曲面坡度陡峭，等高線近橢圓，交互作用較為顯著。

響應面優化后，酶輔助提取法的最佳工藝條件為pH值4.35、料液比1：15.60、提取溫度 ）

提取時間 4.12h ，預測值為 13.657% 。修正后的工藝條件為pH值4.4、料液比1：15、提取溫度 /提取時間 4h ，進行驗證試驗，重復進行3組平行試驗。試驗結果顯示，按照最佳工藝測得黑木耳菌糠多糖得率平均值為 13.642% ，此平均值接近理論值13.657% ，試驗結果與預測值相接近，說明該模型可靠。

3討論與結論

3.1 討論

在產業發展水平不斷提升的今天，食用菌產業有效帶動了各地經濟發展。然而，在采摘子實體后，菌糠當作廢料丟棄，造成了極大的環境壓力。如何高效處理廢棄菌糠并有效實現資源再利用，成為亟待解決的問題。

近年來，很多學者以廢棄食用菌菌糠為原料提取多糖，多糖得率范圍為 2%～30% 。侯軍等采用響應面法優化了杏鮑菇菌糠多糖提取工藝，熱水浸提法得到的多糖得率為 6.43% 。馮遼遼等采用熱水浸提法提取北蟲草菌糠中多糖，多糖得率為 13.95% ，多糖含量為279mg1kg-1 。張良等采用響應面法優化金針菇菌糠多糖提取工藝，熱水浸提法提取的多糖含量為 。趙春艷等采用響應面法優化提取香菇菌糠多糖，多糖得率為 5.61% 。姜慧燕等4采用微波輔助提取香菇菌糠多糖，多糖得率為 5.92% 。趙澤文等采用熱水浸提、超聲浸提、稀酸水解3種方式提取茶樹菇茵糠，其中稀酸水解法提取的多糖得率最高達到 29.29% ，分別是熱水浸提和超聲浸提的6.72倍和13.88倍。在多糖提取的眾多方法中，熱水浸提法具有操作簡便、設備要求低等優勢，已廣泛應用于廢棄菌糠多糖的提取，但存在多糖提取效率較低的缺點。因此，目前通常采用酶解、微波、超聲、稀酸水解等輔助手段來提高多糖得率。

3.2 結論

本研究以黑木耳菌糠為原料，采用熱水浸提法提取黑木耳菌糠多糖，通過單因素及響應面法優化試驗，確定熱水浸提法提取黑木耳菌糠多糖的最佳工藝條件為料液比1：14，提取時間 3h ，提取溫度 ，以多糖得率為指標，為 5.251% ；采用酶輔助提取法提取黑木耳菌糠多糖，通過單因素及響應面法優化試驗，確定黑木耳菌糠多糖酶輔助提取法的最佳工藝條件為pH值4.4料液比1：15、提取溫度 、提取時間 ，以多糖得率為指標，為 13.642% 。對熱水浸提法與酶輔助法比較分析可知，以黑木耳菌糠多糖得率為指標，酶輔助提取法提取多糖顯著優于熱水浸提法。原因可能是酶可在短時間內促進反應的進行，酶解木聚糖與纖維素，使得多糖的提取更加高效，也可能是在酶解反應過程中，其他物質轉化為多糖，進而提高了多糖的含量。從經濟角度出發，酶輔助提取法成本遠大于熱水浸提法，熱水浸提法更適用于大批量處理廢棄黑木耳菌糠；從便捷性角度出發，熱水浸提法要求較低、較為便捷，而酶輔助提取法由于酶的特性，則需要時刻控制溫度、酸堿度等條件，技術性較強。綜上所述，從廢棄黑木耳菌糠提取多糖將有效提升廢棄物資源綜合利用，為食用菌菌糠資源開發利用提供新技術。

參考文獻：

[1]楊啟航.黑木耳菌糠多糖的抗氧化和降血脂活性分析[D].泰安：山東農業大學，2019.

[2]CHENNN，ZHANGH，ZONGX，etal.Polysaccharidesfrom Auricularia auricula：Preparation，structural featuresandbiological activities[J].CarbohydratePolymers，2O2O，247：116750.

[3]侯軍，林曉民，李瑛，等.響應面法優化杏鮑菇菌糠多糖提取工藝[J].食品科學，2010，31（24）：155-158.

[4]馮遼遼，馬一翔，劉廣平，等.北蟲草菌糠中多糖的提取及成分測定[J].延安大學學報（自然科學版），2023，42（3）： 29-34.

[5]姜明，候安妮，畢銘鈺.平菇菌糠中多糖提取及超氧化物歧化酶檢測研究[J].湖北農業科學，2019，58（24）：194-196， 200.

[6]張良，劉洋，康競芹，等.響應面法優化金針菇菌糠多糖提取工藝[J].湖北農業科學，2014，53（16）：3886-3889.

[7]趙春艷，熊勇，高觀世，等.應用響應面法優化香菇菌糠多糖提取工藝[J].中國食用菌，2015，34（5）：63-67.

[8]HE PX，LIFL，HUANGL N，et al.Chemicalcharacterization and antioxidant activity of polysaccharideextract from spent mushroom substrate of Pleurotus eryngii[J]. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers，2016，69：48-53.

[9] ZENGZH，LVWJ， JINGYS，etal.Structural characterizationandbiological activitiesofa novel polysaccharidefromPhyllanthusemb lica[J].Drug Discoveriesamp;Therapeutics，2017， 11（2）： 54-63.

[10]張穎，曾艷，張麗姣，等.蛹蟲草菌糠多糖的分離純化及結構組成分析[J].食品科學，2014，35（13）：54-58.

[11]黃藝寧，陳國平，柯麗娜.響應面法優化白背毛木耳子實體多糖的酶法提取工藝[J].西昌學院學報（自然科學版），2018，32（4）： 6-10.

[12]劉瑩瑩.金針菇菌糠多糖的提取及保護鉛損傷的作用研究[D].長春：吉林農業大學，2023.

[13]吳玉柱，崔維建，李妍.超聲波輔助提取玉木耳多糖及其抗氧化活性分析[J].食品工業科技，2020，41（23）：142-148.

[14]姜慧燕，林茂，邵平.微波輔助提取香菇菌糠多糖的工藝研究[J].安徽農學通報，2010，16（24）：34-36.

[15]秦令祥，周婧琦，崔勝文，等.動態超高壓微射流法提取黑木耳多糖工藝研究[J].食品研究與開發，2019，40（19）：155-159.

[16]郝慧敏，縱偉.超聲波協同半仿生法提取黑木耳多糖工藝優化[J].食品研究與開發，2021，42（8）：109-112.

[17]趙澤文，馬雅靜，潘起濤，等.提取方式對茶樹菇菌糠多糖提取效率及生物學活性的影響[J].核農學報，2021，35（9）： 2172-2181.