EMS誘變蘋(píng)果育種技術(shù)規(guī)程

中圖分類(lèi)號(hào)：S661.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0488-5368（2025）04-0020-04

Abstract：This regulation sets the rules for apple breeding using ethyl methanesulfonate （EMS）.It covers selecting materials， mutagenesis methods，the amount of mutagen，growing seedlings，transplanting，managing fields，and choosing the best plants inthe first and second rounds of selection.Theuse of this regulation helps standardize EMS-induced apple breeding research and provides clear guidance.It reduces breeding costs， shortens the breeding time，and improves eficiency.It provides novel germplasm resources for apple improvement.

Key words ：Apple ;EMS mutagenesis ;Technical retulation

蘋(píng)果是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，是我國(guó)黃土高原地區(qū)主要的支柱性產(chǎn)業(yè)和主要的經(jīng)濟(jì)收人之一，培育具有良好抗逆性的新蘋(píng)果品種具有十分重要的意義。傳統(tǒng)蘋(píng)果育種手段流程繁瑣、年限長(zhǎng)、效率較低。EMS（甲基磺酸乙酯）誘變育種具有效率高、操作流程簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)[]，是一種有效的育種手段。針對(duì)EMS誘變蘋(píng)果育種體系尚未建立，其相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)尚不規(guī)范等問(wèn)題，本研究制定了“EMS誘變蘋(píng)果育種技術(shù)規(guī)程”，旨在為EMS誘變蘋(píng)果育種工作提供技術(shù)參考，加快蘋(píng)果新種質(zhì)的培育。

1范圍

規(guī)定了EMS誘變蘋(píng)果育種的試驗(yàn)材料要求、預(yù)處理、最佳誘變劑量、突變體篩選、育苗、移栽、田間管理等技術(shù)內(nèi)容。本研究適用于EMS誘變蘋(píng)果育種。

2 規(guī)范性引用規(guī)程

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本規(guī)程必不可少的條款。其中，標(biāo)注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本規(guī)程；不標(biāo)注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本規(guī)程。

NY/T441蘋(píng)果生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程。

NT/T1085蘋(píng)果苗木繁殖技術(shù)規(guī)程。

NY/T1318農(nóng)作物種質(zhì)資源鑒定技術(shù)規(guī)程（蘋(píng)果）。

NY/T2424植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南（蘋(píng)果）。

NY/T2719蘋(píng)果苗木脫毒技術(shù)規(guī)范。

NY/T2921蘋(píng)果種質(zhì)資源描述規(guī)范。

3 術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本規(guī)程

EMS誘變：化學(xué)誘變劑EMS（甲基磺酸乙酯）通過(guò)浸泡等方法處理生物材料，使經(jīng)過(guò)處理的生物材料發(fā)生穩(wěn)定的突變。

4要求

4.1 人員

試驗(yàn)人員應(yīng)熟悉蘋(píng)果組織培養(yǎng)、栽培、育種等基本操作，在開(kāi)展相關(guān)試驗(yàn)前充分了解EMS誘變存在的風(fēng)險(xiǎn)隱患和安全操作規(guī)范，并在試驗(yàn)過(guò)程中做到充分的防護(hù)，以免對(duì)試驗(yàn)人員人體健康造成損害。

4.2 誘變材料

選擇在當(dāng)?shù)乇憩F(xiàn)適應(yīng)性強(qiáng)，具有多方面優(yōu)良性狀，但還有個(gè)別重要缺點(diǎn)需要改變的蘋(píng)果品種作為誘變對(duì)象。一般選取具有良好活力的蘋(píng)果無(wú)菌組培苗或形態(tài)完整無(wú)破損的種子。

5 誘變處理

5.1 誘變?cè)噭┡渲?/p>

化學(xué)誘變劑EMS（甲基磺酸乙酯）需溶解在 的磷酸緩沖溶液中進(jìn)行后續(xù)不同濃度的配制，進(jìn)行試驗(yàn)所使用的EMS工作液濃度一般選擇為 0 . 1 % ～ 0 . 6 % ，最終工作液濃度根據(jù)后續(xù)得到的半致死劑量確定。

5.2 材料處理操作

5.1.1無(wú)菌組培苗處理步驟如下。

（a）選取繼代培養(yǎng) 3 0 d 左右的蘋(píng)果無(wú)菌組培苗，挑取組培苗上部完全展開(kāi)的、生命力旺盛的葉片摘取，用無(wú)菌手術(shù)刀在葉片背面沿垂直葉脈方向劃2＼～3處，使葉片劃破而不劃斷。

（b）將用刀片劃過(guò)的葉片放入裝有配制好的EMS溶液的組培瓶中，放人避光條件的搖床中震蕩處理 1 ～ 6 h ，用葉片放進(jìn)磷酸緩沖液浸泡震蕩作為對(duì)照。

（c）震蕩處理結(jié)束后，取出葉片，用無(wú)菌水清洗3次，每次 5 m i n ;最后用濾紙吸干水分，將葉片背面貼于誘導(dǎo)再生培養(yǎng)基上（全程在超凈工作臺(tái)中操作），放入遮光條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，暗培養(yǎng)1 5 ～ 2 0 d 后移到光下。

（d）光下培養(yǎng) 3 0 d 后，統(tǒng)計(jì)葉片存活率、再生率，同時(shí)獲得誘變?cè)偕纭＝y(tǒng)計(jì)后選出存活率接近5 0 % 的處理組合作為半致死劑量進(jìn)行后續(xù)的誘變。

5.2.2蘋(píng)果種子處理分以下3個(gè)步驟。

（a）挑選形態(tài)飽滿、生活力強(qiáng)的種子，用清水將種子洗凈，洗凈后用 酒精對(duì)種子消毒 3 0 s 再用清水洗凈酒精，最后放入蒸餾水中浸泡吸水 。

（b）將吸水后的種子放人配制好的EMS溶液中，放入搖床中避光震蕩，在磷酸緩沖液中浸泡過(guò)的種子作為對(duì)照。

（c）震蕩結(jié)束后倒掉廢液，用 5 % （硫代硫酸鈉）溶液沖洗種子3次，每次 5 m i n 。隨后將種子置于流水下沖洗 3 ～ 4 h ，洗凈廢液，種子后續(xù)進(jìn)行沙藏。

6育苗

6.1 組培苗培育

擴(kuò)繁生根，將經(jīng)過(guò)誘變得到的再生組培苗進(jìn)行繼代擴(kuò)繁。用繼代培養(yǎng)基培養(yǎng) 3 0 d 之后生根。用生根培養(yǎng)基培養(yǎng)45d，移栽前開(kāi)蓋煉苗 3 d 。煉苗完成后將組培苗轉(zhuǎn)移到含有腐殖質(zhì)：蛭石：珍珠巖（3：1：1）的黑色營(yíng)養(yǎng)缽里，營(yíng)養(yǎng)缽統(tǒng)一裝人黑色育苗托盤(pán)中，放人恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)期間定期噴水并澆灌營(yíng)養(yǎng)液，避免造成干旱。并做好相應(yīng)的防蟲(chóng)、防病害管理，讓幼苗健康生長(zhǎng)。

6.2 實(shí)生苗培育

6.2.1沙藏將處理后的種子無(wú)重疊平鋪在兩層濕紗布上，種子上再鋪一層濕紗布，置于容器內(nèi)（容器均已提前消毒），容器上留有透氣口，將容器在 下沙藏 3 0 ～ 6 0 d 。對(duì)不同品種的種子，沙藏時(shí)間需結(jié)合品種要求進(jìn)行調(diào)整。沙藏期間，每天取出容器打開(kāi)在室溫下透氣，去除發(fā)霉的種子，并定期噴水，保持種子表面濕潤(rùn)。

6.2.1育苗將沙藏后的種子播種到穴盤(pán)里，每個(gè)穴孔播種一粒種子，放入恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。期間記錄種子發(fā)芽數(shù)，統(tǒng)計(jì)種子的發(fā)芽率，得出半致死組合，用于后續(xù)誘變工作。當(dāng)幼苗長(zhǎng)到5＼～7片真葉時(shí)移栽到單獨(dú)的營(yíng)養(yǎng)缽中，繼續(xù)培養(yǎng)觀察。

7突變體觀察鑒定

7.1 表型觀察鑒定

在幼苗培養(yǎng)過(guò)程中，觀察幼苗的生長(zhǎng)狀況，記錄可能出現(xiàn)差異的農(nóng)藝形狀如株高、莖粗、葉片形狀顏色大小、葉邊緣、新葉著生方式等，與對(duì)照組進(jìn)行比較。將出現(xiàn)表型差異的株系標(biāo)記為突變體植株。

7.2 分子生物學(xué)鑒定

ISSR（inter-simple sequence repeat）標(biāo)記是一種基于PCR利用特定的寡核苷酸引物擴(kuò)增基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple SequenceRepeat，SSR）技術(shù)。ISSR是評(píng)估遺傳多樣性的最佳標(biāo)記之一，因?yàn)樗哂泻?jiǎn)單快速，成本低，多態(tài)性高的特點(diǎn)，近年來(lái)ISSR已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于突變體的鑒定和遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)中。ISSR技術(shù)同樣也被運(yùn)用于檢測(cè)EMS突變體中，已在多個(gè)物種的EMS突變體鑒定中證實(shí)可行[2.3]。本規(guī)程使用 ISSR 技術(shù)在分子生物學(xué)水平上鑒定蘋(píng)果EMS突變體。

7.2.1 ISSR體系優(yōu)化 ISSR體系優(yōu)化步驟如下

（a）選取一些適合蘋(píng)果的UBC系列引物[4]（數(shù)量不宜過(guò)少，以免影響鑒定效果）或其他適合的引物，提取對(duì)照植株DNA，將各引物進(jìn)行ISSR-PCR篩選。由于各引物的TM值不同，設(shè)置不同梯度的退火溫度，每條引物在不同的退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終選擇出具有清晰條帶且無(wú)嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象的引物，并記錄各引物最適宜的退火溫度。

（b）在PCR擴(kuò)增變性階段設(shè)置不同梯度循環(huán)次數(shù)，如30、35、40、45次循環(huán)（可根據(jù)實(shí)際情況改變），篩選出具有清晰條帶的循環(huán)次數(shù)。

（c）ISSR-PCR反應(yīng)體系設(shè)置不同的DNA模板濃度，如 n g / μ L （根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行改動(dòng)），篩選出具有清晰條帶的DNA模板濃度。

7.2.2誘變植株的鑒定提取誘變后植株的DNA并進(jìn)行編號(hào)，利用上述步驟篩選得到的引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳5，觀察誘變植株與對(duì)照植株（對(duì)照為用磷酸緩沖液處理過(guò)的植株）的條帶區(qū)別，若出現(xiàn)條帶的增加、缺失、或者移位顛倒等，則該植株為突變體。

8移栽

8.1 苗木要求

1a生或2a生苗木。

8.2 株行距

山地、丘陵地區(qū)栽植密度為 或1 . 0 m × 4 m ，平地栽植密度為 1 . 2 m × 3 . 5 m 或 。

8.3 移栽時(shí)間

春季萌芽前或秋季落葉后帶土移栽。

8.4 挖溝改土

畫(huà)線定點(diǎn)，機(jī)械開(kāi)挖定植溝（寬 0 . 6 m 深0.8m）。溝開(kāi)挖后表土與新土分開(kāi)放置，表土與腐熟的有機(jī)肥體積比為3＼～5：1，混合均勻回填下部，新土覆蓋在上部且略高于地表。

8.5栽植

挖穴，栽植穴直徑 0 . 5 m ，深 0 . 5 m ，將帶土苗木入穴，保持苗干直立；填入表土至1/2時(shí)踏實(shí)，再填滿踏實(shí)，定植深度為嫁接口露出地面 深度為宜；移栽后澆透水，合熵后及時(shí)培土扶苗。

8.6 栽后管理

均統(tǒng)一按照常規(guī)管理，管理參照NY/T441執(zhí)行。

9初選

9.1 試驗(yàn)周期

對(duì)于突變體蘋(píng)果的試驗(yàn)周期至少為2個(gè)年生長(zhǎng)周期，且在每個(gè)年生長(zhǎng)周期結(jié)束前，各植株均能夠結(jié)出果實(shí)。

9.2 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)一般選擇在一個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行。進(jìn)行試驗(yàn)的地點(diǎn)應(yīng)能夠充分代表該地區(qū)蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)的氣候、土壤、栽培條件和生產(chǎn)水平。參照NY/T441規(guī)范。

9.3 試驗(yàn)材料

每株由突變體組培苗生根得到的苗木定為一個(gè)突變體，同時(shí)磷酸緩沖液處理所得再生苗生根而成的苗木定為對(duì)照。

每粒種子長(zhǎng)成的突變體實(shí)生苗定為一個(gè)突變體株系，由磷酸緩沖液處理的種子長(zhǎng)成的實(shí)生苗作為對(duì)照。

9.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

隨機(jī)區(qū)組，同一批突變體材料和對(duì)照安排在同一個(gè)區(qū)組內(nèi)。

9.5調(diào)查內(nèi)容和記載要求

調(diào)查不同株系的植物學(xué)特性、生物學(xué)特性、產(chǎn)量、品質(zhì)等，記載項(xiàng)目與要求應(yīng)符合NY/T2424中所規(guī)定。

種植過(guò)程中，應(yīng)對(duì)不同株系的主要農(nóng)藝性狀拍照，留存品種表現(xiàn)數(shù)據(jù)。每個(gè)株系的關(guān)鍵生育期，應(yīng)有相應(yīng)的長(zhǎng)勢(shì)照片。每個(gè)株系穩(wěn)定結(jié)果后的照片，應(yīng)含有株系名稱(chēng)的掛果植株照片、完整的果實(shí)與果實(shí)剖面的相應(yīng)照片，具體按照非主要農(nóng)作物品種登記指南執(zhí)行。

篩選具有適應(yīng)性強(qiáng)，具有多方面優(yōu)良性狀且個(gè)別重要缺點(diǎn)改良等特征的突變體蘋(píng)果品種進(jìn)行品種試驗(yàn)。

9.6 篩選優(yōu)良突變體蘋(píng)果新種質(zhì)

9.6.1觀測(cè)時(shí)期對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行周年觀察，記錄突變體株系和對(duì)照材料的露紅期、萌芽期、開(kāi)花期、果實(shí)成熟期、果實(shí)發(fā)育天數(shù)等重要時(shí)間點(diǎn)。觀察EMS處理材料是否改變開(kāi)花結(jié)果時(shí)期；花，葉片、果實(shí)表現(xiàn)是否有與對(duì)照相比有明顯差異。

9.6.2植物學(xué)性狀對(duì)不同株系的樹(shù)體、枝條、芽、葉片、花、果實(shí)進(jìn)行觀察測(cè)量，按NY/T2424、NY/T2921的規(guī)定執(zhí)行。

9.6.3生物學(xué)性狀測(cè)量不同株系的樹(shù)高、冠徑、干周、一年生枝節(jié)間長(zhǎng)度、一年生枝長(zhǎng)度、一年生枝粗度、總枝量及調(diào)查枝類(lèi)組成，測(cè)量葉片長(zhǎng)度、葉片寬度、葉柄長(zhǎng)度，對(duì)開(kāi)花結(jié)果等各物候期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，按NY/T2921的規(guī)定執(zhí)行。

9.6.4產(chǎn)量性狀按照NY/T2921的規(guī)定執(zhí)行。9.6.5果實(shí)性狀單果重、果型指數(shù)、果實(shí)色澤、可溶性固形物含量、可滴定酸、可溶性固形物含量果實(shí)質(zhì)構(gòu)、抗壞血酸含量、可溶性糖含量、蘋(píng)果酸含量等果實(shí)外在和內(nèi)在品質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。

9.6.6 抗病性分析按照NY/T1318規(guī)定執(zhí)行。

9.7篩選優(yōu)良抗逆突變體材料

9.7.1耐鹽功能評(píng)價(jià)水培苗做15d的鹽處理，測(cè)定生物量、相關(guān)生理指標(biāo)、 和 含量、植物激素（ A B A ， J A ， G A s） 含量，提取DNA、RNA和qRT-PCR定量分析耐鹽功能。

9.7.2抗旱性評(píng)價(jià)盆栽苗做9d的短期干旱處理。測(cè)定生物量、生理指標(biāo)、植物激素（ABA、JA、GAs）含量，提取DNA、RNA 和qRT-PCR分析抗旱性。

9.7.3 抗病性評(píng)價(jià) 按照NY/T1318規(guī)定執(zhí)行。

10 擴(kuò)繁移栽

10.1 擴(kuò)繁方式

對(duì)上一步中得到的優(yōu)良突變體株系，應(yīng)進(jìn)一步用高接或芽接的方法增加繁殖系數(shù)和穩(wěn)定變異，參照NY/T441執(zhí)行。

10.2 移栽

參照8.1＼～8.6移栽標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

11 品種試驗(yàn)

11.1 試驗(yàn)周期

參照9.1試驗(yàn)周期過(guò)程進(jìn)行。

11.2 試驗(yàn)地點(diǎn)

在多個(gè)不同生態(tài)地區(qū)進(jìn)行品種比較試驗(yàn)，借以觀察誘變材料的適應(yīng)范圍。其中同一生態(tài)區(qū)不少于3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，試驗(yàn)點(diǎn)數(shù)量與布局應(yīng)當(dāng)能夠代表擬種植的適應(yīng)區(qū)域。

11.3 試驗(yàn)材料

篩選的優(yōu)良突變體蘋(píng)果株系，未突變蘋(píng)果株系

作為對(duì)照。

11.4 試驗(yàn)地點(diǎn)

在多個(gè)不同生態(tài)區(qū)域，選擇能代表不同區(qū)域氣候、土壤、栽培條件和生產(chǎn)水平的地點(diǎn)，選擇土壤肥力一致、灌溉方便的地塊。選擇同一生態(tài)區(qū)不少于3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，試驗(yàn)點(diǎn)數(shù)量與布局應(yīng)當(dāng)能夠代表擬種植的適應(yīng)區(qū)域。

11.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

合理設(shè)置試驗(yàn)小區(qū)，小區(qū)面積不易過(guò)大。對(duì)于篩選的突變體株系，每個(gè)株系應(yīng)栽植或嫁接至少10株樹(shù);在觀察植株的器官或部位時(shí)，每個(gè)植株上取樣數(shù)量應(yīng)至少2個(gè)。盡量保證地形、土壤、小氣候和農(nóng)業(yè)技術(shù)條件一致，盡量消除一切影響試驗(yàn)準(zhǔn)確性的誤差。

11.6 調(diào)查內(nèi)容和記載要求

嚴(yán)格執(zhí)行各項(xiàng)栽培管理措施，有詳細(xì)的觀察記載，并對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)方法分析，所有標(biāo)準(zhǔn)參照NY/T2424執(zhí)行。

11.7 相關(guān)鑒定與檢測(cè)

參照9.6和9.7進(jìn)行篩選優(yōu)良突變體新種質(zhì)和優(yōu)良抗逆突變體材料。

12 創(chuàng)制新種質(zhì)

試驗(yàn)結(jié)束后，描述篩選出EMS誘變蘋(píng)果品種的質(zhì)量性狀，統(tǒng)計(jì)分析數(shù)量性狀如果實(shí)大小、質(zhì)量等數(shù)據(jù)，并總結(jié)主要栽培技術(shù)要點(diǎn)，撰寫(xiě)試驗(yàn)報(bào)告，創(chuàng)制新種質(zhì)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 臧輝，任衛(wèi)波.EMS誘變?cè)谥参镉N中的研究與應(yīng)用［J]．分子植物育種，2018，16（17）：5782-5788.

[2] PereraD，BarnesJD，BaldwinSB，etal.Mutagenesisof in vitro cultures of Miscanthus × giganteus cultivarFreedom and detecting polymorphismsofregeneratedplantsusing ISSR markers[J].Industrial Cropsamp;Prod-ucts，2015，65110-65116.

[3] WUL，LIM，YANGX，etal.ISSRAnalysisofChlo-rophytum Treatedby Three Kinds of Chemical Mutagen[J].Journal of Northeast Agricultural University（Eng-lish edition），2011，18（4） ：21-25.

[4] 郭思雨.EMS誘變創(chuàng)建蘭州百合突變體[D].沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

[5] 張蒙蒙.枇杷潛伏芽的EMS誘變及ISSR分析[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.