高中生物學(xué)植物染色體制片流程優(yōu)化

中圖分類號：G633.91文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

植物染色體制片不僅是高中生物學(xué)教學(xué)中的基礎(chǔ)性實驗，還是遺傳學(xué)經(jīng)典實驗。該實驗作為獲取物種基礎(chǔ)核型數(shù)據(jù)等重要信息的途徑，廣泛應(yīng)用于植物細(xì)胞遺傳學(xué)、植物細(xì)胞生物學(xué)、植物分類、系統(tǒng)與進(jìn)化等多個領(lǐng)域。[1][2]然而，學(xué)生實際操作該實驗的成功率往往并不高。這主要歸因于學(xué)生難以把控預(yù)處理時間，且染色劑對染色體的親和程度會影響染色效果。因此，本文詳細(xì)論述一套較為規(guī)范的植物染色體制片流程，并提供兩種教材中未描述的染色劑配方，為植物染色體制片的實踐操作提供參考。

1植物染色體制片流程

1.1準(zhǔn)備實驗材料

實驗材料需要選取植物體內(nèi)有絲分裂較活躍的部位，如根尖、莖尖、嫩芽和愈傷組織等。其中，根尖因其分生區(qū)細(xì)胞的有絲分裂較為旺盛，且處于分裂期的細(xì)胞較多，操作簡單，便于開展實驗，常被用作首選實驗材料。本文建議選取水培洋蔥或蠶豆的根尖作為實驗材料。

根尖分生區(qū)細(xì)胞的有絲分裂在某個時段最為旺盛，因此在取材過程中，教師需要注意規(guī)劃取材時段。教師可以開展梯度預(yù)實驗確定最適的取材時段，具體操作為：從早晨6點開始，每隔半個小時選取3份長度為 的根尖，隨后按照染色體制片的流程進(jìn)行操作，制片完成后進(jìn)行鏡檢觀察，對每時段處于分裂期的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，選擇分裂期細(xì)胞數(shù)量最多的時段作為最適取材時段。在以上實驗過程中，教師需要確保實驗變量僅為取材時段，排除其他無關(guān)變量的干擾。學(xué)生在最適取材時段進(jìn)行實驗，不僅能顯著提高實驗的成功率，還有助于節(jié)約實驗材料。

1.2預(yù)處理實驗材料

學(xué)生將實驗材料置于預(yù)處理溶液中，確保溶液完全浸沒實驗材料，并將其置于常溫且避光的環(huán)境中。預(yù)處理操作的目的是抑制細(xì)胞分裂過程中紡錘體的形成，促使細(xì)胞停滯于有絲分裂中期，有利于觀察染色體的數(shù)目和形態(tài)。

常見的預(yù)處理溶液有秋水仙素溶液、飽和對二氯苯溶液、8-羥基喹啉溶液等。實驗中通常使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.05%～0.20% 的秋水仙素溶液處理植物材料。秋水仙素可溶于常溫蒸餾水，配制的溶液貯存于棕色瓶中。對二氯苯難溶于水，通常使用其飽和水溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5% ；配置時可以使用 的蒸餾水搖晃溶解，配制的溶液貯存于棕色瓶中。8-羥基喹啉難溶于水，需要置于 水浴鍋中加熱溶解，濃度通常為 0.002mol/L ，配制的溶液貯存于棕色瓶中。

低溫條件也可以抑制紡錘體的形成，但并不適用于所有材料且花費時間較長，因此在實際操作中較少使用。

預(yù)處理的時間需要嚴(yán)格把控，預(yù)處理時間過短，處于分裂中期細(xì)胞較少；預(yù)處理時間過長，染色體凝縮過度，形態(tài)不佳，不利于染色體形態(tài)的觀察。因此學(xué)生需要設(shè)置梯度實驗，確定實驗材料的最適預(yù)處理時間。

1.3 固定

在固定步驟中，學(xué)生取出經(jīng)過預(yù)處理的實驗材料，使用蒸餾水反復(fù)清洗6次以去除殘留物。之后，學(xué)生向其中加入預(yù)冷的固定液，確保固定液完全浸沒實驗材料，并置于 冰箱中保存。固定的目的是借助化學(xué)藥品迅速殺死活細(xì)胞，使染色體的組蛋白變性并沉淀，在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上盡可能維持細(xì)胞狀態(tài)。常用的固定液為卡諾氏固定液。固定的溫度為 ，時間一般為 2～24h ，體積較小的實驗材料可以適當(dāng)縮短固定時間。固定時間較長，會導(dǎo)致染色體發(fā)生畸變，不利于染色體形態(tài)的觀察。需要較長時間保存的實驗材料應(yīng)該置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 70% 的乙醇溶液中。

1.4解離

學(xué)生首先從固定液中取出實驗材料，并使用蒸餾水反復(fù)清洗6次。隨后，學(xué)生向其中加入預(yù)熱的鹽酸，確保鹽酸完全浸沒實驗材料，并置于 水浴鍋中進(jìn)行解離。解離的目的是分散細(xì)胞，便于后續(xù)的染色體觀察與分析。常用的解離液為濃度 1molL 的鹽酸，解離時間為 10min 左右，體積較小的實驗材料可以適當(dāng)縮短時間。此外，學(xué)生也可以用纖維素酶和果膠酶進(jìn)行解離，以達(dá)到類似的分散效果。解離時間過長，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，染色體裂解損傷；解離時間過短，細(xì)胞不易分散，染色體不易著色。學(xué)生需要進(jìn)行梯度實驗確定實驗材料最適的解離時間。

1.5漂洗及染色

學(xué)生取出解離完成的實驗材料，使用蒸餾水反復(fù)沖洗6次以上，并在避光條件下進(jìn)行染色。染色的目的是使染色體著色，有利于觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。教材中常用的染色劑為甲紫溶液、醋酸洋紅溶液，盡管這2種染色劑應(yīng)用廣泛，但難以在較短時間內(nèi)使染色體著色。本文建議使用卡寶品紅溶液和鐵礬醋酸洋紅溶液作為替代。

卡寶品紅溶液的配制方法： ① 配制A液，稱取 堿性品紅，將其溶于 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 70% 的乙醇溶液中（可長期保存）； ② 配制B液，取 10mL A液，將其添加至 90mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5% 的苯酚水溶液中，并置于 恒溫箱中溶解 （需2周內(nèi)使用）；③ 配制C液，取 液，并添加冰乙酸和甲醛各6mL ④ 配制染色劑，取 的C液，添加70 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 45% 的乙酸溶液和 山梨醇。

鐵礬醋酸洋紅的配制方法：將 100mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 45% 的冰乙酸溶液置于錐形瓶中并加熱煮沸；隨后緩緩加入 洋紅粉末，并用玻棒不斷攪拌使其溶解；待洋紅全部溶解后再次加熱煮沸；將1枚生銹的鐵釘浸入溶液中約 1min 后取出，鐵離子能夠增強染色劑的著色力。

染色時需要嚴(yán)格控制染色時間，染色時間過長，會使細(xì)胞質(zhì)著色，染色時間過短，會使染色體不著色，均不利于染色體形態(tài)的觀察。

1.6制片

學(xué)生使用鑷子取出實驗材料，將處理好的根尖和莖尖組織放到二孔凹槽中，用玻璃棒混合卡寶品紅染液將材料搗碎，然后用少量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 45% 的醋酸溶液處理細(xì)胞液 。隨后，學(xué)生用濾紙吸掉蓋玻片周圍多余的染液，再將干凈的濾紙放在蓋玻片上，用玻璃棒沿蓋玻片對角線來回?fù){動，其間注意要用力均勻，并由輕到重。3根據(jù)鏡檢的結(jié)果，學(xué)生對染色體形態(tài)好但分散不佳的位置重復(fù)輕敲，使染色體分散。對于不處于同一平面的染色體可使用濾紙壓緊蓋玻片，結(jié)合拇指摁壓的方法使染色體處于同一平面。操作過程中需要注意的要點是壓緊蓋玻片，以防滑片。

2植物染色體制片注意事項

2.1預(yù)處理時間及預(yù)處理溶液選擇

預(yù)處理時間及預(yù)處理溶液的選擇直接影響染色體的形態(tài)。預(yù)處理溶液的作用是抑制紡錘體的形成。若處理時間過短，紡錘絲未完全消解，染色體在分裂中期之后開始解螺旋，導(dǎo)致染色體的形態(tài)差；若處理時間過長，紡錘絲消解后染色體繼續(xù)凝縮，導(dǎo)致染色體凝縮過度不便觀察。

不同預(yù)處理溶液的作用效果不同，需要根據(jù)不同溶液的效果調(diào)整處理時間。秋水仙素處理后的細(xì)胞大部分處于分裂中期，作用效果強，需要根據(jù)實驗材料的具體情況選擇相應(yīng)的濃度，處理時間相對較短[4；對二氯苯處理后的染色體分散效果較好，且作用溫和，與秋水仙素相比可以適當(dāng)延長處理時間；8-羥基喹啉處理的染色體著絲?？O痕清晰，易于分析基礎(chǔ)核型數(shù)據(jù)，其預(yù)處理的時間相對其他2種溶液較長。[5]

2.2染色劑的選擇

不同染色劑對實驗材料染色體的親和力存在顯著差異，故學(xué)生需要嘗試使用不同的染色劑處理實驗材料，以達(dá)到最佳染色效果?？▽毱芳t溶液是一種運用較為廣泛的優(yōu)良染色劑，具有染色簡便、快速的特點，且制作成永久裝片后顏色持久；含有固定液成分，在制片中可省去固定步驟?？▽毱芳t溶液配制完成之后，需要避光靜置2周以后使用，且在2年保質(zhì)期內(nèi)放置越久效果越好。醋酸洋紅溶液的配制和染色較為方便，且對細(xì)胞壁的穿透力較強，然而其染色效果不及卡寶品紅溶液。若醋酸洋紅溶液難以達(dá)到理想的染色效果，學(xué)生可以選擇另一種配制簡單的鐵礬醋酸洋紅溶液，鐵離子的存在可以明顯增大染色劑的著色能力。

筆者建議在中學(xué)實驗中應(yīng)首先選擇卡寶品紅溶液，因其能夠使極大部分實驗材料的染色體著色且分色明顯。在實驗過程中，學(xué)生需要在染色前將解離時殘留的鹽酸用蒸餾水沖洗干凈，以免影響染色劑著色。解離時間的長短也會影響染色效果，若解離時間過短，細(xì)胞質(zhì)易著色，影響分辨染色體的形態(tài)；若解離時間過長，染色體不易著色。

3展望

教師將植物染色體制片技術(shù)應(yīng)用于日常教學(xué)中，不僅可以直觀地引導(dǎo)學(xué)生觀察細(xì)胞分裂過程中不同階段的染色體形態(tài)，還有助于獲取基礎(chǔ)核型數(shù)據(jù)，為其他學(xué)科的研究提供參考資料。高中教材中描述的染色體制片流程包括解離、漂洗、染色、制片等步驟，在實際操作中，預(yù)處理、固定、解離及染色的時間均需要嚴(yán)格把控。因此，在正式開展實驗前，教師需要進(jìn)行預(yù)實驗探索材料最適的處理條件，這一措施可以大幅縮短實驗時間，提高實驗效率。此外，鑒于卡寶品紅染色劑在染色效果和操作簡便性方面的優(yōu)勢，建議將其作為首選染色劑，以進(jìn)一步提升實驗效果。

參考文獻(xiàn)

[1]李懋學(xué)，張贊平.作物染色體及其研究技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996.

[2]李懋學(xué)，張教方.植物染色體研究技術(shù)[M.哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)出版社，1991.

[3]陳高，孫航，孫衛(wèi)邦.改進(jìn)的植物染色體制片方法[J].植物生理學(xué)通訊，2007（4）：759-760.

[4楊寧，談永霞，李巧峽，等.百里香染色體制片優(yōu)化及核型分析[J.草業(yè)學(xué)報，2012，21（1）：184-189.

[5]陳是宇，方程，孫彥，等.燕麥屬牧草根尖組織染色體觀察方法的優(yōu)化研究[J].草原與草坪，2008（2）：23-26.