衡陽市煙草靶斑病病原菌的分離鑒定

引用格式：，等.衡陽市煙草靶斑病病原菌的分離鑒定[J].湖南農業科學，2025（5）：63-66.DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2025.005.012

中圖分類號：S432.1；S435.72 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2025）05-0063-04

Abstract：ToidentifythepathogencausingtobaccotargetspotinHenyangCitythisstudyemployedthetissueseparationmethodto isolatethepathogenfromthetypicaldiseasedtobaccoleavesinthisrgion.Thepathogenicityof teisolatewasvalidatedaccodingto Koch's postulate.Teisolatewasthenidentifedbasedonthecolonymorphologymicroscopicfeaturesofhyphae，andISsunce. TheresultsshowedthattheisolateybapresentedthetypicalmorphologicalfeaturesofRizoctoniasoanianditproducednopore butsclerotia.Thehyphae wereiitiallycolorlessandbcamelightbrowntoyellowbrownatmaturitywithsepta.TheISsqunce similaritybetweentheisolateandR.solani AG-3（HQ241274.1）washigh.Theconstructedphylogenetictreeshowcasedthatyba sharedthesamecladewithR.solaniAG-3（HQ241274.1）.Therefore，thepathogencausingtobaccotargetspotwasidentifedR.solani AG-3.

Key words：target spot; Rhizoctonia solani AG-3; isolation and identification; Hengyang

煙草（NicotianatabacumL.）是原產于南美洲的茄科（Solanaceae）煙草屬（Nicotiana）一年生或有限多年生草本植物[1]，現已成為世界范圍內廣泛栽培的重要經濟作物，在我國南北地區均有種植，具有較高的經濟價值和潛在的藥用價值[2-3]。然而，當前煙草種植模式單一，且過度依賴化肥和農藥，導致土壤微生態失衡和病原菌大量積累，同時還降低了植株的抗病性，使得煙草病害頻發。目前已知的全球煙草病害達百余種，其中已明確的侵染性病害約60種，危害嚴重的有近20種[46]。真菌病害是煙草的主要病害類型，占我國煙草侵染性病害種類的一半左右[7-8]。在煙草真菌病害中，靶斑病的危害尤為突出，其傳播速度快且侵染性強，發生嚴重時葉片上多個病斑融合致使葉片穿孔破裂，帶來煙葉品質降低及產量下降等問題，使煙農遭受不同程度的經濟損失。

煙草靶斑病最早于1948年在巴西被發現[9]，該病害 2005年在遼寧省丹東煙區首次發生[10-11]，隨后陸續在吉林、黑龍江、云南、四川、湖北和廣西等地被發現[12-15]。2020年，肖艷松等[在湖南省郴州、永州、湘西和常德煙區發現一種嚴重的葉部病害，經鑒定為煙草靶斑病。近年來，湖南省衡陽市煙草產區也深受靶斑病的影響，而針對湖南衡陽市發現的煙草靶斑病進行病原菌鑒定的公開報道較少。因此，本研究以衡陽市煙草產區葉片病樣為試材，對病原菌進行分離鑒定，以期為該病害的診斷、防治

和預測提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以衡陽市煙草產區采集的煙葉病樣為供試材料。供試培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基：馬鈴薯 200g 葡萄糖 20g 瓊脂 15～20g 蒸餾水 1L 。儀器設備包括高壓蒸汽滅菌鍋（ 120^°C ， 25min ）超凈臺、滅菌鑷子和剪刀等。

1.2 試驗方法

1.2.1病原菌分離純化在供試材料病健交界部剪取 5mm×5mm 的葉片組織，使用 75% 乙醇消毒30 s后，放入 2% 次氯酸鈉溶液中浸泡 1min ，最后以無菌水沖洗3遍并用滅菌濾紙吸去殘留水分。將消毒處理后的葉片組織接種于PDA培養基上，于 28°C 恒溫箱中暗培養5d；待長出菌落后用無菌牙簽從菌落邊沿取少量菌絲，再接種到新的PDA培養基上，重復處理直至形成形態一致的單一菌落；將純化后的菌株接入斜面試管中， 4^°C 冷藏備用。

1.2.2形態學觀察鑒定將純化后的菌株接種到PDA平板培養7d，待菌落長滿整個平板后，肉眼觀察菌落顏色和菌絲形態等特征。取少量菌絲置于光學顯微鏡下觀察菌絲稀密度及孢子形態特征等。

1.2.3分子生物學鑒定及系統發育樹構建使用真菌基因組DNA提取試劑盒（上海生物工程股份有限公司）提取菌株的基因組DNA，采用真菌通用引物ITS1（ 5^′. TCCGTAGGTGAACCTGCGG- ?3^′ ）和ITS4（ 5_-^′ TCCTCCGCTTATTGATATGC ?3^′ ）對供試菌株進行PCR擴增。反應體系（ 25μL ）： 2× PowerTaqPCRMasterMix 12.5μL ，上下游引物各 1μL ，DNA模板 1.5μL 無菌水 9μL 。反應程序： 94^°C 預變性 5min ; 94^°C 變性 30s ， 55^°C 退火 30s ， 72% 延伸 45s ，共30個循環； 72% 終延伸 5min ， 4^°C 保存。將PCR擴增產物交由武漢擎科生物科技有限公司進行測序，測序結果上傳至NCBI并通過BLAST核酸序列庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行比對分析，利用MEGA軟件構建系統發育樹，通過1000次Bootstrap重復評估節點支持率[17-18]

1.2.4致病性測定選擇長勢一致的健康煙株進行致病性測定。接種前先用 75% 乙醇對接種煙葉進行擦拭消毒處理；處理組用無菌牙簽穿刺煙葉制造傷口，然后將菌餅接種于傷口部位，對照組接種無菌PDA培養基塊；每個處理重復3次。保持各組煙株生長環境無明顯差異。每天觀察煙株發病情況，7d后記錄病斑大小和煙葉顏色。將發病葉片回收再分離，分離出的菌株通過形態學和序列分析，鑒定其與接種病原菌是否一致。

2 結果與分析

2.1病原菌形態學鑒定結果

試驗從煙草病樣中分離出一種病原菌，編號為yba，如圖1所示，其在PDA平板上的菌絲呈黃褐色，有菌核，初為白色，成熟時變為淺褐色至暗褐色，形狀不規則，無孢子，菌絲生長旺盛，有隔膜，與立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）形態一致[7.19-20]

2.2病原菌致病性測定結果

將分離的yba菌株接種于盆栽煙草葉片后，如圖2所示，接種3d后，煙草葉片出現黃褐色病斑，8d后病斑出現穿孔現象，對照組未出現病害癥狀。取發病葉片的病健交界處組織進行病原菌分離鑒定，結果發現，分離得到的菌株與接種的病原菌一致，符合柯赫氏法則，證明該菌是煙草靶斑病的致病菌。

2.3病原菌的分子生物學鑒定結果

提取菌株DNA后，針對ITS區域使用通用引物進行PCR擴增并測序，將所得序列上傳至NCBI，經BLAST比對后發現，yba菌株與絲核菌屬（Rhizo-ctonia）的遺傳進化距離最近，與立枯絲核菌AG-3的序列（登錄號：HQ241274.1）相似性為 100% ，E值為0.0。篩選同源性較高的序列，并利用MEGA軟件構建系統發育樹（圖3）后發現，該菌株與立枯絲核菌AG-3聚在同一分支。

3 討論與結論

立枯絲核菌在傳統分類中屬半知菌亞門（Deu-teromycotina）絲孢綱（Hyphomycetes）[21]，其有性態為擔子菌門亡革菌屬（Thanatephorus），最早于1904年在美國煙草根腐病中分離獲得[19]，現已廣泛分布于加拿大、澳大利亞、英國、日本和土耳其等地[22-26]。立枯絲核菌是一種土傳病原菌[27]，在田間多以無性態形式存在，屬無孢目（Agonomycetales）絲核菌屬（Rhizoctonia），不產生分生孢子，很難發現其有性態，因此形態學鑒定主要依賴菌絲和菌核特征[28]。該病菌寄主范圍廣泛，可侵染160余種植物，例如煙草（靶斑病）棉花（立枯病）大豆（根腐病）紫花苜蓿（根腐病）、水稻（紋枯病）和馬鈴薯（黑痣病）[29-34]等。然而，不同融合群寄主特異性存在差異，其中立枯絲核菌AG-3的寄主范圍相對較窄，主要侵染馬鈴薯、茄子、煙草和甜菜等作物[35-36]，在我國多地煙草產區都已發現由該菌引起的煙草靶斑病[]。植株受到立枯絲核菌AG-3侵染后，大多從底部葉片發病，嚴重時煙葉會出現大面積穿孔現象，如果不及時鑒定致病的病原菌并開展針對性防治可能導致病害大面積暴發[38-39]

本研究通過組織分離法提取了衡陽煙葉靶斑病的致病菌株（yba），經BLAST比對后發現該菌株的序列與已知菌株RhizoctoniasolaniAG-3序列具有高相似度。系統發育樹顯示，yba菌株與立枯絲核菌AG-3標準菌株聚在同一分支。因此，結合菌落形態、菌絲顯微特征以及分子生物學鑒定結果，最終確定試驗中分離得到的病原菌為立枯絲核菌AG-3。

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（責任編輯：彭靜瀾）