響應面法優化羊奶果多酚提取工藝研究

Optimisation of Polyphenol Extraction from Elaeagnus Conferta Roxb. by Response Surface Methodology

XIA Xuefen12， YANG Yilu12， TIAN Sumei1，YANG Lanfen12，DONG Shibin1 （1.DehongNormal University， Mangshi 67840o， China; 2.Dehong Biomedical Engineering Research Centre， Mangshi 678400， China）

Abstract： Using Elaeagnus conferta Roxb.as the raw material and polyphenol yield as the evaluation index， the response surface methodology was used to optimize the polyphenol extraction process of Elaeagnus conferta Roxb. based nsingle factor experiments.By analyzing the effects ofmaterial to liquid ratio，extraction temperature，ethanol volume fraction，and extraction time on polyphenol yield，the optimal extraction process parameters were determined to be a material to liquid ratio of 1：37（g：mL） ， extraction temperature of 80^°C ，ethanol volume fraction of 72% and extraction time of 53min . Under these optimized conditions， the polyphenol yield of Elaeagnus conferta Roxb. can reach 15.3679% ：

Keywords： Elaeagnus conferta Roxb. polyphenols; response surface; extraction process

羊奶果（ElaeagnusconfertaRoxb.），又稱南胡頹子或密花胡頹子，屬于胡頹子科胡頹子屬，是一種多年生常綠蔓狀灌木。該植物多生長在熱帶雨林，廣泛見于越南、馬來西亞、印度等地，在我國則主要分布于廣西南部以及云南的西雙版納、德宏等區域[。羊奶果不僅口感良好，還具有較高的食用價值，富含維生素、果膠、還原糖及氨基酸等多種有益成分[2]。相關研究表明，羊奶果成熟果實中富含多酚類物質、 β- 胡蘿卜素和番茄紅素[3]。多酚類化合物作為植物次生代謝產物，廣泛存在于植物的各個器官中，包括花、果實、漿果、根、莖和葉[4。從食源性物質中提取的多酚具有較好的抗氧化、抗炎[5]和抗菌性能[，同時展現出抗肥胖、抗腫瘤和抗肝毒活性的功效[7]。本研究采用超聲輔助提取法，探究不同因素對羊奶果成熟果實中多酚得率的影響，并基于單因素試驗結果設計Box-Behnken響應面模型，以優選羊奶果多酚的最佳提取工藝。通過Box-Behnken模型試驗數據，獲得羊奶果多酚的最佳得率，為羊奶果多酚的進一步開發與利用提供參考依據。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

羊奶果，市售；福林酚（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；無水碳酸鈉（分析純），西隴科學股份有限公司；無水乙醇（分析純），西隴科學股份有限公司；濃鹽酸（分析純），山西潞安焦化有限責任公司；氫氧化鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

UPR-11-10T優普系列超純水機，四川優普超純科技有限公司；紫外可見分光光度儀，日本島津；KQ-500DE數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；GM-0.33A隔膜真空泵，天津市津騰實驗設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1羊奶果多酚提取工藝流程與操作要點

羊奶果分類 $$ 挑選 $$ 清洗 $$ 打漿均質 $$ 加乙醇溶液 $$ 超聲提取 $$ 離心分離 $$ 定容 $$ 測定 $$ 計算羊奶果多酚得率。

精準稱取 2g 的羊奶果果漿，將其置于 200mL 燒杯中。依據預先設定的料液比，向燒杯中加入相應體積比例的乙醇溶液。隨后，使用保鮮膜密封燒杯口，并將燒杯置于超聲恒溫環境中，按照預設參數進行提取操作。提取完成后，將所得提取液轉移至離心機中，以 3000r?min^-1 離心 10min 。離心后，取上清液定容后，進行測定，計算羊奶果多酚得率。

1.3.2 單因素試驗

（1）料液比對羊奶果多酚得率的影響。稱取羊奶果果漿 2g ，固定乙醇體積分數 60% 、提取溫度80^°C 、提取時間 40min ，考察料液比（ ）分別為 1：10，1：20，1：30，1：40，1：50 對羊奶果多酚得率的影響。

（2）乙醇體積分數對羊奶果多酚得率的影響。稱取羊奶果果漿 2g ，固定料液比 1：40（g：mL ）、提取溫度 80^°C 、提取時間 40min ，考察體積分數分別為 20% 、 40% 、 60% 、 80% 和 100% 對羊奶果多酚得率的影響。

（3）溫度對羊奶果多酚得率的影響。稱取羊奶果果漿 2g ，固定乙醇體積分數 60% 、料液比1：40（Ωg：mL ）、提取時間 40min ，考察提取溫度分別為50、60、70、 80^°C 和 90^°C 對羊奶果多酚得率的影響。

（4）提取時間對羊奶果多酚得率的影響。稱取羊奶果果漿 2g ，固定乙醇體積分數 60% 、料液比 1： 2 10（g：mL ）、提取溫度 80^°C ，考察提取時間分別為20、30、40、 50min 和 60min 對羊奶果多酚得率的影響。

1.3.3 響應面優化試驗

以單因素試驗結果為基礎，選擇料液比（A）、乙醇體積分數 （B） 、提取溫度 （C） 和提取時間（ |D| ）為考察因素，以多酚得率為響應值，開展響應面分析。響應面試驗因素與水平見表1。

1.3.4多酚標準曲線繪制

在多酚含量測定過程中，采用福林酚法，并以沒食子酸作為標準物質。具體操作步驟為用移液槍精準量取0、0.2、0.4、0.6、 1.0mL 和 1.5mL 的沒食子酸標準儲備液，分別置于 10mL 容量瓶中，接著使用體積分數為 60% 的乙醇溶液對各容量瓶進行定容處理，制備系列沒食子酸工作液。隨后，從上述裝有不同濃度工作液的容量瓶中各取 1.0mL ，轉移至 10mL 比色管中。并依次加入 2.5mL 福林酚試劑，充分振蕩搖勻后，再加入 2.5mL15%Na₂CO₃ 溶液，最后加水定容至刻度線，并再次充分搖勻。將比色管置于 40^°C 水浴環境中反應 60min ，取出后在室溫下靜置 20min 使其冷卻。從而配制成濃度分別為0、4、8、12、 20mg^.L^-1 和 30mg^.L^-1 的標準系列溶液。采用分光光度法對上述溶液逐一進行檢測，設定儀器波長為 778nm ，記錄各溶液對應的吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標 ），吸光度為縱坐標（y） ，繪制沒食子酸標準曲線，最終得到回歸方程為y=0.04 1x+0.034 8 ，相關系數 R²=0.9953 。

1.3.5羊奶果多酚得率的測定

按照1.3.1提取工藝流程操作，取定容后的羊奶果上清液，用蒸餾水稀釋100倍，于 778nm 波長處測定吸光度，并根據公式（1）計算羊奶果多酚得率。

羊奶果多酚得率

式中： C 表示通過標準曲線法得到的樣品提取液中多酚濃度， mg?mL^-1 ； V 表示樣品提取液的總體積，mL；100表示稀釋倍數； M 表示羊奶果樣品質量，g。

1.4數據處理

每組試驗均重復3次，結果用平均值表示。使用Office2019對數據進行處理，采用Design-ExpertV8.0.6.1軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1單因素試驗結果與分析

2.1.1 料液比對羊奶果多酚得率的影響

由圖1可知，隨著溶劑的增加，羊奶果多酚得率呈現先升高后降低的趨勢，當料液比為1：40（Ωg：mL ）時，羊奶果多酚得率最高，這可能是由于增加溶劑后，溶劑滲透率提高。然而，在料液比為 1：50（g：mL 時，多酚得率逐漸下降，原因可能是一定比例的溶劑已將有效成分完全溶出，而過量的溶劑會導致細胞膜阻滯作用增強，同時使更多雜質溶解，進而影響多酚的提取率。因此，本試驗中最佳料液比確定為 1：40（g：mL ）

2.1.2乙醇體積分數對羊奶果多酚得率的影響

由圖2可知，隨著乙醇體積分數的增加，羊奶果多酚得率呈現先升高后降低的趨勢。當乙醇體積分數為 60% 時，多酚得率達到最高值，這表明 60% 乙醇能明顯提高多酚提取率，可能原因在于此時多酚的擴散能力和溶解速率達到了最優狀態。然而，隨著乙醇體積分數的進一步升高，多酚得率逐漸下降，這可能是由于乙醇濃度過高時會導致一些非酚類化合物大量溶出，同時部分醇不溶物在高乙醇濃度條件下發生沉淀。此外，試驗結果顯示，當乙醇體積分數約為 60% 時，更有利于非水溶性和水溶性多酚的溶出。因此，綜合考慮以上因素，本試驗中最佳乙醇體積分數確定為 60% ○

2.1.3提取溫度對羊奶果多酚得率的影響

由圖3可知，當提取溫度在 50～80^°C 時，羊奶果多酚得率呈現持續上升的趨勢，這可能是因為在較高溫度下，多酚能夠更充分地溶解于溶劑中。當提取溫度超過 80^°C 時，多酚得率趨于穩定，并略有下降，這可能是由于過高的提取溫度導致多酚發生氧化降解或結構破壞，從而降低了多酚得率。因此，經綜合考慮，本試驗最佳提取溫度確定為 80^gC O

2.1.4提取時間對羊奶果多酚得率的影響

由圖4可知，隨著提取時間的增加，羊奶果多酚得率呈現上升趨勢。這可能是因為延長提取時間增加了羊奶果果肉與溶劑之間的接觸時間，從而促進了多酚物質從果肉向溶液中的擴散。結合實際操作中的工作效率考量，過長的提取時間并不利于實際應用。因此，本試驗中最佳提取時間確定為 50min 。

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 模型的建立與分析

以料液比（A）、乙醇體積分數（ ）、提取溫度（C）、提取時間 （D） 為考察因素，以多酚得率（Y）作為響應值，采用Design-ExpertV8.0.6.1軟件中的Box-Behnken模型展開響應面試驗設計。試驗設計與結果數據見表2。對表2數據進行回歸分析，得到二次回歸方程為 Y=15.73-1.58A+2.19B+0.78C+0.96D- 0.54AB+0.08AC-0.55AD-0.51BC+0.34BD+1.24CD- 1.78A²-2.11B²-1.46C²-0.95D² （2

為檢驗回歸方程的有效性，進一步確定各因素對多酚提取率的影響程度，使用Design-Expert8.0.6.1軟件對數據進行方差分析，結果見表3。回歸模型F=9.93 ， Plt;0.000 1 ，表明該模型在相應試驗條件下具有極顯著效果。相關系數 R²=0.9026 ，說明該模型的擬合度相對較高，試驗結果與預測值之間具有較高的相關性，且該模型能夠解釋和預測試驗結果中 98% 以上的變異。失擬項 F=0.99，P=0.5544gt;0.05 ，表明模型中不存在顯著誤差，試驗設計可靠。通過F 值和 P 值的分析可知，羊奶果多酚提取率受到各工藝條件的顯著影響，其影響作用大小順序為 Bgt; Agt;Dgt;C 。此外，響應值與各項工藝條件之間并非簡單的線性關系。具體而言，料液比的一次項、乙醇體積分數的一次項、料液比的二次項、乙醇體積分數的二次項以及提取溫度的二次項對響應值具有極顯著影響；提取時間的一次項和提取溫度的一次項對響應值具有顯著影響。

2.2.2 驗證試驗結果

根據響應面回歸模型預測，得到羊奶果多酚最佳提取條件為料液比 1：37.3264（g：mL ）、乙醇體積分數 71.5076% 、提取溫度 79.0786°C 以及提取時間 52.6654min ，在此提取條件下，預測羊奶果多酚得率為 16.7543% 。為了便于實際操作，將參數調整為料液比為 ）、乙醇體積分數72% 、提取溫度 80^°C 以及提取時間 53min ，基于上述條件進行3次平行試驗，結果顯示，羊奶果多酚的實際得率為 15.3679% ，與理論值十分接近。這表明為優化羊奶果多酚提取工藝而建立的數學模型具有實用性和可靠性，可為后續研究提供重要參考依據。

3結論

本研究通過單因素試驗結合Box-Behnken響應面法進行羊奶果多酚的提取工藝優化，確定最佳提取工藝參數為液料比 ），提取溫度80^°C ，乙醇體積分數 72% ，提取時間 53min 。在該條件下進行提取操作，羊奶果多酚得率可達 15.3679% 。該研究成果為羊奶果多酚的后續提取工藝改進及相關產品的開發與利用提供了重要的理論依據

參考文獻

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