RNAi技術在植物寄生線蟲防控中的應用研究進展

中圖分類號：S432.45 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2025）05-0079-06

引用格式：于敬文，黃凌，趙俊麗，等.RNAi技術在植物寄生線蟲防控中的應用研究進展[J].湖南農業科學，2025（5）：79-84.DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2025.005.015

Abstract：Plant parasitic nematodes （PNs）have a wide hostrange，and seriouslyendanger therotsystem ofcrops，making theirpreventionandcontrolverydicult.RNAitechologycandown-regulatetheexpresioofkeytargetgenesofplantparasitic nematodes，whichhastheadvantagesofstrongspecificityandhighsafety.RNAi technologyhasbeen widelyused inthestudyof nematode-specificgene functionand preventionandcontroltechnologyinte processofplant-nematodeinteractions.Inthispaper， wereviewed theoriginandmechanismofRNAi techologytheselectionofRNAitarget genes inplantparasiticnematodes，andthe strategyof deliveringdsRNA topreventandcontrolplantparasitic nematodes，and exploredthe prospectofapplying RNAi inthe preventionandcontrolofplantparasiticnematodes，withtheaimofprovidinganewpreventionandcontrolstrategyofplantparasitic nematode diseases.

Key words：RNAi; plant parasitic nematodes; dsRNA delivery strategies; nematode-plant interactions; review

土壤是植物生長的主要基質，提供農業生產所需的基本營養物質和水分[]。土傳病害是指土壤中的病原細菌、真菌、線蟲、病毒等在土壤環境條件適宜時侵染植物根部或莖部引發的病害。已有研究表明，土壤傳播的害蟲和病原體（線蟲、節肢動物、真菌、卵菌、細菌等）是危害農業生產的主要因素之一[2]。據統計，在影響植物生長發育的病蟲害中，每年因土傳病害造成的作物產量損失可達 10%～ 20%^[3] 。土傳病害因為具有隱蔽性強、寄主范圍廣以及病原種類多等特點，在生產實踐中治理十分艱難。

傳統的防治方法大多是利用單一的殺線蟲劑、殺菌劑以及防治病毒的藥劑來進行防控，一方面難以達到理想的防治效果，另一方面會使病原物產生抗藥性。

植物寄生線蟲是一類在植物根部取食和繁殖的線蟲[4。目前，已經鑒定出超4100種植物寄生線蟲[5]。根據植物寄生線蟲在根系中取食位點的不同，這些線蟲可以被分為定殖型和遷移型。定殖型寄生線蟲包括根結線蟲屬（Meloidogynespp.）和孢囊線蟲屬（Heterodera和Globodera spp.），嚴重影響農業生產，每年導致的產量損失高達1570億美元[6-]。其中，根結線蟲能夠侵染2000種以上植物，對全球作物產量造成 5% 的損失[8]。植物寄生線蟲引起的癥狀包括萎蔫、黃化和發育遲緩，且常常伴隨其他病原物復合侵染作物[]

植物寄生線蟲的分子防控策略制定得益于秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans）的研究。秀麗隱桿線蟲作為首個實現基因組全序列測定及注釋的動物，對科學研究作出了重要貢獻[9-10]。基于該線蟲的基因組學研究，學者們已揭示出眾多在動物發育、免疫應答、行為調控及神經毒性反應等方面發揮關鍵作用的保守信號通路[11-2]。這些保守信號通路的存在，使得秀麗隱桿線蟲與植物寄生線蟲之間存在廣泛的基因共享。因此，相比于秀麗隱桿線蟲，植物寄生線蟲中特有的基因可能具有獨特的功能，這為制定有效的防控策略提供了潛在的靶標。

1RNAi技術及核心RNAi通路的激活機制

1.1 RNAi技術的起源

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）介導的、高度保守的基因表達調控機制，通過特異性地切割靶標信使RNA（messengerRNA，mRNA）或抑制其翻譯過程，在轉錄后水平實現對基因表達的精確調控。此機制廣泛存在于包括線蟲在內的多種真核生物中，并表現出高度的保守性。RNAi現象最初于1928年在病毒感染后恢復生長的煙草植株中被觀察到[13-14]。但直到 1998年，這一機制才在模式生物秀麗隱桿線蟲（C.elegans）中被明確解析。相比于傳統的防治方法，RNAi已被廣泛應用于基因功能分析，在真菌[15]、病毒[16-17]、節肢動物[18]以及線蟲[19]病害防治領域具有廣闊的應用前景。此外，研究表明RNAi技術還能夠用于提高植物對鹽脅迫、干旱脅迫、重金屬等非生物脅迫的耐受性[20]。

1.2核心RNAi通路的激活機制

真核細胞中的雙鏈RNA（dsRNA）可能來自入侵的病毒、人工合成的RNA雙鏈，或者轉座子產生的異常轉錄物。研究表明，dsRNA的存在會激活一個高度保守的核心機制。首先，核糖核酸酶Dicer將dsRNA切割成長度為21＼～27個核苷酸的小片段RNA雙鏈。這些較短的RNA雙鏈可以分為2種類型：一類是RNA雙鏈完全互補且來源于原始dsRNA的小干擾RNA（SmallinterferingRNA，siRNA）；另一類是由RNA雙鏈不匹配而形成的單鏈和發夾結構的微小RNA（microRNA，miRNA）。隨后，siRNA或miRNA會與Argonaute（AGO）蛋白結合，進而整合到RNA誘導的沉默復合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）中。AGO蛋白是一類龐大的蛋白家族，是組成RISCs復合物的主要成員，不僅可以結合siRNA和miRNA，還可以結合基因沉默過程中其他蛋白質。在RISC復合體加工過程中，一條RNA鏈會與mRNA形成互補鏈，而另一條鏈將被降解。最后，RISC復合體切割與引導鏈互補的靶標mRNA，并不斷降解同源的mRNA，從而阻礙靶標基因的表達。研究表明，沉默反應還可以通過RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）進一步放大，將切割的mRNA轉化為次級dsRNA，并重復上述過程，這樣RNAi引起的基因沉默效應便具有了持續性。

2 植物寄生線蟲的RNAi靶基因

線蟲中的RNAi靶基因可分為4大類：線蟲發育相關基因、線蟲繁殖相關基因、線蟲管家基因和線蟲寄生效應蛋白基因[21]

2.1 線蟲發育相關基因

在線蟲中，某些對生長發育至關重要的基因呈現出高度的保守特性，特別是在秀麗隱桿線蟲（C.elegans）中，這些基因能展現出RNAi表型。因此，在篩選植物寄生線蟲的RNAi靶標基因時，可優先選擇秀麗隱桿線蟲中已知與胚胎發育、不育或運動障礙等表型相關的同源基因序列。

線蟲幾丁質合成酶基因（chitinsynthase，CHS）是控制線蟲生長發育的關鍵基因，參與線蟲幾丁質的合成途徑。Kong等[22]利用寄主介導的基因沉默技術（HIGS）獲得了穩定遺傳的大豆孢囊線蟲幾丁質合成酶基因（SCN-CHS）沉默大豆株系，研究發現SCN-CHS沉默株系不僅能顯著降低根中孢囊和卵的數量，同時也顯著提高了大豆對根腐病病原菌尖鐮孢菌（Fusarium oxysporumf.sp.glycinces.Fo）的抗性。大豆孢囊線蟲Hg-cpn-1與秀麗隱桿線蟲胚胎發育相關基因高度同源，通過構建Hg-cpn-1基因沉默株系，發現接種線蟲后根中卵的數量顯著降低[23]。Bakhetia等[24]利用RNAi技術對南方根結線蟲中參與角質層生物合成途徑的雙氧化酶Mi-duox1進行功能研究，發現沉默調控Mi-duox1的基因后，線蟲發育遲緩且根中雌蟲數量顯著減少。同樣地，通過病毒誘導的基因沉默（VIGS）技術對南方根結線蟲胚胎發育和移動性相關的肌鈣蛋白C基因（Mi-tnc）進行功能分析，發現沉默Mi-tnc顯著影響了線蟲的孵化，這可能與線蟲的肌肉伸縮相關[25]。

2.2 線蟲繁殖相關基因

植物寄生線蟲完成其生活史的過程中，線蟲繁殖相關基因往往發揮著關鍵作用。Lilley等[2通過RNAi技術抑制了大豆孢囊線蟲繁殖相關基因Hg-amp-1的轉錄水平，并且發現采用dsRNA浸泡法處理線蟲21d后，寄生在大豆根部的雌蟲數量減少了 61% ，表明Hg-amp-1在線蟲繁殖過程中發揮著重要作用。已有研究表明，大豆孢囊線蟲精子蛋白基因Hg-msp與線蟲繁殖高度相關，利用Hg-msp的dsRNA處理二齡幼蟲后發現根內線蟲數量沒有顯著變化，但根內的雌蟲與雄蟲比例由 3：1 變為 1：1 。同時，Steeves等[27]用含有甘氨酸的精子蛋白基因Hg-msp的RNAi表達載體轉化大豆，然后接種線蟲，發現侵染后根中大豆孢囊線蟲卵的數量減少了 68% 進一步表明RNAi株系顯著降低了線蟲的繁殖能力。

2.3線蟲管家基因

線蟲管家基因通常是指一類在線蟲體內持續表達，負責維持其基本生命活動和生理功能的基因。這些基因的表達水平較為穩定，不會因線蟲的生長階段、環境條件或組織類型差異而發生顯著波動。它們對于線蟲的存活與繁衍具有關鍵作用，廣泛參與DNA復制、轉錄調控、蛋白質翻譯、能量代謝、細胞增殖及細胞結構維持等基本生命過程。Cao等[28]利用RNAi技術處理松材線蟲G蛋白偶聯受體基因Bx-srh-1后，發現線蟲在宿主中的取食速度減緩，繁殖率顯著降低。

組織蛋白酶B基因Rs-cb-1是香蕉穿孔線蟲（Radopholussimilis）中關鍵的管家基因，研究發現，用體外RNAi技術下調Rs-cb-1的表達不僅顯著抑制了香蕉穿孔線蟲的發育和孵化，而且大大降低了其致病性。同時研究發現，利用RNAi技術構建轉Rs-cb-1基因的煙草植株，其對香蕉穿孔線蟲的抗性顯著提高。這些結果表明，Rs-cb-1在線蟲的發育、孵化以及致病過程中發揮關鍵作用[29]

線蟲中核糖體蛋白（ribosomalprotein）是參與mRNA代謝的關鍵性蛋白。Alkharouf等[30]利用RNAi技術分析了大豆孢囊線蟲核糖體蛋白基因Hg-rps-23的功能，發現線蟲Hg-rps-23基因沉默后二齡幼蟲的存活率顯著降低。同樣地，Klink等[3使用3種串聯反向重復序列構建了含大豆孢囊線蟲核糖體蛋白基因Hg-rps-3a和Hg-rps-4以及大豆孢囊線蟲mRNA剪切蛋白Hg-spk-1基因沉默的轉基因大豆株系，接種線蟲后發現大豆根上發育的雌蟲減少了81%～93% 。

Dicer是將較長的雙鏈RNA前體切割為較短的RNA片段（miRNA或siRNA）的一種酶，它在基因表達調控過程中發揮著重要功能。有研究表明，南方根結線蟲中編碼Dicer酶的基因Mi-dcr-1.1參與了線蟲的正常發育過程，沉默Mi-dcr-1.1后線蟲的侵染率減少了 71% ，侵染后期雌蟲的發育也受到了顯著抑制[32]

FMRF類酰胺神經肽（FMRFamide-likeneuropep-tides，FLPs）是一類具有特定結構和功能的神經肽，參與調節線蟲多種生理和行為反應。Kimber等[33]通過RNAi技術對馬鈴薯孢囊線蟲的FLPs基因（ Gp flp-1、Gp-flp-6、Gp-flp-12、Gp-flp-14和Gp-flp-18）進行系統分析，發現沉默FLPs基因后線蟲的移動受到影響，其侵染能力也大大降低。同樣，通過構建南方根結線蟲FLPs基因（Mi-flp-14和Mi-flp-18）沉默的轉基因煙草，接種線蟲后觀察到線蟲侵染數量顯著減少[34]

2.4線蟲寄生效應蛋白基因

線蟲寄生效應蛋白基因是一類在植物寄生線蟲食道腺中特異性表達的基因，其編碼的分泌蛋白在侵染早期高表達，通過靶向調控宿主細胞免疫反應（如活性氧穩態、鈣信號通路）或參與取食位點建立，直接促進線蟲寄生。該類基因常以多拷貝家族形式存在，功能具有時空特異性。Sindhu等[35]通過HIGS技術分別靶向4個甜菜孢囊線蟲寄生效應蛋白基因（Hs-10A06、Hs-3B05、Hs-4G06和Hs-8H07），獲得了相應的轉基因擬南芥植株，研究發現RNAi株系中雌蟲數量減少了 23%～64% 。Hada等[3利用RNAi技術同時沉默南方根結線蟲食道腺分泌的效應蛋白基因（Mi-msp1、Mi-msp9、Mi-mspl6、Mi-msp40）和果膠裂解酶基因（Mi-pel1、Mi-pel2、Mi-pel3）木聚糖酶基因（Mi-xyl2）聚半乳糖醛酸酶基因（Mi-pg）以及絲氨酸蛋白酶基因（Mi-sp），體外RNAi結果表明，10個組合基因的沉默顯著影響南方根結線蟲的行為，可降低線蟲在番茄和紅豆中的吸引、侵入、發育和繁殖能力。此外，通過RNAi技術構建10個基因沉默的轉基因番茄株系，接種南方根結線蟲后發現線蟲的繁殖率降低了 87% 。

β -1，4-內切葡聚糖酶（ β. -1，4-endoglucanase）是一種能夠特異性水解 β. -1，4-糖苷鍵的酶類。已有研究表明， β. -1，4-內切葡聚糖酶基因能夠促進線蟲在寄主根組織中的侵染和遷移[37]。Chen等[38]利用RNAi技術對馬鈴薯金線蟲中的 β. -1，4-內切葡聚糖酶基因（ Gr -eng-1）進行功能研究，發現干擾后寄生在馬鈴薯根系中的線蟲數量顯著減少。值得注意的是，利用RNAi技術對大豆孢囊線蟲 β -1，4-內切葡聚糖酶基因（Hg-eng-1）進行沉默后，同樣發現大豆根系中線蟲數量顯著減少。這表明 β -1，4-內切葡聚糖酶基因在不同植物寄生線蟲中的功能具有保守性[39]。Nsengimana等[40]利用21bp的siRNA對水稻根結線蟲寄生效應蛋白基因Mg-pat-10和Mg-unc-87進行了基因特異性沉默，發現體外siRNA浸泡后的線蟲在 12h 內活性明顯減弱，其運動受到抑制。

3RNAi技術防控植物寄生線蟲的策略

3.1 傳統的dsRNA遞送

傳統的dsRNA遞送主要有4種策略：寄主誘導的基因沉默（HIGS）病毒誘導的基因沉默（VIGS）、細菌誘導的基因沉默（BIGS）以及通過葉面噴施或其他方法外源施用 dsRNA[41-42]。HIGS 技術是一種在植物中實施的策略，主要表達與病原體目的基因相匹配的RNA分子。這些RNA分子在植物細胞內被進一步加工為siRNA。一旦病原體侵染植物，siRNA能被傳遞到病原體細胞內，并精確識別及降解病原體目標基因的mRNA，進而阻礙目的基因的轉錄與翻譯過程，影響病原體的正常生長與發育，最終抑制病害的發生與蔓延。例如，Dinh等[43]利用HIGS技術靶向南方根結線蟲（M.incognita）致病因子16D10，構建能夠誘導RNAi的擬南芥轉基因植物，顯著提高植株對該線蟲的抗性。然而，鑒于轉基因作物需經過嚴格的安全性評估，HIGS策略在實際生產應用中面臨著較大的局限性。VIGS技術是一種基于植物病毒產生雙鏈RNA以快速、高效地誘導植物基因沉默的策略。煙草脆裂病毒（Tobacco rattlevirus，TRV）因其能在根結線蟲誘導的巨細胞內增殖，而被用作遞送dsRNA防控線蟲的載體。Valentine等[44]研究發現，用甜菜孢囊線蟲（Heteroderaschachtii）管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Hs-GAPDH）的TRV載體構建的轉基因擬南芥，能夠有效抑制線蟲侵染。然而，VIGS技術誘導的基因沉默時效性相對較短，這在一定程度上限制了其在長期基因功能研究領域的深入應用。BIGS技術和外施dsRNA控制線蟲的策略在田間施用過程中同樣存在上述缺陷。因此，亟需一種有效地將易降解的dsRNA分子遞送到土壤深處植株根部的策略[45]。

3.2 納米技術結合dsRNA的遞送

隨著納米技術的發展，dsRNA的生物遞送可通過納米材料實現。這些材料的結構尺寸介于 1～100nm 之間，主要包括無機納米材料（黏土納米片、金屬氧化物納米顆粒）、有機/聚合物納米材料（殼聚糖納米顆粒、聚合物納米顆粒、樹狀聚合物）、碳基納米材料（碳納米管、石墨烯等）、功能化載體（脂質體、量子點等）等[46-48]。研究表明，納米顆粒能有效促進植物對dsRNA的吸收，進而提升RNAi在抗病毒與抗昆蟲方面的效果。然而，dsRNA主要是傳遞給寄主植物，而非直接傳遞給目標害蟲。鑒于線蟲能夠通過口針或表皮吸收dsRNA，因此采用納米技術直接靶向線蟲成為一項極具潛力的防控策略。

植物病毒衍生的納米材料為納米顆粒的合成提供了新途徑。這類材料在土壤中展現出良好的穩定性，部分病毒甚至可以通過線蟲進行傳播[49-50]。基于植物病毒與線蟲的相互作用，植物病毒或其納米顆粒可用作媒介來防控植物寄生線蟲。例如，煙草輕型綠花葉病毒（Tobaccomild greenmosaicvirus，TMGMV）和紅三葉草壞死花葉病毒（Red clover necrotic mosaic virus，RCNMV）已經被用作殺線蟲劑的載體，進一步提升根部抵抗線蟲侵染的能力[51-52]。Peng等[53]利用一種陽離子星型聚合物（SPc）構建了負載氟吡菌酰胺農藥的納米劑型，體外浸泡象耳豆根結線蟲（Meloidogyneenterolobii）后，其氧化脅迫、琥珀酸脫氫酶活性以及ATP合成都受到消極影響，從而大大提升了氟吡菌酰胺對象耳豆根結線蟲的防效。此外，植物病毒納米顆粒還具有生產成本低、無毒和環境友好等優點。研究人員開發了一種TMGMV納米顆粒，能夠向線蟲遞送dsRNA，進而有效誘導靶標基因沉默[54]。結合納米技術的dsRNA遞送策略有望為植物寄生線蟲病害防控提供新的解決思路。

4展望

隨著農業生產的不斷發展，土傳病害尤其是植物寄生線蟲對農作物產量的威脅日益加劇[2。傳統的化學防治方法不僅效果不佳，還易導致病原物產生抗藥性。因此，探索新型、高效且環保的防控策略顯得尤為重要。RNAi技術作為一種新興的基因表達調控手段，在植物寄生線蟲的防控中展現出巨大的應用潛力[55]

RNAi技術通過特異性切割靶標mRNA或抑制其翻譯過程，實現對基因表達的精確調控[5。這一機制在包括線蟲在內的多種真核生物中高度保守，為利用RNAi技術防控植物寄生線蟲提供了理論依據。近年來，隨著對RNAi機制研究的不斷深入，以及納米技術等新型遞送策略的發展，RNAi技術在植物寄生線蟲防控中的應用前景愈發廣闊。傳統的dsRNA遞送策略，如寄主誘導的基因沉默（HIGS）病毒誘導的基因沉默（VIGS）等，雖然在一定程度上實現了對植物寄生線蟲的防控，但存在轉基因作物安全性評估、基因沉默時效性短以及田間施用困難等局限性。因此，亟需開發一種高效、穩定且易于施用的dsRNA遞送策略。結合納米技術的dsRNA遞送策略為這一問題提供了新的解決方案。納米材料因其獨特的物理和化學性質，在dsRNA遞送方面展現出顯著優勢。通過納米技術，可以將易降解的dsRNA分子穩定地包裹在納米顆粒中，實現dsRNA在土壤深處的有效遞送[57]。此外，納米顆粒還能促進植物對dsRNA的吸收，提高RNAi的防控效果。

納米技術介導的RNAi方法為植物寄生線蟲的防治開辟了新思路，但其伴隨的環境安全性問題同樣需要重視。在作物中瞬時表達或外源施加dsRNA時，必須全面考慮其對有益昆蟲（如蜜蜂）、牲畜及人類的安全性，仍然需要對可能受到dsRNA暴露以及人體攝入的影響進行科學評估[58]。隨著納米技術和RNAi技術的不斷發展，以及兩者在植物寄生線蟲防控中的深入應用，相信RNAi技術將成為防控植物寄生線蟲的一種重要手段。通過不斷優化dsRNA的遞送策略，提高RNAi的防控效果，有望為農業生產提供更加安全、高效且環保的病害防控解決方案，為保障全球糧食安全作出重要貢獻。

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（責任編輯：成平）