超聲血流增強效應調節腫瘤微環境增強舒尼替尼抗腫瘤效應的研究

中圖分類號：R730.59 文獻標志碼：A

摘要：目的探討低強度超聲激勵微泡空化（USMC）誘導的腫瘤灌注增強效應聯合血管生成抑制劑對腫瘤微環境的改善及增強抗腫瘤療效的作用。方法將786-O人腎透明細胞癌荷瘤小鼠隨機分為4組；對照組（24只，無任何治療）、USMC組（24只，USMC治療）舒尼替尼組（24只，SU治療）和USMC + SU組（24只，USMC聯合SU治療）。在具體治療與分析方法上，USMC治療使用超聲診療一體機;基于超聲造影評價腫瘤血流增強效應;通過繪制腫瘤生長曲線、記錄小鼠生存期及Tunel法檢測腫瘤細胞凋亡評價抗腫瘤療效；免疫組化分析瘤組織中內皮型一氧化氮合酶（eNOS）;酶聯免疫吸附測定（ELISA）方法檢測腫瘤內NO含量;免疫熒光用于分析腫瘤組織中血管密度（CD31）、血管內皮生長因子（VEGF）以及周細胞覆蓋率（ ）的表達;液相色譜-質譜聯用法檢測腫瘤內藥物積聚濃度。結果USMC 治療后超聲造影分析腫瘤峰值強度（PI）、曲線下面積（AUC）及腫瘤灌注面積百分比較治療前增加（均 Plt;0 . 0 0 1 ）。USMC聯合SU治療明顯抑制了腫瘤進展。聯合治療組中內皮型一氧化氮合酶（eNOS）及NO含量較對照組顯著增加（均 ）。與其他3組相比，聯合治療組中CD31、VEGF的表達顯著降低（均 P lt; 0 . 0 5 ），且周細胞覆蓋率及腫瘤細胞凋亡百分比顯著增加（均 Plt;0 . 0 0 1 ）。藥物濃度檢測顯示，聯合治療組腫瘤內 SU濃度是單純藥物治療組的1.6倍。結論 超聲血流增強效應聯合SU治療可改善腫瘤微環境，誘導血管正常化并促進藥物滲透，從而增強SU的抗腫瘤療效。

Abstract：ObjectiveTexploretehancedtumorperfusionefectinducedbylow-intensityultrasound-excitedmicrobubblecaviation （USMC）combedwithangiogenesisihbitorsonimprovingthetumormicroenvironmentandimprovinganti-tumoreffcacyMethods 786-Oclearcellrenalcellcarcinomatumor-bearingmice wererandomlydividedintofourgroups：controlgroup（24 mice，withoutany treatment），USMC group（24 mice，USMC treatment），and sunitinib group （24 mice，treated with SU）and USMC + SU group （24 mice，treated with USMCcombined withSU）.Intermsofspecific treatmentandanalysis methods，USMCuses theultrasonicdiagnosis andtreatmentallionemacine；evaluatestheumorbloodoweancementfectbasedoncontrast-ehancedultrasoudndevaluatestheanti-tumoreficacybydrawingtumorgrowthurves，recordingmousesurvivaltimes，anddetectingtumorcellapoptosisith theTunelmethod；Imunohstochemicalanalysisofendothelialnitricoxidesynthase（eNOS）intumortisue；Enzye-linkedimunosorbentasay（ELISA）methodtodetectNOcontent intumors；Immunofluorescenceisusedtoanalzebloodveseldensity（CD31） and vascular endothelium in tumor tissue Expression of growth factors （VEGF）and pericyte coverage （ α -SMA/CD31）；high-performanceliquidchromatography-massspectrometrytodetect intratumoralSUdrugaccumulationconcentration.ResultsAfterUSMCtreat ment，thecontrast-enancedultrasoundanalysisof tumorpeak intensity（PI），areaunderthecurve（AUC）andtumorperfusionarea percentage increase compared with those before treatment（all ）.USMC combined with SU treatment significantly inhibited tumorprogresion.Thelevelsofendothelialnitricoxidesynthase（eNOS）andNOinthecombinedtreatmentgroupweresignificantly higher than those in the control group（both ）. Compared with the other three groups，the expressions of CD31 and VEGF in the combination treatment group were significantly reduced（all ），and the pericyte coverage rate and tumor cell apoptosis percentage were significantly increased（all Plt;0 . 0 0 1 ）.Thedetection of drug concentration showed that the intratumoral SU concentration inthecombinedtreatmentgroupwas1.timesthatofthedrugtreatmentgroupalone.Conclusion Theenhanced bloodfloweffectof ultrasoundcombinedwithSUtreatmentcanimprovethetumormicroenvironment，inducenormalizationofblodvesselsandpromote drug penetration，thereby enhancing the anti-tumor eficacy of SU.

Key words：cavitation;tumor perfusion enhancement；tumor microenvironment;antiangiogenesis therapy

近年來，腫瘤抗血管生成治療取得了突破性發展，尤其是對傳統放、化療均不敏感的透明細胞腎細胞癌（ccRCC），抗血管生成治療已成為其一線治療方案。目前，舒尼替尼（SU11248）作為單一藥物，已被批準用于治療晚期腎癌[1-2]，但其在短期內（一般為1年）便出現耐藥[3-4]。研究發現，抗血管生成耐藥的重要原因之一是腫瘤內結構和功能異常的未成熟血管導致灌注不足，進而引起藥物滲透受限及分布不均[5-6]。因此，增加腫瘤乏血供區域的血流灌注，可能有助于優化藥物在瘤內分布，這對維持抗血管生成療效、改善疾病晚期患者的治療效果極其重要。課題組已有研究表明，低機械指數超聲激勵微泡空化（Ultrasound stimulated microbubble cavitati-on，USMC）作用于實體瘤，可產生穩定的血流增強效果（簡稱超聲血流增強效應），以改善腫瘤乏血供區域的灌注狀態，進而增效腫瘤化療和免疫治療[7-9]。研究小組前期通過調整機械指數、脈沖重復頻率、空化時間等治療參數，在786-0人腎透明細胞癌裸鼠腫瘤模型中優化了可產生有效、穩定血流增強效應的空化劑量。本研究在此基礎上，通過建立786-O人腎透明細胞癌腫瘤模型，在優化的空化治療參數下，探討USMC聯合抗血管生成藥物SU能否改善腫瘤微環境并增強SU抗腫瘤療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

1.1.1實驗動物和模型建立

BALB/c雄性裸鼠6＼～8周齡96只，體重 1 8 ～ 2 2 g 。購自中國醫學科學院（中國北京），所有裸鼠都在無特定病原體的條件下飼養。本研究中的動物模型方案經倫理委員會批準，審批號為2022-AE264。建立786-0人腎透明細胞癌裸鼠腫瘤模型：786-0人腎透明細胞癌細胞（購于上海中科院細胞庫）在含有 10 % 胎牛血清和 1 % 青霉素/鏈霉素（ 1 0 0 0 0m L ）的RPMI1640培養基中培養，溫度 ， 5 % CO2。調整786-0細胞懸液濃度為 ，于小鼠腋下緩慢注入786-0細胞懸液 ，建立皮下移植瘤模型。

1. 1.2 主要試劑

全氟丁烷微泡（Sonazoid@，GE Healthcare，Os-lo，Norway）用于超聲造影和空化治療。舒尼替尼（SU11248，Selleckchem），抗CD31（ 1 ： 2 0 0 ，GB113151，Servicebio），抗 -SMA（1：200，GB13044，Servicebio），抗VEGF（ 1 ： 2 0 0 ，GB13034，Servicebio），抗eNOS（1：200，GB12086，Servicebio），Cy3標記的山羊抗兔IgG（1：300，GB21303，Servicebio），AlexaFluor488標記的山羊抗小鼠IgG（1：400，GB25301，Servicebio），AlexaFluor 488標記的山羊抗兔 I g G（ 1 ： 4 0 0 ，GB25303，Ser-vicebio），HRP標記山羊抗小鼠（ 1 ： 2 0 0 ，GB23301，Servicebio），NO檢測試劑盒（Meimian，江蘇），Tunel試劑盒（G1501，Servicebio）。

1. 1.3 儀器

飛依諾VINNO70型彩色多普勒超聲診斷儀（蘇州飛依諾科技有限公司），配備X4-12L高頻線陣探頭（頻率 4 ～ 1 2 M H z 及Vflash空化調控功能。Vflash功能可通過調節聲學參數輻照腫瘤區域進行超聲治療。VINNO70還配備超聲造影定量分析軟件（Contrastburst imaging，CBI），可根據造影圖像中微泡亮度射頻信號繪制時間-強度曲線（Timeinten-sitycurve，TIC），從該曲線上可獲得超聲造影峰值強度（Peakintensity，PI）和曲線下面積（Areaundercurve，AUC）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

將荷瘤小鼠隨機分為4組，分別為對照組（24只，不進行任何治療）、USMC組（24只，僅采用USMC治療）、SU組（24只，僅采用SU治療）和U S M C+ S U 組（24只，USMC聯合SU治療）。SU重懸于檸檬酸鹽緩沖液 （ .p H3 . 5 于接種 7 8 6 - 0 細胞后第8天開始，通過口服管飼法每天以 給藥，持續2周，USMC治療在每次給藥后第 進行。根據舒尼替尼的藥代動力學特點，口服灌胃給藥后約 達到最大血藥濃度，我們選擇此時進行USMC治療，以期得到最大的腫瘤藥物滲透濃度[10]

1. 2.2 超聲治療

采用 1 . 2 % 三溴乙醇 腹腔注射麻醉裸鼠，使之仰臥固定于操作臺上，建立尾靜脈通道。將全氟丁烷微球（Sonazoid，GE公司）用 4 m L 無菌生理鹽水復溶，配制成微球溶液，振勻后微球的平均粒徑為 2 . 1 μ m ，濃度為 。首先對腫瘤進行空化治療前造影，經尾靜脈團注 配制好的微球溶液進行治療前造影，隨即跟注0.2 無菌生理鹽水沖管，并存儲60s動態造影圖像。待造影劑基本廓清后，切換至Vflash空化治療模式：超聲換能器置于距腫瘤表面 處，同時抽吸 配置好的Sonazoid溶液，用無菌生理鹽水稀釋至 作為空化核， 1 0 m i n 內經尾靜脈緩慢勻速推入 。并在空化治療結束后再次進行超聲造影，并存儲 6 0 s 動態造影圖像。課題組前期在786-0人腎透明細胞癌腫瘤模型中優化了聲學參數以達到更強更穩定的血流增強效應。本研究中空化治療我們采用已優化的參數：中心頻率 4 M H z ，每個脈沖長度18個周期，機械指數0.27（峰值負壓約 0 . 5 4 M P a ），脈沖重復頻率 ，脈沖/間歇時間 1 . 0 s/ 1 . 0 s ，USMC治療時間 。

1.2.3超聲造影定量分析

超聲造影定量分析采用超聲診療一體機VINNO70機載分析軟件，分別于治療前及治療后3 0 m i n 選取腫瘤造影圖像上相同的切面，勾畫整個腫瘤邊界為感興趣區，生成TIC并獲得PI及AUC。

1.2.4腫瘤血流灌注面積

于超聲造影圖像中選取治療前、后腫瘤最大切面圖，應用ImageJ軟件手動勾畫腫瘤灌注區域和無灌注區域。計算腫瘤灌注百分比：腫瘤灌注區面積/腫瘤面積 × 1 0 0 % 。

1.2.5腫瘤生長及小鼠生存期觀測

荷瘤完成后，每2d應用二維超聲測量腫瘤長徑（L）及寬徑（W），計算腫瘤體積（ 并繪制小鼠腫瘤生長曲線。觀察每組剩余小鼠生存期，記錄死亡時間并繪制生存曲線，至 7 0 d 或期間小鼠腫瘤體積超過 時處死荷瘤小鼠。

1.2.6 免疫熒光分析

每組隨機選取6只小鼠處死，取完整腫瘤組織，置于 4 % 多聚甲醛固定，制作石蠟片。切片經脫水、抗原修復、BSA 血清封閉 3 0 m i n 后；一抗 CD31、VEGF和 α - SMA和在 4 % 下孵育過夜。采用Cy3標記的山羊抗兔 I g G 、AlexaFluor488標記的山羊抗小鼠IgG和AlexaFluor488標記的山羊抗兔 I g G 分別作為CD31、VEGF和 α - SMA的二抗順序加入孵育 ，DAPI復染細胞核。最后，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，使用Image-ProPlus6.0軟件分析。內皮細胞（CD31）上周細胞覆蓋度（ 的增加表明血管（VN）正常化。在本實驗中用CD31標記。CD31、VEGF和 α-S M A 均采用積分光密度（Integratedopticaldensity，IOD）測量。

1.2.7 免疫組化分析

處死小鼠，取完整腫瘤組織，置于 4 % 多聚甲醛固定，制作石蠟片。切片經脫水、抗原修復、BSA血清封閉 3 0 m i n 后；順序加入一抗內皮型一氧化氮合酶（ 孵育過夜，二抗HRP標記山羊抗小鼠室溫孵育 5 0 m i n ，DAB顯色，蘇木素復染細胞核。最后，顯微鏡鏡檢并采集圖像，使用Image-ProPlus6.0軟件分析IOD。

1.2.8 TUNEL染色檢測細胞凋亡

TUNEL染色采用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（Roche，Germany）評估各組治療后腫瘤細胞凋亡情況。

1.2.9酶聯免疫吸附測定（Enzymelinkedimmu-nosorbentassay，ELISA）方法

每組隨機選取6只小鼠處死，取完整腫瘤組織，經組織勻漿、蛋白裂解 1 5 m i n 后離心、收集組織上清液。樣本按照NO的ELISA試劑盒操作步驟測定并分析。

1.2.10 液相色譜-質譜聯用法檢測藥物濃度

每組隨機選取6只小鼠處死，取完整腫瘤組織。配制標準品溶液，稱取一定量的舒尼替尼樣本，加入1 m L 純甲醇，加入氧化鋯研磨珠研磨 1 0 m i n ，在 條件下以 離心 后，再以0 . 2 2 u m 濾膜過濾，取濾液稀釋20倍上機分析。舒尼替尼的色譜圖采集和積分應用軟件Xcalibur3.0（Thermo）進行處理。

1. 2.11 統計學分析

采用SPSS25.0和GraphPadPrism8.0軟件分析數據。分析結果統一用均數 ± 標準差 表示滿足正態分布的計量資料。采用單因素重復測量方差分析，判斷不同治療組對786-0腫瘤的血流灌注的影響，并采用Turkey法進行兩兩比較。以 P lt; 0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 USMC增加腫瘤血流灌注

超聲造影結果顯示，與治療前相比，USMC治療后腫瘤灌注區域明顯增加（圖1）。治療后USMC組及 U S M C+ S U 組的PI值相比治療前升高，且差異均具有統計學意義（ t = 2 1 . 1 3 4 ， P lt; 0 . 0 0 0 ; t = 1 5 . 3 0 8 ，P lt; 0 . 0 0 0： （表1）。同時，2組的AUC值也顯著升高（ t = 2 3 . 3 5 3 ， P lt; 0 . 0 0 0 ; t = 1 2 . 2 4 0 ， P lt; 0 . 0 0 0 ） （表1）。

2.2 USMC聯合SU抑制腫瘤進展

在各組腫瘤的二維超聲圖中勾勒各組腫瘤邊界，觀察腫瘤體積變化。結果顯示，實驗期間（8d至24d）各組腫瘤體積均增長，但增長速度存在差異（圖2A）。其中， U S M C+ S U 聯合治療組腫瘤體積增長相比其他3組更緩慢（圖2A）。

在第24天，比較各組腫瘤體積差異，結果顯示聯合治療組顯著小于SU組（ P = 0 . 0 0 8 ）、USMC組（ P = 0 . 0 0 5 ）及對照組（ P=0 . 0 0 1 ）（圖2B）。

觀察各組剩余小鼠（每組剩余6只）的生存期，Ka-plan-Meir生存曲線分析結果顯示，聯合治療組小鼠70d的生存率達 5 0 % ，顯著高于SU單藥組（ P = 0 . 0 0 2 ）、USMC組（ P=0 . 0 0 2 及對照組（ P=0 . 0 0 7 Ω （圖3）。

2.3聯合治療改善腫瘤微環境，促進藥物滲透2.3.1聯合治療改善腫瘤血管功能

圖4A顯示了eNOS免疫組化染色結果。進一步統計分析顯示，聯合治療組中內皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達（ 7 4 8 6 . 5 ± 1 2 5 5 . 1 7 ） 較SU組（ ）及對照組（ 3 6 7 7 . 8 3 ± 8 1 6 . 2 5 顯著增加（ ），與USMC組1 7 5 1 1 . 5±1 4 0 0 . 7 9 無顯著差異（ （圖4B）。

ELISA結果顯示，聯合治療組中腫瘤NO含量（12.32+ 1 . 5 3 顯著高于對照組（ 8 . 4 4 ± 0 . 8 6 及SU治療組（ ）（ P = 0 . 0 0 0 6 6 3 ： ），而與USMC組（ 1 2 . 0 1 ± 2 . 1 5 ）的差異在統計學意義上不顯著（ （圖4C）。

組織免疫熒光染色顯示，聯合治療組相比其他組呈現出最好的血管成熟形態。

統計分析結果表明：（1）聯合治療組CD31的IOD值與SU組、USMC組和對照組的組間差異具有統計學意義（ F = 1 4 8 . 7 9 ， Plt;0 . 0 0 0 ，兩兩比較結果說明聯合治療組CD31的IOD值（ 3 7 2 5 . 4 8 ± 105.49）低于SU組（ 4 6 4 8 . 3 2 ± 3 9 0 . 8 5 ）、USMC組1 8 0 2 3 . 3 3 ± 5 8 2 . 1 6 ）和對照組（ 8 1 6 7 . 5 8 ± 5 8 4 . 8 7 . ）

（ P lt; 0 . 0 1： ；（2）VEGF統計分析結果顯示，聯合治療組該指標IOD值與SU組、USMC組和對照組的組間差異具有統計學意義（ F = 6 2 . 7 4 ， Plt;0 . 0 0 0 ） 兩兩比較結果顯示聯合治療組VEGF的IOD值（ 5 4 3 0 . 1 9 ± 3 9 7 . 6 8 ）低于SU組（ 7 1 6 0 . 4 4 ± 334.52）、USMC組（ 9 1 9 9 . 7 ± 4 3 4 . 0 9 ）和對照組（13 ）（ P lt; 0 . 0 5 ）；（3）聯合治療組周細胞（ α-S M A ）覆蓋率較SU組、USMC組及對照組的組間差異具有統計學意義（ F = 3 1 2 . 1 2 ， P lt; 0.000），且兩兩比較結果表明，聯合治療組的周細胞覆蓋率（ 7 1 . 7 ± 3 . 8 8 ）高于SU組（ 1 8 . 1 3 ± 3.72）USMC組（ 和對照組（ 1 7 . 9 7 ± 2.98）（ ）（圖5）。

2.3.2聯合治療促進腫瘤細胞凋亡

TUNEL染色評估腫瘤細胞凋亡表明，聯合治療組中腫瘤細胞凋亡百分比（ 3 0 . 3 7±3 . 1 4 ? 較SU治療組（ 2 0 . 0 8 ± 3 . 3 1 ）和對照組（ 5 . 8 2 ± 0 . 5 0 顯著增加（ ： P lt; 0 . 0 0 0 ），而USMC組（ 6 . 0 3 ± 1.51）與對照組 （ 5 . 8 2 ± 0 . 5 0 ）相比腫瘤細胞凋亡百分比無顯著差異（ （圖6）。

2.3.3聯合治療促進藥物滲透

治療結束后，聯合治療組腫瘤內SU濃度均值為 、單純藥物治療組腫瘤內 SU 濃度均值為 ，聯合治療組腫瘤內SU濃度是單純藥物治療組的1.6倍，且差異具有統計學意義（ P lt; 0 . 0 0 0： （圖7）。

3 討論

近年， c c R C C 治療的重大突破是引入了抗血管生成療法作為一線治療方案。盡管該療法在ccRCC的臨床管理方面取得重大進展，但其治療反應率卻有限[1]。臨床數據顯示，抗血管生成治療僅使一部分ccRCC患者從中獲益，大多患者短期內便出現治療耐藥[12]。而腫瘤灌注不足導致的藥物滲透受限是耐藥產生重要原因。本研究利用超聲血流增強效應聯合抗血管生成藥物SU治療腎透明細胞癌小鼠，明顯抑制了腫瘤進展，延長了小鼠生存期。

VEGF在多數實體瘤中過表達，這導致腫瘤血管系統高度異常，表現為不成熟的新生血管扭曲、滲漏，基底膜不完整以及周細胞覆蓋缺失[13]。因此，實體瘤總是會形成低灌注區域，該區域位于灌注和壞死之間[14]。而腫瘤內低灌注或低血管化是造成腫瘤缺氧微環境及藥物滲透不足的主要原因[15]另外，在抗血管生成治療過程中，腫瘤內毛細血管可能變得無功能或密度減小，這也將導致位于毛細血管遠端的腫瘤細胞藥物遞送受限[16]。由此可見，增加腫瘤乏血供區域的血流灌注、改善缺氧的策略可能有助于優化藥物在瘤內分布。研究發現，微泡在細胞或血管附近的空化作用會對組織或周圍微環境產生多種生物效應，顯著影響腫瘤微環境，并介導治療效果。因此微泡與超聲相結合已被證明是增強癌癥治療的一種新的有前途的策略[17]。本課題組前期研究表明低強度超聲刺激微泡空化（USMB）可增強腫瘤乏血供區域灌注，進而增強化療及免疫治療。

本研究中USMC治療結束后，腫瘤灌注面積及灌注強度較對照組顯著增加。組織學顯示，內皮型一氧化氮合酶（eNOS）及內皮源性一氧化氮（NO）也較對照組顯著增加。這可能是由于低強度超聲刺激微泡發生穩態空化，微泡輕微震蕩、交替循環的收縮和舒張產生瞬時高溫高壓、微射流等機械力及剪切力，這些作用于血管內皮細胞，激活eNOS并促進內皮源性NO釋放。進而引起血管擴張，血流灌注增加，這可能使得腫瘤攝氧增加，緩解微環境缺氧。

VEGF在腫瘤血管生成中起著至關重要的作用，適度下調VEGF可修復血管系統回復到“正常”狀態，重塑有利的腫瘤微環境并促進藥物遞送，以協同其他抗癌療法[18-20]。有研究顯示，腫瘤灌注增強是血管正常化發生的潛在生物標志物，其通過下調VEGF可促進血管正常化[21]。本實驗免疫熒光染色結果顯示，USMC治療后VEGF表達較對照組降低，而內皮細胞（CD31）上的周細胞（ α - S M A ）覆蓋率較對照組顯著增加。這表明在實驗參數下USMC治療可能通過增加腫瘤灌注誘導了血管正常化的發生。同時，聯合治療組比USMC治療組更有效地下調了VEGF的表達，增加了周細胞覆蓋率，促進了血管正常化。

近來有研究表明，藥物滲透不足是腫瘤抗血管生成治療抵抗的重要原因，尤其藥物的瘤內分布是決定治療效果的關鍵[22]。我們在治療結束后采用質譜法檢測腫瘤內藥物濃度，發現聯合治療組腫瘤組織SU濃度是單藥組的1.6倍。這說明聯合治療組通過USMC增加腫瘤灌注及誘導血管正常化在一定程度上改善了藥物輸送。另外，Stylianopoulos等研究顯示，通過誘導血管系統正常化可增加腫瘤對抗血管生成藥物的敏感性[23]。本研究發現，聯合治療比單獨使用USMC或SU更好地抑制腫瘤生長、促進腫瘤細胞凋亡。而處于穩態空化的USMC組只干擾了血管壁，未能顯著抑制腫瘤進展。生存分析結果也顯示，聯合治療組小鼠獲得了最長的生存期。以上表明聯合療法通過改善腫瘤微環境提高了藥物滲透，并可能在一定程度上克服治療抵抗，進而提高了抗腫瘤療效。另外，超聲聯合微泡干預通過USMC增強血流灌注增強效應可能促進T細胞浸潤，缺氧改善可能促進腫瘤巨噬細胞極化為免疫刺激性M1樣表型，這些對腫瘤免疫微環境也能起到正向調控作用。聯合干預手段在腫瘤治療中展現出巨大臨床應用前景，可能為ccRCC患者的創新治療策略開辟道路。

本研究存在的局限性：空化作用是復雜的，我們沒有測試更多參數，不同的聲學參數組合，包括微氣泡濃度等，都可能會極大地影響治療效果。本研究只關注了與灌注增加及與血管正常化相關的幾個主要因子，其他與血流相關的微血管改變以及可能與空化作用有關的腫瘤微環境改變有待進一步研究。此外，緩解缺氧作為腫瘤微環境調控的重要因素，本研究缺少其直接結果來證實腫瘤缺氧微環境的改善。

綜上所述，超聲激勵微泡增強灌注效應促進了SU的抗腫瘤療效。療效的促進是基于聯合治療對腫瘤微環境的改善，包括誘導腫瘤血管修復正常化、增加藥物滲透，同時，聯合治療還可能緩解腫瘤缺氧。因此，超聲增強腫瘤灌注可作為一種增效腫瘤抗血管生成治療的超聲新方法。而且，在我們的研究中，診斷超聲系統與空化治療調制功能相結合，超聲成像可以同時監測治療過程，并且以市售的微泡為空化核，克服了載藥微泡載藥量低、開發時間長、費用高的挑戰，有利于向臨床轉化。

參考文獻（References）

[1] MENDEZVIDALMJ，LAZAROQUINTELAM，LAINEZ-MILAGRO N， et al. SEOM SOGUG clinical guidelinefor treatment ofkidney cancer[J].Clin Transl Oncol，2023，25（9）：2732-2748.

[2] KRALJECICM，MARIJANOVICI，BUHOVACT，et al.Prognostic and predictive significance of VEGF， CD31，and Ang-1 in patients with metastatic clear cell renal cell carcinoma treated with first-line SU[J].Biomol Biomed，2023，23（1）：161-169.

[3] STERNBERGCN，DAVISID，MARDIAKJ，etal. Hawkins.Pazopanib in locally advancedormetastaticrenal cell carcinoma：Results of a randomized phase III trial[J]. J Clin Oncol，2010，28：1061-1068.

[4]MOTZER RJ，RINIBI，BUKOWSKIR M，et al．SU in patients with metastatic renal cellcarcinoma[J]. JAMA，2006，295：2516-2524.

[5]TOROK S，REZELI M，DOME B，et al. Limited tumor tissue drug penetration contributesto primary resistance against angiogenesis inhibitors[J].Theranostics，2017， 7（2）： 400-412.

[6]LIU Z，ZHAO Q，ZHENG Z，et al. Vascular normalization in immunotherapy： a promising mechanismcombined with radiotherapy［J].Biomed Pharmacother， 2021，139（1）：111607.

[7]LI N，TANG J，YANG J，et al.Tumor perfusion enhancement by ultrasound stimulated microbubblespotentiates PD-L1 blockade of MC38 colon cancer in mice [J]．Cancer Letters，2021，498：121-129.

[8]LUO TT，ZHANGY，LIU Z，et al.Optimal treatment occasion for ultrasound stimulated microbubblesin promoting gemcitabine delivery to VX2 tumors[J].Drug Deliv，2022，29（1） ：2796-2804.

[9]TANG N，TANG J，LIU Z，et al. Sononeoperfusion：a new therapeutic effect to enhance tumor bloodperfusion using diagnostic ultrasound’and microbubbles[J]. Cancer Imaging，2023，23：29.

［10］王玉浩，張雪，周小庭，等．舒尼替尼和雷米普利聯合 用藥在大鼠體內的藥代動力學相互作用[J].中國藥 科大學學報，2017，48（1）：60-65. WANG YH， ZHANG X， ZHOU X T，et al.Pharmacokinetic interaction between sunitinib and Ramipril in rats [J]．Journal of China Pharmaceutical University， 2017，48（1） ：60-65.

[11]ATKINS M B，TANNIR N M. Current and emerging therapies for first-line treatment of metastatic clear cel renal cell carcinoma[J].Cancer Treat Rev，2O18，70： 127-137.

[12]CHENY W，WANG L，PANIAN J，et al.Treatment landscape of renal cell carcinoma[J]. CurrTreat OptionOncol，2023，19（3） ：2276629.

[13]SCHAAF M B，GARG A D，AGOSTINIS P，et al. Defining the role of the tumor vasculature inantitumor immunity and immunotherapy[J].Cell Death Dis，2018， 9115.

[14]JING X，YANG F， SHAO C，et al. Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumormicroenvironment [J]．Mol Cancer，2019，18（1）：157.

[15]FILIPCZAK N， JOSHI U，ATTIA S A，et al. Hypoxia sensitive drug delivery to tumors[J]. J Control Release， 2022，341：431-442.

[16] TOROKS，REZELIM，KELEMENO，etal.Limited tumor tissue drug penetration contributes to primary resistance against angiogenesis inhibitors[J].Theranostics，2017，7（2）：400-412.

[17] SHARMA D，LEONG K X，CZARNOTA G J. Applicationofultrasound combinedwith micro-bubblesforcancertherapy[J].IntJMol Sci，2022，23（8）：4393.

[18] ABOUKHOUZAMR，BRODACZEWSKAK，FILIAK A，etal.Tumor hypoxia regulatesimmune escape/invasion：Influence on angiogenesis and potential impact of hypoxic biomarkerson cancertherapies[J].Front Immunol，2020，11：613114.

[19] ARJAANSM，SCHRODERC P，DAFNIU，etal. VEGF pathway targeting agents，vessel normaliza-tion and tumor druguptake：from bench to bedside[J].Oncotarget，2016，7：21247-21258.

[20] LIANGQ，ZHOU L，LI Y，et al. Nano drug delivery system reconstruct tumour vasculature for thetumour vascular normalisation［J].Journal of Drug Targeting， 2022，30（2）：119-130.

[21] HOYJ，CHUSW，LIAOEC，etal.Normalizationof tumorvasculature by oxygen microbubbles withultrasound[J].Theranostics，2019，9（24）：7370-7383.

[22] TOROKS，REZELIM，KELEMENO，etal.Limited tumor tissue drug penetration contributes to primary resistance against angiogenesis inhibitors[J].Theranostics，2017，7（2）：400-412.

[23] STYLIANOPOULOS T， JAIN R K. Combining two strategiesto improve perfusion and drug delivery in solid tumors[J].Proceedings of theNational Academy ofSciences，2013，110（46）：18632-18637.

（責任編輯：唐慧）